由耐药微生物引起的伤口和器械相关感染是全球主要的健康问题，增加了发病率、死亡率和经济负担。因此，抗菌纳米纤维支架作为一种能够降低感染风险的伤口敷料受到了关注。在这项研究中，开发了含有银-铁双金属纳米颗粒（Ag–FeNPs）的明胶/壳聚糖（GEL/CTS）纳米纤维支架，这些纳米颗粒是通过使用贯叶连翘（H. perforatum）叶提取物通过绿色合成方法制备的。Ag–FeNPs在室温下制备，并通过不同的分析技术进行了表征。微观结构分析证实，这些生物生成的纳米颗粒呈球形，平均大小为60.98 ± 18.09纳米，并且均匀分布在GEL/CTS纤维中。随后，将不同Ag:Fe比例的Ag–FeNPs嵌入聚合物基质中，以增强支架的润湿性和抗菌性能。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）和接触角测量（WCA）表明，加入CTS和Ag–FeNPs后纤维直径减小（171.47 ± 55.96纳米），并且亲水性得到改善，其中GEL/CTS/Ag–Fe（2:1）配方的WCA值最低（60.72°）。针对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）进行的抗菌测试显示，绿色合成的Ag–FeNPs对这两种菌株都有效，对E. coli的抑制作用更强。在所有纳米纤维支架中，含有最高Ag含量的样品显示出最显著的细菌菌落形成减少效果。总体而言，这些发现表明，添加了Ag–FeNPs的GEL/CTS支架具有优良的结构和生物学特性，这突显了它们作为伤口敷料等应用中有效抗菌材料的潜力。
1. 引言
纳米材料的尺寸范围在1到100纳米之间，由于其较高的表面积与体积比，在各种应用中占据了重要地位。由于其独特的物理、化学和催化特性，纳米材料已成为现代纳米技术中最有趣和最重要的研究领域之一。金属纳米颗粒在各个应用领域中尤为突出。绿色合成方法使用生物材料，特别是植物提取物，最近作为一种替代传统物理和化学方法来合成金属纳米颗粒的方法而受到欢迎。与化学合成相比，生物方法减少了有毒物质的使用，提供了更环保的替代方案。在纳米颗粒中，银纳米颗粒（AgNPs）因其强大的生物功能（如抗菌、抗氧化和细胞毒性作用）而成为研究最深入的纳米材料之一。值得注意的是，通过绿色合成方法制备的AgNPs由于其增强的生物相容性，在生物应用中特别具有优势。另一方面，铁纳米颗粒（FeNPs）以其生物相容性、低毒性和高催化效率以及超顺磁性而著称。新兴的研究越来越多地关注双金属纳米颗粒（BMNPs）作为其单金属对应物的先进替代品。虽然BMNPs是通过传统的自上而下的方法制备的，但它们由于协同效应而提供了更优越的功能。这种协同作用使得可以精细调节物理化学性质，包括提高表面反应性、增强稳定性和优化生物相容性，从而拓宽了它们的应用潜力。
近年来，纳米纤维因其相较于传统纤维结构的非凡特性而受到了广泛关注。作为一类重要的纳米材料，纳米纤维表现出优异的特性，如高表面积与体积比、低密度、高达90%的独特孔隙率以及化学功能化的可行性。这些独特的物理化学特性为许多生物医学应用提供了巨大潜力，特别是在组织工程、药物递送和生物传感器领域。尽管存在多种纳米纤维制备技术，但静电纺丝被认为是最通用、最直接且最具成本效益的方法。在标准的静电纺丝装置中，液体喷射通过电场从泰勒锥体中喷出，随后被拉伸并固化成纤维。纳米纤维的生产效率受到材料性质（如导电性和浓度）以及加工参数（包括电压、流速和喷头到收集器的距离）的显著影响。
基于生物的聚合物材料因其环境友好性、可再生性和固有的生物降解性而成为近期研究的重点。在这方面，壳聚糖作为一种最常见的天然聚合物受到了广泛关注。壳聚糖主要来源于甲壳类动物、昆虫和真菌，通过化学或酶法脱乙酰化可以得到壳聚糖，这是一种在生物医学领域广泛使用的衍生物。基于壳聚糖的生物纳米复合材料在组织工程、药物递送和伤口/烧伤敷料中得到广泛应用，因为它们具有生物相容性、无毒性和多功能性。此外，壳聚糖在食品工业中还用作抗菌包装剂和乳化剂；这些功能归因于其分子结构中同时存在亲水性和疏水性基团。除了壳聚糖（CTS）外，明胶（GEL）也在生物医学应用中得到广泛应用。作为一种获得FDA批准的天然聚合物，明胶具有高生物相容性、生物降解性和亲水性，同时表现出低免疫原性和最小的毒性。明胶通过胶原蛋白的水解制备，其表面上的功能基团使其易于修改，其结构支持细胞增殖和流体扩散。将抗菌壳聚糖与细胞粘附性明胶结合，为组织工程支架提供了一个出色的复合平台。这一点尤为重要，因为材料在生物医学环境中的有效性在很大程度上取决于它们模仿天然细胞外基质（ECM）的能力。
