在从Melaleuca quinquenervia精油的分馏中商业回收1,8-桉叶油后，所得到的底部残余物通常被低估了其价值，尽管它可能是一种有价值的生物活性化合物的来源。在这项研究中，研究人员回收了这种残余物，并通过分子蒸馏进一步纯化以提高α-萜品醇的浓度。通过响应面方法论（RSM）系统地研究了关键的处理参数，包括压力（Pa）、蒸发器表面温度（°C）和进料流速（mL min−1），以最大化α-萜品醇的含量。最终确定的最佳条件为209.7 Pa、35.4 °C和1.39 mL min−1，导致α-萜品醇的含量达到70.97%，回收率为89.2%。GC–MS分析证实，分子蒸馏有效地浓缩了轻质组分中的α-萜品醇，而富含氧的倍半萜类化合物则富集在重质组分中。通过琼脂圆盘扩散法评估的抗菌活性表明，富含α-萜品醇的轻质组分对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有效，其效果可与氨苄青霉素相媲美。抗炎活性通过抑制LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞产生的氮氧化物得到进一步证实，同时高细胞存活率表明其具有较低的细胞毒性。这些发现表明，分子蒸馏提供了一种有效且无需使用溶剂的方法，可以可持续地将M. quinquenervia精油的底部残余物转化为生物活性组分。
引言
Melaleuca quinquenervia（Cav.）S.T. Blake，通常被称为“niaouli”，属于桃金娘科（Myrtaceae），这一植物家族主要原产于澳大利亚。在越南，该物种广泛分布于不同的生态区域，是精油工业的重要原材料。M. quinquenervia的精油主要通过蒸汽蒸馏从叶子中提取。其化学组成因地理来源和化学类型而异，已识别出两种主要的化学类型：一种是富含神经醇的类型，另一种是以1,8-桉叶油为主的类型。在越南，油中通常含有高比例的1,8-桉叶油，以及其他生物活性成分，如α-萜品醇、viridiflorol、柠檬烯、α-蒎烯和β-石竹烯。由于这种组成，niaouli精油展现了多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗氧化和驱虫作用，使其成为制药、化妆品和个人护理领域的天然成分的潜在选择。
在Melaleuca quinquenervia精油中，1,8-桉叶油是主要成分，被认为是其生物活性的主要贡献者。目前，真空分馏常用于商业分离1,8-桉叶油。分离和纯化后，留在蒸馏柱底部的重质残余物通常被丢弃或未得到利用。然而，这种残余物仍然包含几种有价值的化合物，特别是α-萜品醇，它在香料、化妆品和食品工业中发挥着重要作用。此外，α-萜品醇因其多样的生物活性而受到关注，包括抗氧化、抗炎、抗惊厥、抗癌以及特别是抗菌特性。鉴于这种残余物富含高沸点化合物，需要新的技术来分离和纯化这些成分，作为制药和化妆品工业的潜在原材料，从而提高精油的整体价值。近年来，分子蒸馏（MD）作为一种专门用于分离热敏或高沸点液体混合物的技术应运而生。MD设备的蒸发器和冷凝器之间的距离非常短——通常只有几厘米——并且在高真空条件下运行。在操作过程中，进料材料在加热的蒸发器表面形成一层薄膜，确保均匀的热传递和高效的蒸发。由于操作压力低且停留时间只有几秒，因此可以在比传统蒸馏所需的温度更低的温度下分离出挥发性成分，从而最小化热降解。分子蒸馏的分离机制不仅受沸点差异的影响，还与平均自由路径的概念密切相关，平均自由路径是指分子在碰撞改变方向或能量之前行进的平均距离。因此，蒸发器和冷凝器之间的距离被设计为与操作压力下的平均自由路径相当或更小，使挥发性分子能够直接到达冷凝表面，减少分子间的碰撞，从而提高分离效率。
在这项研究中，niaouli油残余物（NOR）是经过真空分馏后的底部组分，其中富集了高沸点的氧合萜类化合物。通过传统蒸馏（例如，即使是在减压条件下进行的分馏）来进一步回收这些化合物是低效的，因为需要较高的温度和较长的加热时间，以及相关的热降解风险。因此，分子蒸馏被用作从残余物中回收和富集氧合萜类化合物的合适技术，目标是α-萜品醇。在分子蒸馏过程中，进料物料在加热的蒸发器表面形成一层薄膜。轻质组分（LF，馏分）在距离蒸发器较近的冷却表面上冷凝，并收集在馏分接收器中，而重质组分（HF，残余物）则留在残余物瓶中（图1）。
