双喆 Mao | 清凯 Wei | 韩 张 | 孟萌 Sun | 京城 Cai | 新 张 | 汤 福 | 崔 海臣 | 冯 娜 | 李 阿博 | 赵 志辉 | 王 嘉书 | 董 建芳 | 刘 建华 | 胡 中秋
西北农业科技大学食品科学与工程学院，中国陕西省杨陵市712100
**摘要**
传统枸杞酒的颜色偏黄，多酚单体、有机酸和风味成分不足，这些问题主要是由于采用单一的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行发酵所致。本研究旨在通过交替使用Eurotium cristatum和S. cerevisiae，或富硒的E. cristatum与S. cerevisiae进行发酵，以改变枸杞酒的颜色，增加多酚含量，并提升某些特征性物质的含量及感官品质。实验结果表明：（1）交替发酵使枸杞酒的颜色从黄色变为玫瑰色；（2）与传统枸杞酒相比，采用E. cristatum和S. cerevisiae的交替发酵显著提高了芦丁、没食子酸、对香豆酸和绿原酸的含量，降低了（+）儿茶素和阿魏酸的含量，并通过增加酯类物质增强了酒体的香醇感（类似白兰地、梨和菠萝的香气）；绿原酸和咖啡酸的含量增加了35%以上，而苹果酸的含量减少了30%以上；（3）富硒的E. cristatum与S. cerevisiae的交替发酵显著提高了硒（Se）含量和酒体的香醇度及菠萝椰子香气，这归因于硒暴露改变了蛋白质的表达谱。本研究有效提升了枸杞酒的品质。
**1. 引言**
枸杞（Lycium barbarum）广泛分布于亚洲、非洲、美洲和欧洲，既可作为药材也可作为食品（Ouyang等人，2017年）。传统上，人们将枸杞浸泡在中国白酒中用于治疗疲劳、失眠和胃寒等症状。因此，枸杞酒已成为现代人追求健康生活的理想饮品（Qiang等人，2023年），这也促进了我国枸杞种植面积和产量的大幅增长。然而，目前发酵枸杞酒仍然存在香气和风味不足的问题（Geng等人，2021年），这严重影响了消费者的购买意愿。传统上仅使用S. cerevisiae作为单一菌种进行发酵，主要是由于其高产率、高效率和稳定的发酵性能，但这种发酵方式导致果实酒的风味单一且缺乏多样性。最近的研究表明，将猕猴桃汁与选定的非酿酒酵母（如Zygosaccharomyces rouxii、Pichia kudriavzevii和Meyerozyma guilliermondii）进行共发酵，可以提升猕猴桃酒的香气（Sun等人，2024年），并增加酯类和醇类物质的含量，从而强化花香和果香风味（Călugăr等人，2023年；Guo等人，2025年）。多菌种发酵策略有望改善枸杞酒的风味品质。不过，由于不同水果对发酵菌种的要求不同，选择合适的非酿酒酵母是提升枸杞酒品质的关键因素。
Eurotium cristatum这种真菌常用于茯砖茶的固态发酵，它能够通过降低酯类儿茶素的含量来减少茶的涩味、苦味、鲜味和酸味，同时通过增加茶褐素（TBs）和茶多糖的含量来增强茶的颜色（Chen等人，2023年）。此外，E. cristatum还能提高发酵后大豆中的总酚含量和结合型酚含量（Shi & Hu，2024年），而这正是S. cerevisiae发酵所缺乏的。然而，这些研究并未详细探讨发酵过程中枸杞果实中酚类化合物的变化情况。E. cristatum与S. cerevisiae的联合发酵有可能改善枸杞酒的风味、多酚含量及颜色等品质特征，但相关研究较为有限。
硒（Se）可通过微生物的作用转化为硒蛋白或含硒蛋白质（Hossain等人，2021年；Ojeda等人，2020年），并形成一种名为SECIS元素的特殊RNA结构（Huang等人，2024年；Ye等人，2020年）。这意味着硒富集微生物的蛋白质表达谱可能因硒暴露而发生改变，从而有可能改变枸杞酒的风味。此外，硒富集微生物还能在酒中产生硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸等含硒氨基酸，以满足人们的健康需求（Zhang等人，2023年）。然而，这类研究目前还较为罕见。