在本研究中，使用贯叶连翘提取物作为还原剂和稳定剂，通过绿色化学方法合成了双金属Ag–FeNPs。贯叶连翘是一种众所周知具有抗菌、抗氧化和抗炎活性的药用植物，这些特性与伤口愈合和感染控制应用密切相关。贯叶连翘的选择基于其已建立的生物医学相关性和多功能生物活性。使用不同Ag:Fe摩尔比的贯叶连翘提取物合成的纳米颗粒随后被嵌入通过静电纺丝制备的GEL/CTS纳米纤维支架中。尽管之前已有报道单独的Ag或FeNPs的抗菌活性，但将不同Ag:Fe比例的双金属Ag–FeNPs加入GEL/CTS纳米纤维对抗菌性能的影响仍很大程度上未被探索。整合Ag–FeNPs的目的是为了增强支架的表面润湿性和协同抗菌性能。为了评估双金属组成对最终复合材料的影响，对纳米颗粒和负载纳米颗粒的纳米纤维垫进行了表征。使用不同的分析技术系统地分析了其结构、形态和物理化学性质。此外，还评估了单个纳米颗粒和所得复合支架对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果，为生物聚合物纳米纤维支架在抗菌应用中的合理设计提供了新的见解。
2. 实验部分
2.1. 材料
本研究的生物聚合物基质由B型明胶（来自牛皮，约75 Bloom，Sigma-Aldrich，美国）和中分子量壳聚糖（Mw = 300,000 g mol−1，脱乙酰化程度>75%，Sigma-Aldrich）组成。硝酸银（AgNO3，Sigma-Aldrich）和硝酸铁（Fe(NO3)3，Sigma-Aldrich）作为银和铁的盐，用于合成抗菌双金属纳米材料。醋酸（AC，Merck）和乙醇（Eth，Sigma-Aldrich）被用作溶剂。柠檬酸（CA，Merck）被用作交联剂。所有化学品均为分析级，并按接收时的状态使用。
2.2. 植物提取物的制备
新鲜风干的贯叶连翘叶片用双蒸馏水多次冲洗，以去除附着的灰尘和表面杂质。然后将清洗后的叶片在室温下干燥，直到所有残留水分完全蒸发。干燥后的叶片被细磨成均匀的粉末。将6克这种粉末浸入240毫升热水中，并在80°C下持续磁力搅拌2小时，以有效提取植物成分。所得悬浮液静置过夜以促进完全提取，然后通过Whatman No. 1滤纸过滤。获得的滤液代表贯叶连翘的水提取物，在4°C下避光保存。
2.3. 银-铁双金属纳米颗粒的生物合成
首先，使用表1中列出的特定摩尔比，用1 M AgNO3和1 M Fe(NO3)3储备溶液配制Ag–Fe前体溶液。将所得混合物磁力搅拌60分钟，以确保均匀混合。随后，在持续搅拌条件下逐渐加入60毫升新鲜制备的贯叶连翘提取物，保持大约2小时以促进纳米颗粒的成核和生长。表1显示了合成Ag–Fe NP样品的组成。
2.4. 生物聚合物纳米纤维的制备
根据各自的静电纺丝溶液制备了由GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe NPs组成的生物聚合物纳米纤维支架。首先，在50%（v/v）醋酸（AC）溶剂系统中制备15%（w/v）的纯GEL溶液，并在45°C下连续搅拌1小时，然后在室温下磁力搅拌24小时以获得均匀溶液。为了制备GEL/CTS纳米纤维，首先分别配制GEL和CTS溶液。CTS溶液（0.01 g mL−1）通过在45°C下剧烈磁力搅拌4小时将壳聚糖溶解在50%（v/v）醋酸水溶液中制备。GEL溶液（0.1 g mL−1）在相同的实验条件下配制。随后，将两种溶液以1:1（v/v）的比例混合，并通过连续搅拌48小时以确保形成均匀的GEL/CTS前体混合物。为了合成GEL/CTS/Ag–Fe NPs纳米纤维支架，将预先制备的GEL/CTS溶液与不同Ag和Fe组成的Ag–Fe NPs混合，其浓度相对于总聚合物重量为5 wt%。首先将Ag–Fe NPs悬浮液分散在AC-水二元溶剂系统中，并超声处理60分钟以实现均匀分散并防止聚集。然后将这些纳米颗粒悬浮液加入GEL/CTS基质中，并磁力搅拌48小时以确保完全均匀。所得静电纺丝溶液转移到装有钝21G不锈钢针头的5毫升注射器中，并安装在注射泵上。使用Inovenso自上而下的静电纺丝系统进行静电纺丝，优化工艺参数为：施加电压20 kV，进料速率0.5 mL h−1，喷头到收集器的距离10厘米。制备的生物聚合物纳米纤维的组成总结在表2中。
2.4. 制备生物聚合物纳米纤维支架
首先，在50%（v/v）醋酸溶液中制备15%（w/v）的纯GEL溶液，并在45°C下连续搅拌1小时，然后在室温下磁力搅拌24小时以获得均匀溶液。为了制备GEL/CTS纳米纤维，首先分别配制GEL和CTS溶液。CTS溶液（0.01 g mL−1）通过在45°C下剧烈磁力搅拌4小时将壳聚糖溶解在50%（v/v）醋酸水溶液中制备。GEL溶液（0.1 g mL−1）在相同的实验条件下配制。随后，将两种溶液以1:1（v/v）的比例混合，并通过连续搅拌48小时以确保形成均匀的GEL/CTS前体混合物。为了合成GEL/CTS/Ag–Fe NPs纳米纤维支架，将制备好的GEL/CTS溶液与不同Ag和Fe组成的Ag–Fe NPs混合，其浓度相对于总聚合物重量为5 wt%。首先将Ag–Fe NPs悬浮液分散在AC-水二元溶剂系统中，并超声处理60分钟以实现均匀分散并防止聚集。然后将这些纳米颗粒悬浮液加入GEL/CTS基质中，并磁力搅拌48小时以确保完全均匀。所得静电纺丝溶液转移到装有钝21G不锈钢针头的5毫升注射器中，并安装在注射泵上。使用Inovenso自上而下的静电纺丝系统进行静电纺丝，优化工艺参数为：施加电压20 kV，进料速率0.5 mL h−1，喷头到收集器的距离10厘米。表2总结了制备的生物聚合物纳米纤维的组成。