分子蒸馏的操作原理。因此，分子蒸馏被认为是一个非平衡分离过程，其特征是加热时间短和真空水平高，这使得能够在最小化敏感成分的热降解的同时回收目标化合物。这一特点使得分子蒸馏特别有利于保持精油的质量。多项研究已经证明了分子蒸馏在纯化柠檬草、罗勒、牛至、玫瑰、葡萄柚、柑橘和迷迭香等精油方面的成功应用。分子蒸馏是一种现代分离方法，能够将精油纯化为高纯度的目标化合物，满足制药和食品工业对原材料的严格控制要求，并减少与溶剂提取方法相关的潜在毒性。然而，它仍然是一个涉及多个变量的复杂过程。尽管几十年前就已经引入，但其实际应用仍然有限，需要进一步的研究来支持其更广泛的实施。因此，本研究旨在通过应用分子蒸馏从Melaleuca quinquenervia精油的真空分馏后获得的NOR中回收和富集α-萜品醇。通过响应面方法论（RSM）系统地研究了三个关键操作参数——压力、蒸发器表面温度和进料流速——以最大化α-萜品醇的含量和回收率。此外，还通过对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗菌试验评估了TEF的生物潜力。其抗炎活性也是基于抑制LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞产生的氮氧化物来评估的，从而支持其在制药和化妆品应用中的潜力。
材料
niaouli精油由Notessen Company Limited提供，植物材料采自越南Quang Tri。首先对精油进行真空分馏以分离出目标组分1,8-桉叶油。从蒸馏柱底部收集到的niaouli油残余物（NOR）随后通过分子蒸馏进一步处理，以回收LF中的α-萜品醇（图2）。
Niaouli油残余物（NOR）。分子蒸馏系统
装置
NOR的分馏使用了一个短路径分子蒸馏（MD）系统（型号AYAN-F60，杭州Anyan Instrument Manufacturing Co., Ltd，杭州，中国），该系统配备了真空泵、蠕动进料泵和温度控制单元。蒸发器表面积为0.10 m²，冷凝器表面积为0.06 m²，蒸发器-冷凝器之间的距离为0.02 m（图3）。蒸发器表面温度由专用加热循环器控制，而冷凝器温度由制冷冷却循环器维持。进料（9）通过蠕动泵（8）以受控流速输送。操作压力由连接到压力控制单元（14）的真空泵（1）连续监测和调节（图3）。
分子蒸馏（MD）系统的示意图。操作条件和实验变量
实验在转子（擦拭器）转速为250 rpm和冷凝器温度为2 °C的条件下进行。研究了三个操作变量：绝对压力（Pa）、蒸发器表面温度（°C）和进料流速（mL min−1）。选择这些变量是因为它们直接影响蒸发通量、停留时间和成分的热稳定性。
通过GC–MS进行定性分析
NOR、LF和HF通过气相色谱-质谱（GC–MS）进行了定性分析，使用的仪器是TRACE 1310 GC与TSQ 9000 MS（Thermo Fisher Scientific，美国）。分离是在HP-5MS毛细管柱上进行的（30 m × 0.25 mm内径，0.25 µm膜厚；Agilent）。使用氦气作为载气，流速为1.2 mL min−1，分流比为1∶100。进样器和离子源温度分别设置为250 °C和230 °C。炉温从60 °C开始以3.0 °C/min的速度升高，然后以5.0 °C/min的速度升高至270 °C并保持2分钟。质谱在电子电离（EI）模式下获取，质量范围为50–550 amu，扫描速率为每秒一次。通过将其质谱与NIST 2.2和Adams库中的质谱进行比较来鉴定化合物。特别是α-萜品醇的匹配因子（MF = 905）非常高，表明光谱一致性非常好。检测到的化合物的相对组成是通过GC峰面积标准化计算的，并以百分比峰面积表示。
通过GC-FID进行定量分析
α-萜品醇的定量使用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）系统（GC-2030，Shimadzu，日本）进行，配备SH-I-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径，0.25 µm膜厚）。样品用己烷稀释100倍，以1∶100的分流模式注入。使用氮气作为载气，流速为1.2 mL min−1。进样器温度设置为250 °C。炉温从60 °C开始以3.0 °C/min的速度升高，然后以5.0 °C/min的速度升高至270 °C并保持2分钟。定量使用α-萜品醇的校准曲线进行，显示出良好的线性，回归方程为Y = 156.7X − 17934.9（其中Y表示GC峰面积，X表示α-萜品醇的浓度），决定系数（R² = 0.9996）。
通过响应面方法论（RSM）优化操作参数
使用Design-Expert软件版本13.0（Stat-Ease Inc.，明尼苏达州，美国）应用响应面方法论（RSM）来优化分子蒸馏过程的关键操作参数，目的是最大化α-萜品醇的含量。实验试验根据中央复合设计（CCD）设计，有三个独立变量。实验数据拟合为一个二阶多项式模型，响应变量Y（α-萜品醇含量，%）作为独立变量的函数表示，如下方程式（2）：
Y = α0 + α1X1 + α2X2 + α3X3 + α12X1X2 + α13X1X3 + α23X2X3 + α11X12 + α22X22 + α33X32