本研究旨在通过交替使用非硒富集型和硒富集型的E. cristatum与S. cerevisiae进行发酵，改善枸杞酒的有机酸、酚类成分及挥发性香气等理化性质，打破传统酿造技术的局限，拓展E. cristatum在果酒酿造中的应用，开发具有良好风味和健康功能的新型产品，从而提升枸杞酒的品质和市场价值。
**2. 材料与方法**
2.1 **菌种与原材料**
S. cerevisiae HYJ-2和E. cristatum SHBCC D15081由西北农业科技大学食品制造与安全实验室保存。枸杞样品“宁琪7号”由中国中宁县提供，由宁夏红枸杞业有限公司免费提供，经过滤后得到果汁。果汁在50°C下用果胶酶酶解2小时，随后在90°C下灭活果胶酶10分钟，再加入适量葡萄糖、柠檬酸和亚硫酸氢钾，调整至最终糖含量200 g/L、pH值3.55±0.25、SO2含量80 mg/L，为后续酿酒工序做准备。
2.2 **试剂**
标准试剂（L-苹果酸、L-乳酸、琥珀酸、醋酸、绿原酸、咖啡酸、没食子酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、（+）儿茶素和2-辛醇）均购自上海裕源生物科技有限公司；酵母提取物粉末、葡萄糖和蛋白胨购自北京奥博兴生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂、亚硫酸氢钾、亚硒酸钠、碳酸钠和氯化钠购自楊陵三利化工有限公司。
2.3 **枸杞酒的制备**
S. cerevisiae在YPD培养基中于28°C、150 rpm下活化一夜；E. cristatum在PDB培养基中同样条件下活化一夜。随后将菌体离心收集，用无菌生理盐水洗涤两次，稀释至10^7 CFU/mL后进行发酵。
硒富集型S. cerevisiae通过将S. cerevisiae在含有30 mg/L Na2SeO3的YPD培养基中培养2天获得；硒富集型E. cristatum则在含有30 mg/L Na2SeO3的PDB培养基中培养5天获得。将菌体用无菌生理盐水洗涤两次，稀释至10^7 CFU/mL后用于枸杞酒的发酵。菌体中的硒含量采用我们团队之前开发的方法测定（Wei等人，2024年；Zhang等人，2023年）。
枸杞酒的三种发酵方案如下：
（1）JM酒：第6天将S. cerevisiae接种到处理过的枸杞汁中，于25°C厌氧条件下发酵至第11天结束；过滤去除细菌后得到JM酒。
（2）JHJM酒：第一天将E. cristatum接种到枸杞汁中，于25°C、160 rpm下摇床发酵至第6天；过滤后接种S. cerevisiae，继续发酵至第11天结束；过滤后得到JHJM酒。
（3）SEJHJM酒：第一天将硒富集型E. cristatum接种到枸杞汁中，于25°C、160 rpm下发酵至第6天；过滤后接种硒富集型S. cerevisiae，继续发酵至第11天结束；过滤去除细菌后得到SEJHJM酒。所有实验的接种量为1%。
2.4 **酒品基本理化性质的检测**
酒精含量按照中国标准GB/T 15038-2006（Liu等人，2016年）进行测定；总糖（TS）和总酸（TA）的测定方法参考Wei等人（2019年）进行适当修改：取2.5 mL酒样，加入5 mL 1 M盐酸和5 mL蒸馏水，在60°C水浴中加热1小时，用1 M NaOH调整pH至中性，再用蒸馏水稀释至25 mL；根据Lane-Eynon方法测定总糖含量。总酸的测定步骤为：取2 mL酒样，加入2滴酚酞和100 mL蒸馏水，用0.1 mol/L NaOH滴定至浅粉色终点（持续30秒），根据消耗的氢氧化钠体积计算总酸含量。