2.4. 制备生物聚合物纳米纤维支架
静电纺丝后，所得纳米纤维垫在37°C的真空烤箱中过夜干燥以去除残留溶剂。图2展示了GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维的制备过程示意图。图2
(a) Ag–FeNPs和(b) GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架的制备过程示意图。
2.5 纳米颗粒和纳米纤维支架样品的表征
使用先进的分析技术组合对合成的纳米颗粒和静电纺丝纳米纤维支架的形态特征和化学成分进行了表征。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱是用Shimadzu IR Prestige-21光谱仪获得的，而光吸收分析则是用Shimadzu UV-1700 UV-vis分光光度计进行的。纳米纤维的表面形态和结构完整性通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM；Zeiss SEM 500）进行了检查。纳米颗粒的晶相是通过X射线衍射（XRD；PANalytical Empyrean）分析的，该仪器配备了Cu Kα辐射（λ = 1.54 Å，40 kV），衍射角（2θ）范围为5°–80°。Ag晶粒的平均尺寸是根据Ag(111)反射使用Scherrer方程估算的。Ag–FeNPs的详细形态和颗粒大小进一步通过透射电子显微镜（TEM；JEOL JEM-2100）进行了探索。Ag–FeNPs的颗粒大小分布和GEL/CTS/Ag–Fe支架的纤维直径测量是使用ImageJ软件定量分析的。为了评估静电纺丝支架的润湿性能，在室温下使用接触角测量仪（Biolin Scientific Attension，Theta Lite）进行了静态水接触角（WCA）测量。对于每个样品，将4 µL的蒸馏水轻轻放置在纳米纤维表面上，并记录了六次重复测量以确定平均WCA值。
2.6 Ag–FeNPs和支架样品的抗菌活性测试
使用琼脂孔扩散法评估了合成纳米颗粒的抗菌效果。作为模型微生物，使用了革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）和革兰氏阴性大肠杆菌（ATCC 25922）。最初，将冻干培养物接种到含有20%甘醇的营养肉汤（NB）中以制备储备培养物，并将其储存在−18 °C以保持活力。在实验中，将储备培养物中的菌落转移到新鲜的NB中，并在35 °C下孵育过夜。制备细菌悬浮液并调整至0.5 McFarland浊度标准。调整后，将这些培养物均匀涂抹在Mueller–Hinton琼脂（MHA）平板上。然后，在琼脂介质中精确切割出孔洞。随后，在每个孔洞中加入100 µL的纳米颗粒悬浮液，并在超声处理30分钟后以确保均匀分散。然后将平板在37 °C下孵育16小时以允许细菌生长。孵育期后，测量孔洞周围的抑制区直径（以毫米为单位）以确定抗菌活性。所有程序都进行了三次重复。通过肉汤微稀释法评估了生物合成的AgNPs的抗菌活性。为了确定最小抑制浓度（MIC），在含有Mueller–Hinton肉汤（MHB）的96孔微孔板中准备了AgNPs，浓度范围为0.78–200 µg/mL。每个孔洞接种了105–106 CFU/mL的目标细菌。在35 °C下孵育24小时后，使用微孔板读数器在600 nm处测量吸光度来量化细菌生长。通过监测液体介质中的光密度（O.D.）变化来评估纳米纤维垫对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌性能。每个重20 mg的纳米纤维垫暴露于初始O.D.为0.17的5 mL NB细菌悬浮液中。然后在37 °C下的摇摆培养箱中孵育6小时以促进纤维与细菌之间的相互作用。孵育期后，使用分光光度计在600 nm处测量细菌悬浮液的O.D.以量化生长抑制。所有测量都进行了三次重复，结果记录为平均值。
2.7 统计分析
使用单因素方差分析（ANOVA）对定量数据进行了统计分析。所有值均以平均值±标准差表示，统计显著性在p < 0.05时被接受。
3. 结果与讨论
3.1 绿色合成的Ag–FeNPs的表征