其中α0是截距项，α1、α2、α3、α12、α13、α23、α11、α22、α33代表Design-Expert软件估计的线性、交互作用和二次系数。
（1）真空泵；（2）真空捕集器；（3）冷凝器；（4）电机；（5）主蒸馏室（冷凝和蒸发表面）；（6）残余物收集器；（7）馏分收集器；（8）蠕动泵；（9）进料罐；（10）进料加热循环器（预热单元）；（11）冷凝器冷却循环器；（12）蒸发器表面温度控制系统；（13）冷凝器冷却循环器；（14）控制柜。
评估抗菌活性
使用琼脂圆盘扩散法（Kirby–Bauer测试）评估抗菌活性。每个琼脂平板准备了20 mL的Mueller–Hinton Agar（MHA）培养基。本研究使用了五种细菌菌株，包括金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性）、大肠杆菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌（革兰氏阴性）。细菌悬浮液调整为10^6 CFU/mL的浓度，每种悬浮液25 µL均匀分布在琼脂表面上。在接种的平板上放置无菌纸盘（直径6 mm，厚度0.5 mm），并在每个盘子上施加25 µL的测试溶液。蒸馏水被用作阴性对照，而氨苄西林（每片盘10微克）作为阳性对照。平板在37°C下培养24小时。通过测量每个盘子周围抑制区的直径来评估抗菌活性，不包括盘子的直径。所有实验都进行了三次重复。抗炎活性的评估
抗炎活性是使用脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞（RRID: CVCL_0493，ATCC，美国）来评估的。细胞在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养（Gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德），并在37°C、5% CO2的气氛中维持。然后将细胞以每孔2 × 10^4细胞的密度种入96孔板中。24小时后，细胞用不同浓度的测试样品或地塞米松（阳性对照）处理1小时，随后用LPS（1 µg/mL）刺激24小时。一氧化氮（NO）的产生是使用Loizzo等人之前描述的Griess试剂方法来确定的。简而言之，将50 µL的培养上清液与50 µL的Griess试剂在暗处混合，摇晃10分钟，然后在540 nm处测量吸光度。NO产生的抑制是根据公式（3）计算的：
细胞活力同时使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物（MTT）测定法进行评估。在测量NO后，向每个孔中加入5 µL的MTT溶液（5 mg/mL）。在37°C、5% CO2的湿润气氛中孵育3小时后，去除培养基，并将甲瓒晶体溶解在100 µL的DMSO中。在570 nm处测量吸光度，并根据公式（4）指示细胞活力：
数据统计分析
实验和分析数据使用Microsoft® Excel® 2021 MSO和IBM SPSS Statistics版本27.0.1进行统计分析。进行了一元分析（one-way ANOVA）以评估样本和处理之间的差异。当观察到显著差异时，应用Tukey的多重比较测试来确定平均值之间的差异。统计显著性定义为95%的置信水平（p < 0.05）。结果和讨论
影响轻质组分（LF）的初步影响因素研究
在这项研究中，采用了分子蒸馏法从Melaleuca quinquenervia精油真空分段蒸馏后的niaouli油残渣（NOR）中回收和富集α-terpineol。为了确保后续的优化在适当的范围内进行，首先研究了三个关键操作参数——压力、蒸发器表面温度和进料流速的影响。这一初步评估为响应面方法（RSM）优化之前定义每个参数的操作窗口提供了基础。操作压力对α-terpineol含量和回收率的影响
操作压力是分子蒸馏中的一个关键因素，因为它决定了蒸汽分子的平均自由路径，从而影响了传质效率。在较高的真空水平（即较低的操作压力）下，蒸汽分子的平均自由路径会增加。当平均自由路径与蒸发器和冷凝器表面之间的距离相当或超过时，蒸发的分子可以直接到达冷凝器表面并在轻质组分中被有效收集。因此，研究了50–250 Pa范围内的操作压力对α-terpineol在轻质组分中的富集效果（图4），同时保持其他参数不变，包括蒸发器表面温度为35°C、进料流速为1.5 mL min^-1、转子速度为250 rpm和冷凝器温度为2°C。图4