使用H. perforatum提取物绿色合成的Ag–FeNPs通过各种分析技术进行了表征。使用UV-vis分光光度计记录了Ag–FeNP溶液和H. perforatum提取物的吸光光谱，所有样品的结果图显示在图3中。对于合成的AgNPs，观察到一个在447 nm处有最大峰值的宽吸收带（图3a）。AgNPs的特征表面等离子体共振（SPR）峰的出现与早期研究结果一致，证实了银纳米颗粒的成功形成。在FeNPs和Ag–FeNPs的情况下，观察到了在356 nm和300 nm处的明显吸收峰，这些峰对应于金属铁（图3a）。这些峰可能与Fe残留物和铁的集体表面等离子体振荡有关。在之前的研究中，FT-IR光谱中也报告了FeNPs中存在这样的SPR带。
图4展示了使用H. perforatum叶提取物合成的生物源Ag、Fe和Ag–FeNPs的FT-IR光谱，以及提取物本身的光谱。FT-IR谱图证实了从叶子中提取的生物活性化合物的存在，这些化合物负责还原Ag+和Fe3+离子，并随后附着在纳米颗粒表面。先前的研究报道，植物来源的黄酮类化合物和生物黄酮衍生物在O–H伸缩区域、脂肪族C–H振动和芳香环模式中显示出特征性的红外信号。在本研究中，纳米颗粒的FT-IR光谱显示了在3293、2918、2858、2356、1727、1602、1022、670和594 cm−1处的吸收带。3700–3000 cm−1区域的宽带对应于羟基团的O–H伸缩振动。在2918、2858和2356 cm−1处观察到的峰归因于脂肪族C–H伸缩振动，而在1727、1602和1022 cm−1处的带与CO伸缩模式相关。最后，670 cm−1处的带归因于C–O伸缩。H. perforatum提取物的FT-IR光谱与之前的研究结果非常相似。
图4展示了使用H. perforatum叶提取物合成的生物源Ag、Fe和Ag–FeNPs的FT-IR光谱，以及提取物本身的光谱。FT-IR谱图证实了从叶子中提取的生物活性化合物的存在，这些化合物负责还原Ag+和Fe3+离子，并随后附着在纳米颗粒表面。先前的研究报道，植物来源的黄酮类化合物和生物黄酮衍生物在O–H伸缩区域、脂肪族C–H振动和芳香环模式中显示出特征性的红外信号。在本研究中，纳米颗粒的FT-IR光谱显示了在3293、2918、2858、2356、1727、1602、1022、670和594 cm−1处的吸收带。3700–3000 cm−1区域的宽带对应于羟基团的O–H伸缩振动。在2918、2858和2356 cm−1处观察到的峰归因于脂肪族C–H伸缩振动，而在1727、1602和1022 cm−1处的带与CO伸缩模式相关。最后，670 cm−1处的带归因于C–O伸缩。H. perforatum提取物的FT-IR光谱与之前的研究结果非常相似。
图4展示了使用H. perforatum叶提取物合成的生物源Ag、Fe和Ag–FeNPs的FT-IR光谱。在生物合成Ag、Fe和Ag–FeNPs之后，与原始提取物相比，吸收峰的强度明显减弱。这种减弱表明纳米颗粒被提取物覆盖，金属离子被还原，以及纳米颗粒在合成过程中的稳定。根据几项研究，这些还原和稳定性质归因于H. perforatum提取物中存在的多酚化合物，如黄酮类化合物和酚酸。
X射线衍射（XRD）分析用于确定绿色合成纳米颗粒的晶体结构。使用H. perforatum提取物合成的Ag、Fe和Ag–FeNPs的XRD图案显示在图5中。对于AgNPs，在2θ值为38.36°、44.34°、64.63°和77.52°处观察到了强烈的衍射峰，分别对应于面心立方（fcc）Ag的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS卡片编号04-0783）。根据Scherrer方程从Ag(111)反射估算的Ag晶粒的平均尺寸约为9 nm，表明是纳米级的相干晶体Ag晶粒，而不是整个颗粒的大小。
图5展示了使用H. perforatum提取物合成的Ag、Fe和Ag–FeNPs的XRD图案。对于AgNPs，在2θ值为38.36°、44.34°、64.63°和77.52°处观察到了强烈的衍射峰，分别对应于面心立方（fcc）Ag的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS卡片编号04-0783）。根据标准参考数据（JCPDS卡片编号04-0783），Ag晶粒的平均尺寸是通过Scherrer方程估算的，约为9 nm，表明是纳米级的相干晶体Ag晶粒，而不是整个颗粒的大小。
图5展示了不同Ag:Fe摩尔比的AgNPs、FeNPs和Ag–FeNPs的XRD图案。Ag的特征衍射峰根据标准参考数据（JCPDS卡片编号04-0783）被索引到面心立方（fcc）Ag结构。相比之下，FeNPs的XRD图案没有显示出明显的尖锐衍射峰，表明结晶度较低或结构状态高度分散，而不是明确的晶体相。这种行为与之前关于通过绿色路线合成的FeNPs的报告一致。
在Ag–Fe（2:1）纳米颗粒系统中，仍然可以辨别出对应于Ag(111)平面的衍射特征；然而，其强度和信噪比与AgNPs相比显著降低。因此，使用Scherrer方程进行可靠的晶粒尺寸估算对于这个样品是不可行的。从定量角度来看，Ag相关衍射信号的减弱表明在Fe掺入Ag基系统中有效结晶度显著降低。
对于Fe含量较高的Ag–FeNPs（1:1和1:2比例），Ag相关的衍射峰被严重抑制或几乎无法区分，表明随着Fe浓度的增加，晶体有序性进一步降低。对于任何Ag–Fe组成，都没有检测到可归因于晶体Fe或氧化铁相的明显衍射峰，表明Fe物种以高度分散和/或低结晶度的状态存在，低于XRD的检测限。XRD结果表明，随着Fe含量的增加，晶体Ag相逐渐被抑制，导致有效结晶度降低，而不是在双金属纳米颗粒系统中完全没有Ag。使用H. perforatum叶提取物合成的生物源Ag–FeNPs的透射电子显微镜（TEM）图像显示在图6中。基于结构（XRD）和功能性能的总体评估，仅对Ag–Fe（2:1）纳米颗粒系统进行了TEM表征，该系统被认为是最具代表性的组成。对于每个纳米颗粒样品，测量了100个单独颗粒的直径，并将得到的尺寸分布表示为直方图以指示平均颗粒大小（如图6所示）。AgNPs的TEM分析显示了球形形态，分布均匀，没有聚集的证据。Ag–FeNPs的平均颗粒大小确定为60.98 ± 18.09 nm。这些双金属纳米颗粒通常比之前报道的类似物小，颗粒直径范围大约在20到110 nm之间。观察到的尺寸差异可能归因于在绿色合成过程中使用植物叶提取物作为还原和稳定剂。在更高的放大倍数下，Ag–FeNPs的TEM图像显示了莫尔条纹和明显的形态，表明具有银核和铁壳的核壳排列，与文献报道一致。莫尔条纹是由于重叠或略微旋转的晶体层之间的干涉产生的。TEM显微图中的这种条纹图案证实了双金属Ag–FeNPs的结晶性。
3.2 GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架样品的化学成分和形态
进行了傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析，以识别GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架中存在的官能团，并评估每个组分的加入如何影响整体聚合物基质。制备的纳米纤维支架的FT-IR光谱显示在图7中。纯GEL和GEL/CTS支架的光谱显示了几种相似的峰，这些峰归因于GEL和CTS中共有的官能团。在3283 cm−1附近的一个宽带被归因于O–H伸缩振动。在大约3085 cm−1和2983 cm−1处观察到的弱信号分别对应于烯基C–H伸缩和CH2伸缩振动。在1632 cm−1附近的强吸收与酰胺键的CO伸缩相关。其他特征带包括1520 cm−1（N–H弯曲与C–N伸缩）、1445 cm−1（CH2弯曲）、1280 cm−1（N–H弯曲）和1078 cm−1（C–O伸缩）。GEL/CTS和负载Ag–FeNP的GEL/CTS纳米纤维之间的比较没有发现峰位置的显著变化。仅观察到峰强度的轻微降低和轻微的带位移，这可能是由于纳米颗粒的负载量低（相对于总聚合物重量为5 wt%）。重要的是，Ag–FeNPs的加入没有引起任何官能团的破坏，表明纳米纤维支架在纳米颗粒整合后保持了稳定的化学结构。
图7展示了GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架样品的FT-IR光谱。进行了X射线衍射（XRD）分析，以研究Ag–FeNPs对GEL/CTS纳米纤维支架晶体结构的影响。所得到的衍射图谱显示在图8中。纯GEL显示出非常宽且弱的衍射轮廓，证实了其非晶态特性。相比之下，GEL/CTS支架在2θ ≈ 15°–28°之间显示出一个宽峰，其强度比纯GEL纳米纤维更高，表明两种聚合物成分之间有良好的相容性。负载了AgNPs的GEL/CTS纳米纤维在2θ值为38.23°、44.41°、64.63°和77.56°处显示出明显的衍射峰，分别对应于面心立方（fcc）Ag的（111）、（200）、（220）和（311）晶面（JCPDS卡片编号04-0783）。这些结果表明，尽管聚合物支架主要是非晶态的，但晶体Ag结构仍然可以被检测到。