压力对α-terpineol含量和回收率的影响。不同字母的条形图在p < 0.05时具有显著性差异。最初用作进料的NOR含有32.5%的α-terpineol，这是通过GC-FID分析确定的。经过分子蒸馏后，如图4所示，随着操作压力从50 Pa升至200 Pa，α-terpineol的含量显著增加，然后在250 Pa时略有下降。在高真空条件下（50–100 Pa），蒸汽分子的平均自由路径足够长，不仅α-terpineol，而且较重的组分也能到达冷凝器，导致轻质组分中的α-terpineol浓度降低。当压力增加到100–200 Pa范围内时，分子量高于α-terpineol的较重组分不再有效地输送到冷凝器，从而导致轻质组分中α-terpineol的富集。这种行为也可以通过组分之间的挥发性差异来解释。在较低的压力下，具有较高蒸汽压的化合物更容易蒸发，并优先到达冷凝器表面。随着操作压力的增加，有效分离变得更加选择性，限制了较少挥发、分子量较高的化合物的共蒸发，从而增强了轻质组分中α-terpineol的富集。F. Chen等人（2006）在从米糠蜡中分离octacosanol时也报告了类似的趋势。基于这些观察，认为150–250 Pa的压力范围适合后续使用响应面方法进行优化。同时，α-terpineol的回收率相对较高（86.6–92.5%），并且在整个研究压力范围内几乎保持恒定，仅在较高压力（200–250 Pa）时略有下降。这表明操作压力对α-terpineol的总回收率影响有限，而对其在轻质组分中的富集影响更为显著。在从菜籽油脱臭馏分中分离生育酚的分子蒸馏中也报告了类似的观察结果，其中操作压力被证明显著影响了组分在馏分和较重组分之间的分配。为了选择后续实验的适当操作条件，固定了200 Pa的压力——在该压力下α-terpineol的含量达到了最大值（65.73%）。蒸发器表面温度对α-terpineol含量和回收率的影响
蒸发器表面温度是分子蒸馏中的一个关键参数，因为它直接影响化合物的蒸汽压，从而影响它们的蒸发倾向。在低温下，蒸发不足可能导致轻质组分中的分离不完全和回收率降低。相反，过高的温度可能会促进较重化合物的共蒸发，并增加热敏分子的热降解风险，从而降低产品纯度。在这项研究中，研究了蒸发器表面温度对轻质组分中α-terpineol含量和回收率的影响，温度范围为30–50°C。在蒸发器表面温度为30°C和35°C时，轻质组分中含有相对较高的α-terpineol（分别为65.5%和67.7%），而回收率分别为87.3%和88.9%（图5）。将温度提高到40°C时，大部分α-terpineol分子能够蒸发并冷凝，使得回收率达到最大值94.6%；然而，其他化合物的共蒸发导致α-terpineol含量降至64.5%。这一趋势在45°C和50°C时更为明显，此时回收率保持在94%以上，但轻质组分中的α-terpineol含量进一步下降到57.1%和47.8%。这些结果表明蒸发器表面温度强烈影响了回收率和纯度之间的平衡，这与Tovar等人关于柠檬草精油中富含citral组分的分馏研究结果一致。因此，选择了30–40°C的蒸发器温度范围用于后续使用响应面方法进行优化。图5
进料流速对α-terpineol含量和回收率的影响
虽然压力和温度主要决定了化合物的挥发性和热行为，但进料流速主要影响分子蒸馏过程的流体动力学条件。通过调节蒸发器表面的液膜厚度和更新，该参数影响蒸发的程度，从而影响分馏效率。为了研究这种平衡，系统地研究了1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL min^-1的进料流速对其在轻质组分中α-terpineol含量和回收率的影响。图6显示进料流速强烈影响了α-terpineol的含量和回收率。在流速为1.0 mL min^-1时，有效的蒸发导致了较高的回收率（88.9%），但由于其他挥发性化合物的共蒸发，纯度仅为适中（67.7%）。将流速增加到1.5 mL min^-1时，α-terpineol的含量最大化（70.8%），同时保持了89.3%的高回收率，表明纯度和回收率之间达到了最佳平衡。超过这一点后，更高的流速（2.0–3.0 mL min^-1）导致含量逐渐降低（66.1–53.0%），并且在3.0 mL min^-1时回收率显著下降至51.1%。这种下降可以归因于较高流速下停留时间较短和液膜较厚，这阻碍了均匀扩散并限制了蒸发器表面的热传递。与压力和温度不同，进料流速直接影响了膜流体动力学，并对分离效率产生了最显著的影响。图6
进料流速对α-terpineol含量和回收率的影响。不同字母的条形图在p < 0.05时具有显著性差异。在之前关于天然化合物分子蒸馏的研究中也报告了类似的观察结果。Ito等人（2007）证明，低进料流速结合升高的蒸发器温度增强了从大豆油脱臭馏分中去除游离脂肪酸的效果，并提高了生育酚的浓度。同样，Fregolente等人（2005）观察到过高的进料流速由于传热不足和蒸发不完全而导致单甘油酯的分离效率降低。综合这些发现，表明1–2 mL min^-1的进料流速范围是进一步优化的适当操作窗口。使用响应面方法优化蒸馏条件