图8展示了纯GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架样品的XRD光谱。与Ag相关的弱衍射特征根据JCPDS卡片编号04-0783被索引为面心立方（fcc）Ag。在较高角度观察到的次要低强度特征可能与来自绿色合成过程的表面结合的生物有机物种有关；然而，它们在以聚合物为主的衍射背景中的贡献是有限的。对于负载了不同成分的双金属Ag–Fe NPs的GEL/CTS支架，Fe含量的增加导致与Ag相关的衍射峰逐渐减弱。特别是对于Ag–Fe（2 : 1）成分，尽管强度和信噪比显著降低，但仍能辨别出与Ag(111)相关的衍射特征。在含有FeNPs的纳米纤维支架中，没有观察到可归因于晶体Fe或氧化铁相的明显衍射峰，这表明聚合物基质中的结晶度较低或Fe状态高度分散。从定量角度来看，Ag–Fe负载支架中与Ag相关的衍射特征的可检测性减弱反映了Fe掺入和聚合物限制效应导致的有效结晶度降低，而不是金属成分的缺失。此外，相对较低的纳米颗粒负载水平（相对于总聚合物含量为5 wt%）本质上限制了XRD对分散金属相的敏感性。这些结果表明，纳米颗粒组成和聚合物限制共同决定了GEL/CTS纳米纤维支架中的晶体可检测性。使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）检查了GEL、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架的形态。作为一种天然生物聚合物，GEL由于其可生物降解性和生物相容性而被广泛用于生物医学应用。先前的研究报道了使用极性有机溶剂（如2,2,2-三氟乙醇和六氟乙醇）通过电纺丝制备基于GEL的纳米纤维。在组织工程中，使用各种溶剂和溶剂混合物（包括甲酸、醋酸、异丙醇和水）增强了GEL溶液的电纺丝性能。在本研究中，采用了一种完全绿色的电纺丝策略用于生物医学应用，选择了醋酸-水混合物作为溶剂系统。获取了每个纳米纤维支架的FE-SEM图像，并使用ImageJ软件测量了每样品100根纤维的直径，以确定平均纤维直径（表2）。CTS、GEL/CTS和GEL/CTS/Ag–Fe支架的FE-SEM图像、元素映射结果和纤维直径直方图显示在图9中。纳米纤维的形态和直径受多种参数影响，包括溶液性质和电纺丝条件。在本研究中，所有样品的电纺丝参数（如施加电压、工作距离和流速）保持不变。因此，纤维形态主要由聚合物粘度和添加的纳米颗粒的类型和浓度决定。
图9展示了（a）GEL、（b）GEL/CTS和（c）GEL/CTS/Ag–FeNP（2 : 1）纳米纤维支架的FE-SEM图像、纤维直径分布直方图和元素映射。元素映射针对C、O、N、Ag和Fe进行。纯GEL纳米纤维显示出均匀无珠的结构，平均直径为206.97 ± 77.67 nm（图9a）。在GEL/CTS支架中，两种聚合物的高分子量和粘度以及不完全的混溶性导致纤维分布不均匀，并偶尔形成珠状物（图9b）。加入CTS后，平均纤维直径降至102.86 ± 55.36 nm。对于负载了Ag–FeNPs的GEL/CTS支架，FE-SEM分析显示纤维均匀无珠，平均直径为171.47 ± 55.96 nm。与GEL/CTS纤维相比，加入Ag–FeNP后纤维直径增加，均匀性提高（图9c）。这种变化可以归因于来自H. perforatum提取物的绿色合成Ag–FeNPs的存在和封装，这些纳米颗粒影响了电纺丝过程中的喷射拉伸行为和聚合物-纳米颗粒相互作用。当分析负载了不同Ag-to-Fe比例的FeNPs的纳米纤维时，平均直径在150到180 nm之间变化，随着Ag含量的降低而减小。这表明掺入的纳米颗粒的组成变化影响了电纺丝过程和最终的纤维形态。在电纺丝过程中，喷射表面的较高电荷密度增加了电场力，可以克服重力并减小平均纤维直径。这种机制在这里是在一般电纺丝行为的背景下讨论的，而不是直接与特定的溶液导电性变化相关，后者在当前研究中没有进行实验评估。元素分析（EDS）确认了所有支架样品中存在C、O、N、Ag和Fe。EDS光谱验证了Ag和Fe在纤维表面的掺入。由于结构相似性，GEL和CTS中的C、O和N含量相当。在负载了Ag–FeNP（2 : 1）的纤维中，Ag含量大约是Fe的两倍，表明双金属纳米颗粒在复合纤维中均匀分散。
3.3 纳米纤维支架的润湿性
通过WCA测量评估了所制备的纳米纤维支架的润湿性，如图10所示。每个支架样品的接触角值总结在表2中。通过分析水滴在纳米纤维表面形成的接触角来评估支架的亲水性。根据先前的报告，WCA低于90°表示支架具有高度多孔性和亲水性，适合生物医学应用；而WCA高于90°则表示表面疏水，孔隙率有限，在组织工程中的应用性降低。
图10展示了负载了不同Ag-to-Fe比例的Ag–Fe NPs的GEL、GEL/CTS和GEL/CTS支架的WCA测量结果。GEL/CTS支架的WCA为66.15°，反映了与生物聚合物中存在的功能基团相关的亲水表面特性。在测试的支架中，负载了AgNPs的GEL/CTS纳米纤维显示出最低的WCA（49.27°），表明AgNPs的掺入增强了支架的表面润湿性。这一发现与先前的研究结果一致。
对于负载了双金属Ag–FeNPs的支架，Fe含量的增加导致表面亲水性降低，这可以归因于Fe掺入引起的表面组成和纳米颗粒-聚合物相互作用的变化。结果表明，根据Ag-to-Fe比例的不同，从亲水性行为转变为较不亲水的行为，其中2 : 1的比例提供了最佳的亲水性。文献也指出，添加Fe或Fe3O4纳米颗粒往往会降低纳米纤维垫的润湿性。
总体而言，负载了Ag–Fe NP的纳米纤维支架的WCA值范围大约在49°到89°之间，证实了它们的亲水性。这些支架的亲水表面特别有利于细胞附着、增殖和组织整合。在伤口愈合的背景下，亲水支架表面有助于细胞附着于敷料上，促进更快的伤口闭合和改善愈合。因此，GEL/CTS/Ag–Fe纳米纤维支架的增强润湿性支持了它们在各种生物医学应用中的潜在适用性，包括伤口敷料。
3.4 抗菌测试结果
使用琼脂孔扩散试验评估了不同Ag : Fe摩尔比的双金属Ag–FeNPs对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌潜力。通过测量生长抑制区的直径（mm）来确定效果，如图11和12所示。在合成的纳米材料中，纯AgNPs显示出最强的抗菌活性，特别是对革兰氏阴性的大肠杆菌，最大抑制区为14.34 ± 0.40 mm。关于双金属组成，Ag–FeNP（2 : 1）比例表现出最高的性能，特别是对大肠杆菌，抑制区为13.61 ± 0.18 mm。相反，在含银样品中，Ag–FeNP（1 : 1）组成的抗菌活性最低，对大肠杆菌的抑制区为9.88 ± 0.14 mm。有趣的是，虽然双金属样品对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌显示出相对可比的结果，但对大肠杆菌观察到了明显的剂量-反应关系，其中Ag–FeNP（2 : 1）的表现明显优于Ag–FeNP（1 : 1）。这表明双金属结构中较高的银含量对于增强对革兰氏阴性菌的抗菌活性至关重要。值得注意的是，纯FeNPs对这两种细菌菌株均未显示出可检测的抑制区，证实了双金属系统的抗菌性能主要由银的存在和协同整合驱动。这些发现与Joshi等人（2025年）的研究结果一致，他们表明绿色合成的Ag–FeNPs对细菌有效。我们的研究进一步表明Ag–Fe比例非常重要。为了保持高抗菌效果，双金属结构中需要更多的银来有效阻止细菌生长。
代表性的琼脂孔扩散板显示了合成纳米颗粒对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌活性。（a）AgNPs，（b）Ag–FeNP（2 : 1），（c）Ag–FeNP（1 : 2），（d）Ag–FeNP（1 : 1）。孔周围的清晰区域表明细菌生长受到抑制。图12展示了合成纳米颗粒的抗菌活性评估。通过6小时培养后的光密度（O.D.）测量评估了纳米纤维垫的抗菌效果（图13）。结果表明，纳米纤维对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对有限。在测试的组中，AgNPs和Ag–FeNP（2 : 1）整合的纤维样品对这种菌株的抑制水平最高。这些发现与孔扩散试验中观察到的趋势高度相关。
通过光密度（O.D.）测量在600 nm下评估了纳米纤维垫的抗菌性能，针对（a）大肠杆菌（E. coli）和（b）金黄色葡萄球菌（S. aureus）在6小时培养后的结果。数据以三次测量的平均值呈现。通过确定它们对革兰氏阳性（S. aureus）和革兰氏阴性（E. coli）细菌的最低抑制浓度（MIC）来评估纳米纤维垫的抗菌效果。结果总结在表3中，显示抗菌效力根据纳米颗粒组成和测试的细菌菌株而显著不同。在所有测试样品中，纯AgNPs显示出最高的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌的MIC值为50 µg mL−1，对大肠杆菌的MIC值为25 µg mL−1。在大多数情况下，纳米颗粒对大肠杆菌的抑制效果比对金黄色葡萄球菌更明显。这在纯AgNPs和Ag–FeNP（2 : 1）样品中尤为明显。然而，随着铁含量的增加，Ag–FeNP（1 : 1）的抑制效果显著减弱，特别是对大肠杆菌，其中MIC超过了最大测试浓度（>200 µg mL−1）。
此外，纳米纤维垫对大肠杆菌的抑制活性明显比对金黄色葡萄球菌更显著。AgNP和Ag–FeNP（2 : 1）组成再次成为最有效的配方。值得注意的是，掺有Ag–FeNP（1 : 1）的纳米纤维比含有Ag–FeNP（1 : 2）的纤维活性更低，反映了随着基质中银与铁的比例改变，抑制效果减弱。对结果的全面分析表明，裸露的双金属纳米颗粒及其相应的纳米纤维复合材料对革兰氏阴性大肠杆菌比革兰氏阳性金黄色葡萄球菌更有效。随着全球抗生素耐药性危机的加剧，以及传统抗菌剂的高经济负担，开发高效且成本效益高的配方变得必要。
本研究的发现表明，银仍然是抗菌效力的主要驱动因素。然而，考虑到银的固有毒性，将其与更具有生物相容性的金属（如铁）合成成双金属系统具有战略优势。研究发现，这种整合并没有显著降低抗菌效果，纳米纤维垫的性能几乎保持不变。这些观察结果与现有文献中关于银-铁双金属系统的报道一致。24,48