尽管单因素实验提供了关于压力、蒸发器表面温度和进料流速对α-terpineol含量和回收率影响的初步理解，但这种方法没有考虑这些变量之间的潜在相互作用。实际上，操作参数是同时作用的，它们的综合效应会显著影响分离效率。为了解决这一限制，应用了响应面方法（RSM）作为统计工具来模拟变量之间的相互作用，并确定增强α-terpineol富集和回收的最佳操作条件。
轻质组分中的α-terpineol含量：使用RSM-CCD的实验设计和优化
基于初步单因素实验的结果，确定了三个影响niaouli油残渣（NOR）分子蒸馏的关键参数：绝对压力（Pa）（X1）、蒸发器表面温度（°C）（X2）和进料流速（mL min^-1）（X3）。应用了响应面方法（RSM）结合中心复合设计（CCD）来研究这些变量的交互效应，并确定轻质组分中α-terpineol富集的最佳条件。根据CCD矩阵进行了总共17次实验运行，相应的结果总结在表1中。表1
基于中心复合设计的分子蒸馏（MD）中轻质馏分中的α-萜品醇含量
编码变量
压力 X1
蒸发器表面温度 X2
进料流速 X3
α-萜品醇含量（%）
X1 (Pa)
X2 (°C)
X3 (mL min−1)
1
-1
-1
-1
150
30
1
65.92
2
1
-1
-1
250
30
1
66.22
3
-1
1
-1
150
40
1
68.35
4
1
1
-1
250
40
1
64.53
5
-1
-1
1
150
30
2
58.41
6
1
-1
1
250
30
2
68.43
7
-1
1
1
150
40
2
66.69
8
1
1
1
250
40
2
68.12
9
-1.68
0
0
116
35
1.5
59.46
10
1.68
0
0
284
35
1.5
66.17
11
0
-1.68
0
200
26.59
1.5
66.16
12
0
1.68
0
200
43.4
1.5
68.14
13
0
0
-1.68
200
35
0.66
69.88
14
0
0
1.68
200
35
2.34
66.66
15
0
0
0
200
35
1.5
70.87
16
0
0
0
200
35
1.5
70.61
17
0
0
0
200
35
1.5
70.55
初步实验确定了工艺参数的有效范围，从而缩小了实验领域，并为后续使用响应面方法（RSM）进行优化提供了基础。进行了方差分析（ANOVA）以评估二级多项式模型的适用性。该模型在统计上显著（p < 0.05），Adeq Precision 值为 15.126（>4），R2 为 0.9605，调整后的 R2 为 0.9098，表明模型拟合良好且具有足够的预测能力。在 95% 的置信水平下消除统计上不显著的项后，响应变量与自变量之间的关系由以下二级多项式方程表示。用编码变量表示的回归方程（5）：
Y = 70.67 + 1.41X1 + 0.882X2 − 1.59X1X2 +1.87X1X3 + 0.904X2X3 − 2.77X12 − 1.24X22 − 0.843X32
用实际变量表示的回归方程（6）：
Y = −54.908 + 0.582X1 + 4.375X2 − 0.006X1X2 + 0.0745X1X3 + 0.362X2X3 − 0.001X12 − 0.050X22 − 3.373X32
在研究的范围内，方程（5）和（6）表明响应变量（Y）主要受 X1（真空压力）和 X2（蒸发器表面温度）的线性项、所有三个变量（X1、X2 和 X3）的二次项以及交互项 X1X2、X1X3 和 X2X3 的影响。这些结果表明，α-萜品醇的富集取决于所有三个操作参数的综合效应，这与单因素实验中观察到的趋势一致。因此，在优化研究中将真空压力、蒸发器表面温度和进料流速作为自变量是统计学上合理的。F检验和相应的 p 值（p < 0.05）表明所开发的模型在统计上是显著的，并且能够充分描述实验数据。决定系数（R2 = 0.9605）显示，α-萜品醇含量的 96.05% 可以通过自变量的综合效应来解释，而只有 3.95% 可归因于未解释的变异性。由于 R2 单独可能高估模型性能，因此还考虑了调整后的 R2（0.9098），确认了实验值和预测值之间的良好一致性（表 2）。表 2
α-萜品醇含量的模型适用性统计
响应变量
残差方差
R2
调整后的 R2
C.V.（%）
α-萜品醇含量
1.05
0.9605
0.9098
1.57
通过 3D 响应面建模进行优化分析
响应面模型描述了在研究的实验范围内响应变量的变化，使得能够识别出最佳操作条件。压力与蒸发器表面温度、压力与进料流速以及蒸发器表面温度与进料流速之间的交互效应被发现显著影响 α-萜品醇的含量。如图 7 所示，随着操作压力从 150 Pa 升高到大约 210 Pa，α-萜品醇的含量增加，然后在更高的压力下下降。相比之下，超过 2 mL min−1 的进料流速导致响应明显减少。这些行为与单因素结果一致，可以归因于分子平均自由路径的变化、高真空条件下的化合物相互作用以及蒸发器表面上液膜均匀性的变化。
基于图 8 中显示的响应面，确定增强 α-萜品醇含量的最佳操作条件为压力 209.7 Pa、蒸发器表面温度 35.4 °C 和进料流速 1.39 mL min−1，预测值为 70.89%。为了验证模型预测，在这些条件下进行了三次实验，结果总结在表 3 中。实验获得的最大 α-萜品醇含量为 70.97%，回收率为 89.2%。实验值和预测值之间的密切一致证实了 RSM 模型的可靠性和预测能力。图 8
2D 图显示了在进料流速为 1.39 mL min−1 时压力和蒸发器表面温度对 α-萜品醇含量的影响。表 3
最佳操作条件的验证
实验结果
平均值
预测值
偏差（%）
α-萜品醇含量
70.97
70.25
70.13
70.45
70.89
0.62
总体而言，使用响应面方法（RSM）的优化确定了压力 209.7 Pa、蒸发器表面温度 35.4 °C 和进料流速 1.39 mL min−1 作为分子蒸馏 Melaleuca quinquenervia 精油残留物的最佳操作条件。在这些条件下，轻质馏分中的 α-萜品醇含量达到了 70.97%，回收率为 89.2%，与初步单因素实验获得的结果相比有显著提高。尽管优化过程需要精确控制操作参数，但它能够更有效地分离并提高 α-萜品醇的富集度，从而突出了 RSM 作为工艺优化工具的有效性。这些结果表明，将分子蒸馏与统计优化相结合为从精油残留物中富集热敏性氧合萜类化合物提供了一种有效的方法。这类化合物通常具有相对较高的沸点，在传统蒸馏条件下容易发生热降解。因此，在高真空和短停留时间内进行的分子蒸馏为它们的选择性富集提供了有利条件。更广泛地说，这种方法可能适用于回收和富集其他具有类似物理化学性质的高价值天然化合物，特别是精油残留物和相关天然混合物中的高沸点生物活性成分。此外，该过程还具有环保优势，因为它避免使用液-液提取、色谱分离或结晶过程中通常需要的有机溶剂。此外，本研究中使用的相对较低的操作温度（35.4 °C）可能有助于降低大规模操作期间的能耗。
在 RSM 优化之后，比较了 NOR 及相应的轻质和重质馏分的化学组成，以阐明分子蒸馏过程中的组分分布。如表 4 和图 9 所示，经过真空分馏回收的 NOR 中仅含有相对较低水平的桉叶油醇（6.93%），表明大部分这种轻质组分已在上游过程中被去除。一致地，轻质单萜类化合物大量减少，仅检测到微量的柠檬烯（0.38%）。相比之下，具有较高沸点的氧合单萜类化合物仍然保持在相当的水平，其中 α-萜品醇占 36.52%，表明 NOR 是回收生物价值化合物的有希望的来源。此外，NOR 还含有大量的倍半萜类和氧合倍半萜类化合物，包括 β-石楠烯、α-侧柏烯、β-芹烯、桉叶油醇和桉叶油醇。表 4
NOR 和 MD 馏分的化学组成
停留时间（分钟）
化合物
保留指数
百分比（%）
NOR
LF
HF
单萜类
1
8.085
d-柠檬烯
1031
0.38
0.41
0.28
氧合单萜类
2
8.202
桉叶油醇
1032
6.93
6.65
—
3
10.091
萜品烯
1088
0.29
0.23
—
4
10.676
芳樟醇
1099
6.17
5.13
0.84
5
13.518
δ-萜品醇
1166
0.94
1.01
0.28
6
13.936
萜品-4-醇
1177
2.94
3.13
0.62
7
14.588
α-萜品醇
1189
36.52
66.10
19.54
8
16.945
橙花醇
1222
0.83
0.51
0.27
9
19.001
香叶醇
1253
1.57
0.53
0.29
倍半萜类
10
21.81
依兰烯
1372
0.83
0.91
0.43
11
22.09
莰烯
1376
0.50
0.49
0.29
12
22.31
香叶醇醋酸酯
1381
0.33
0.39
—
13
22.696
β-石楠烯
1391
0.19
0.32
—
14
23.866
β-石楠烯
1419
6.81
3.86
4.52
15
24.317
γ-石楠烯
1433
0.26
0.11
0.10
16
24.551
α-蒎烯
1439
0.31
0.16
17
25.036
β-蒎烯
1445
0.97
0.21
0.19
18
25.337
α-侧柏烯
1454
5.21
2.69
4.73
19
26.223
帕丘伦
1467
1.04
0.61
1.74
20
26.34
α-无定形烯
1483
1.53
1.87
2.26
21
26.691
β-芹烯
1486
5.56
1.05
7.31
22
26.992
α-芹烯
1494
3.29
1.02