总体而言，这些发现表明了抗菌行为明显依赖于组成成分，证实了精确调节Ag:Fe摩尔比是优化双金属纳米纤维系统抗菌性能的关键参数。与之前报道的基于聚合物的抗菌创可贴系统相比，大多数纳米纤维支架主要是通过将单金属银纳米颗粒掺入各种聚合物基质中来实现抗菌功能的。49 虽然这种方法受益于银已知的抗菌效果，但它们通常依赖于相对较高的银含量，并且在组成优化方面灵活性有限。在本研究中，将银-铁双金属纳米颗粒整合到明胶/壳聚糖纳米纤维基质中，代表了一种独特的设计策略，使得在可生物降解和生物相容的支架平台上进行组成调节成为可能。研究表明，Ag-Fe（2:1）配方在不增加银含量的情况下表现出增强的抗菌性能，同时保持了良好的表面润湿性和均匀的纤维形态。这种效率表明铁成分提供了协同增强作用。虽然银被认为可以通过自由基途径诱导细胞内氧化应激，但其在较低浓度下的有效性表明铁作为膜不稳定的生化催化剂。具体来说，铁作用于细菌细胞壁蛋白中的巯基侧链。这种结构上的互补性使得即使在亚最大剂量下，银物种也能更容易渗透。24,50,51
本研究将GEL/CTS聚合物基质整合进来，相比合成替代品具有明显的优势，特别是在潜在的细胞相容性和可降解性方面，这些是功能性创可贴应用的关键参数。52 虽然传统上关于Ag/PVA纳米纤维的研究强调达到高抗菌率严格依赖于提高银的装载密度，但我们的GEL/CTS基银-铁双金属系统通过协同机制实现了相当的效果，同时显著降低了银的含量。53 这种协同作用不仅优化了抗菌性能，还提高了材料的安全性。事实上，已有报道指出包含壳聚糖和金属氧化物纳米颗粒的类似纳米纤维系统能够保持高细胞活力，这表明我们专门设计的银铁比例较低的GEL/CTS基质很可能为生物医学应用提供类似的无毒性特性。54 因此，通过利用铁的生化促进作用以及GEL/CTS支架的生物相容性，我们提供了一种更可持续、更安全的替代方案，无需使用高剂量的银基敷料，同时不牺牲杀菌效率。
4. 结论
在本研究中，通过使用H. perforatum叶提取物采用绿色方法合成了银-铁双金属纳米颗粒，并将其整合到静电纺制的GEL/CTS纳米纤维支架中，用于潜在的创可贴应用。生物合成的纳米颗粒呈现球形形态，平均直径为60.98 ± 18.09纳米，并在聚合物网络中均匀分布。将CTS加入GEL中减小了纤维直径，而添加Ag-FeNPs则由于纳米颗粒的包封作用和溶液导电性的降低而增加了纤维直径。含有Ag-FeNPs的支架在2:1 Ag:Fe比例下表现出有利的纤维尺寸（大约150–185纳米），并保持了均匀、无珠的结构。XRD分析确认了AgNPs的晶体特征，并表明FeNPs的结晶度较低或处于高度分散的结构状态，而Fe含量的增加导致复合纤维中与银相关的衍射强度逐渐降低。润湿性测量显示了明显的组成依赖性趋势。纯FeNP负载的支架表现出疏水性（WCA ≈ 108°），而增加银含量逐渐降低了接触角，含银的支架显示出增强的亲水性。含银的支架最具亲水性（WCA ≈ 49°），支持伤口相关应用所需的水分交换。富铁的组成接近亲水阈值，而富银的系统保持了较低的WCA值。抗菌结果表明，对大肠杆菌的抑制作用比对金黄色葡萄球菌的抑制作用更强，且添加铁并没有显著降低基于银的系统的抗菌效率。这些发现表明，通过绿色路线合成的Ag-FeNPs可以提供有效的抗菌功能，同时可能减少对高银浓度的需求。总体而言，这里开发的Ag-Fe NPs增强的GEL/CTS支架作为一种环保、生物活性的抗菌材料，显示出作为潜在创可贴应用的有希望的特性。结果强调，调节Ag:Fe比例可以在可持续的制造框架内控制表面润湿性和抗菌性能。未来的研究可以系统评估Ag:Fe比例与抗菌效率和细胞相容性的关系，包括体外细胞活力和增殖实验。此外，整合其他生物活性剂或探索替代的生物聚合物基质可能进一步增强这些支架的功能性，支持它们向先进的、可持续的生物医学应用发展。作者贡献
Fatma Bayram：概念化、监督、方法论、表征、数据分析、撰写——原始草稿。Fatih Erci：概念化、监督、抗菌实验、撰写——审阅和编辑。Nour Alhuda Asad：实验工作、合成和数据收集支持。利益冲突
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。数据可用性
所有支持本研究发现的数据都包含在主文章中。致谢
这项研究得到了科尼亚技术大学科学研究委员会根据Grant Agreement No. BAP-241016017提供的资助。作者感谢Necmettin Erbakan大学科学技术研究与应用中心（BITAM）和科尼亚技术大学提供了必要的研究基础设施。参考文献
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