5.33
23
27.293
δ-蒎烯
1524
1.58
0.11
3.07
24
27.895
塞琳-3,7(11)-二烯
1542
0.57
0.10
1.75
25
28.58
葵醛-3,9-二烯
1556
0.55
0.10
2.02
氧合倍半萜类
26
30.954
桉叶油醇
1596
3.04
—
27
32.224
γ-桉叶油醇
1626
2.07
—
28
33.11
β-桉叶油醇
1649
3.84
—
29
33.495
布尔内索尔
1667
0.88
—
39.5
总鉴定组分
95.93
97.70
图 9
GC–MS 色谱图显示了 MD 后获得的 NOR、HF 和 LF。分子蒸馏导致轻质馏分中的 α-萜品醇显著富集，从尼亚乌利油残留物中的 36.52% 增加到 66.10%。然而，由于氧合单萜类化合物的沸点接近，大多数这些化合物共同蒸馏到了 LF 中，从而限制了 MD 对它们的完全分离选择性。在这一馏分中仅检测到微量的倍半萜类化合物，几乎没有氧合倍半萜类化合物，这与预期的基于挥发性的分离行为一致。这些趋势进一步得到了 GC–MS 色谱图（图 9）的支持，在该图中，α-萜品醇作为主要峰出现于大约 14.6 分钟处，伴随着早期洗脱的单萜类化合物和几个低强度的倍半萜类峰在较长的保留时间。相比之下，重质馏分主要由高沸点的倍半萜类和氧合倍半萜类化合物主导，特别是桉叶油醇、桉叶油醇和布尔内索尔——这些化合物具有高生物价值并具有特征性的木质香气。这种分布与 GC–MS 色谱图（图 9）一致，后者在 30–35 分钟保留时间区域显示出强烈的峰，这是氧合倍半萜类的典型特征。HF 也保留了 19.64% 的 α-萜品醇，可能是由于残留物的高粘度阻碍了有效蒸发，导致这种相对易挥发的化合物部分保留。总体而言，这些结果表明分子蒸馏有效地在轻质馏分中富集了 α-萜品醇，同时在重质馏分中浓缩了有价值的氧合倍半萜类化合物，证实了该技术用于选择性回收 NOR 中功能性化合物的潜力。
抗菌活性的评估
评估了富集了 α-萜品醇的轻质馏分的抗菌活性，以检验其生物潜力。该馏分来源于尼亚乌利油残留物（NOR），其中富含 α-萜品醇，已知具有抗菌活性。琼脂碟扩散试验（表 5）显示，所有测试样品——包括 NOR、纯 α-萜品醇、LF 和作为阳性对照的氨苄西林——都对五种细菌菌株（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌）表现出抑制作用。其中，纯 α-萜品醇表现出最强的抗菌活性，特别是对金黄色葡萄球菌（21.85 mm）和肺炎克雷伯菌（20.16 mm）。富集了 α-萜品醇的轻质馏分也显示出显著的抗菌效果，特别是对常与多重耐药性相关的铜绿假单胞菌。然而，对于某些菌株（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌），LF 的抑制效果低于纯 α-萜品醇，表明抗菌活性与 α-萜品醇浓度之间存在密切关系。重要的是，LF 表现出显著更高的抗菌活性，且在某些情况下，其抑制区与氨苄西林相当，突显了分子蒸馏在生产生物活性精油馏分方面的实际价值。表5
不同组分精油样品对病原微生物的抑制圈直径
抑制圈直径（毫米）
氨苄西林
NOR
α-萜品醇
LF
金黄色葡萄球菌
17.63 ± 0.42
15.41 ± 0.15
21.85 ± 0.05
15.47 ± 0.07
大肠杆菌
15.75 ± 0.09
18.55 ± 0.46
16.54 ± 0.25
16.09 ± 0.50
副溶血性弧菌
15.41 ± 0.36
13.24 ± 0.20
15.05 ± 0.39
15.42 ± 0.18
肺炎克雷伯菌
25.18 ± 0.32
15.44 ± 0.48
20.16 ± 0.04
19.68 ± 0.18
铜绿假单胞菌
20.98 ± 0.61
8.46 ± 0.37
10.72 ± 0.15
11.79 ± 0.10
抗炎活性评估
所有样品的NO抑制效果均呈浓度依赖性增强。抗炎活性以IC50值表示，在不同样品间存在显著差异（见表6）。在所有样品中，纯α-萜品醇表现出最强的抗炎活性，其IC50值为41.84 ± 1.39 µg/mL，证实了其作为主要活性成分的作用。相比之下，尼欧利油残余物（NOR）的活性最弱，IC50值为329.16 ± 7.29 µg/mL。
测试样品的NO抑制百分比（%）和IC50（µg/mL）
样品
不同浓度下的NO抑制百分比（µg/mL）
IC50值
50
100
150
200
400
600
800
1000
NOR
16.26 ± 0.61
26.17 ± 0.87
32.72 ± 0.81
41.53 ± 0.63
51.2 ± 0.07
58.52 ± 0.12
67.39 ± 0.64
76.01 ± 0.39
329.16 ± 7.29
LF
37.59 ± 0.45
41.4 ± 0.69
51.45 ± 1.46
58.64 ± 1.24
67.27 ± 0.17
69.08 ± 0.43
73.03 ± 0.29
81.33 ± 0.09
135.01 ± 4.51
HF
31.02 ± 1.07
37.07 ± 0.22
44.39 ± 0.16
57.49 ± 0.13
64.09 ± 0.46
80.1 ± 0.38
81.98 ± 0.21
85.23 ± 0.72
161.23 ± 3.10
α-萜品醇
52.49 ± 0.35
59.75 ± 0.73
65.97 ± 0.35
73.75 ± 0.04
81.79 ± 0.39
84.38 ± 0.31
85.68 ± 0.13
86.71 ± 0.1
41.84 ± 1.39
a
浓度（µg/mL）。分子蒸馏显著增强了残余物的抗炎效果，这体现在重质组分（HF；IC50 = 161.23 ± 3.10 µg/mL）以及富含α-萜品醇的轻质组分（LF）上，后者的IC50值较低，为135.01 ± 4.51 µg/mL。LF相比NOR和HF具有更强的抗炎活性，这与其较高的α-萜品醇含量一致。总体而言，这些结果表明分子蒸馏通过将α-萜品醇浓缩到生物活性组分中，有效增强了尼欧利油残余物的抗炎潜力。α-萜品醇富集组分的抗炎活性可以基于先前关于α-萜品醇的机制研究进行解释。分子对接研究表明，α-萜品醇可以通过氢键和酶活性位点内的空间相互作用直接与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）相互作用。特别是，α-萜品醇的羟基已被报道可以与iNOS的THR324残基形成氢键，这可能有助于抑制一氧化氮的生成。这种相互作用可能部分解释了富含α-萜品醇的LF组分观察到的更强NO抑制活性。
轻质组分不仅表现出比其他组分更强的活性，而且含有高比例的α-萜品醇，接近纯化合物的纯度。除了抗炎效果外，LF还表现出高生物相容性，在所有组分中显示出最高的细胞存活率（从68.58 ± 0.27到103.87 ± 0.97），甚至在低浓度（25–100 µg/mL）下还表现出促进细胞增殖的趋势。值得注意的是，在IC50水平下，所有样品的细胞存活率均保持在70%以上（表7），表明观察到的抗炎效果是在没有显著细胞毒性的情况下实现的。这些结果证实，通过分子蒸馏富集α-萜品醇显著增强了精制组分的抗炎潜力。
表7
抗炎处理后样品的细胞存活率%
样品
不同浓度下的细胞存活率（µg/mL）
α-萜品醇
100 ± 1
94.6 ± 0.48
89.63 ± 0.42
86.17 ± 0.72
79.44 ± 0.25
78.17 ± 0.16
68.25 ± 0.14
61.74 ± 0.49
55.24 ± 0.36
NOR
—
96.47 ± 0.37
90.8 ± 0.44
86.05 ± 0.47
79.77 ± 0.3
72.88 ± 0.73
67.92 ± 0.26
60.81 ± 0.19
56.78 ± 0.51
HF
—
89.2 ± 0.53
84.23 ± 0.08
77.68 ± 0.76
75.31 ± 0.81
67.48 ± 0.59
63.01 ± 0.4
59.37 ± 0.32
54.79 ± 0.32
LF
—
103.87 ± 0.97
97.14 ± 0.96
92.01 ± 0.85
87.22 ± 1.31
81.32 ± 1.22
78.12 ± 0.61
73.16 ± 0.51
68.58 ± 0.27
结论
本研究展示了Melaleuca quinquenervia精油残余物作为α-萜品醇的宝贵来源的潜力，表明分子蒸馏能够有效地将未充分利用的副产品转化为生物活性组分。通过集成响应面方法，建立了一种系统优化策略，以最大化α-萜品醇的富集和回收率。结果证实了分子蒸馏不仅作为一种分离方法的有效性，而且作为一种将精油残余物升级为增值资源的实用手段。此外，所提出的策略为各种精油中高沸点化合物的可持续增值提供了可行的方法。
作者贡献
Dinh-Nhat Do、Minh-Tinh Trinh-Le和Hoang-Yen Nguyen-Thi进行了实验和数据分析。Minh-Chau Pham-Vu修订和完善了手稿，并协调了提交流程。Tan-Viet Tran和Xuan-Tien Le提供了概念指导和监督，最终由Xuan-Tien Le进行了审阅和批准。
利益冲突
没有需要声明的利益冲突。
数据可用性
支持本研究发现的数据可在文章中找到。
致谢
我们感谢胡志明工业大学（HCMUT）、VNU-HCM和Nguyen Tat Thanh大学对这项研究的支持。
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