枸杞酒的色空间（CIE L*a*b*）使用CS-820色度计测定（杭州凯普科技有限公司）。总色差（ΔE*）根据公式（1）计算：
(1) ∆E* = (L1* − L0*)² + (a1* − a0*)² + (b1* − b0*)²
其中1表示实验组，0表示对照组。
2.5 **酒中多酚的测定**
总多酚含量采用Folin-Ciocalteu方法测定（Cavia等人，2023年；Sun等人，2024年）并适当修改：取0.5 mL酒样或果汁，与0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂和1.5 mL 7.5%碳酸钠溶液混合，加蒸馏水至10 mL，然后在20°C下反应2小时；将样品稀释20倍，使其在765 nm处的吸光度介于0.3至0.7之间。建立标准曲线后，使用你提供的方法（Sun等人，2024年）测定单酚含量。
3. **结果与讨论**
通过交替使用非硒富集型和硒富集型的E. cristatum与S. cerevisiae进行发酵，枸杞酒的有机酸、酚类成分及香气得到显著改善，突破了传统酿造技术的局限，拓展了E. cristatum在果酒酿造中的应用，开发出具有良好风味和健康功能的新型产品，提升了枸杞酒的品质和市场价值。经过全面的波长扫描和优化后， rutin、gallic acid 和 (+)-catechin 的最佳检测波长定为 280 nm，而 p-coumaric acid、chlorogenic acid、cafeic acid 和 ferulic acid 的最佳检测波长定为 320 nm。这些相关酚类的校准曲线列在补充材料中的图 S1 和表 S1 中。
2.5. 葡萄酒中有机酸的分析
有机酸的含量是使用 Agilent HPLC 1220 Infinity II 系统（Agilent Technologies Inc.，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）根据之前的方法（Ye 等人，2014 年）进行测定的，并做了一些修改。该系统配备了 ZORBAX-SB C18 测柱（5 μm，4.6 × 250 mm）和紫外检测器。柱温维持在 30°C。流动相 A 是 0.01 mol/L、pH 2.8 的磷酸二氢铵缓冲液，流动相 B 是甲醇。采用等度洗脱，VA:VB 比率为 95:5，流速设置为 1.0 mL/min，每个样品平行分析三次。这些相关有机酸的校准曲线列在补充材料中的图 S2 和表 S2 中。
2.6. 葡萄酒中挥发性化合物的分析
挥发性化合物的分析使用固相微萃取-气相色谱-质谱（SPME-GC-MS）技术，依据我们之前的方法（Zhang 等人，2022 年）。每个样品平行分析三次。通过将质谱数据与 NIST 2023 版库中的质谱数据进行比对来鉴定挥发性成分。使用标准 2-辛醇作为外部参考标准来量化醛类代谢物（标准曲线相关系数 R2=0.995）。
2.7. 感官分析
葡萄酒的感官分析是根据 GB/T 15038-2006 “葡萄酒和果酒的一般分析方法”进行的。共选择了 10 名经过训练、保持中立态度并具有品酒经验的食品专业人士，根据本研究中补充材料表 S3 中显示的感官评价标准，从外观、香气、口感和酒体特征四个方面对桑葚酒进行感官评价。所有评价者的分数取平均值。整个感官分析过程符合感官伦理标准，不需要西北农业与林业大学的伦理委员会批准。所有参与者都是自愿参与的，他们完全了解了研究要求和潜在风险，并签署了同意书和知情同意书。参与者的信息和隐私得到了保护，同时采取了适当的措施来保护他们的权益。参与者随时有权退出研究。在正式的感官评价之前，参与者参加了为期五周的感官培训课程，直到他们通过课程标准。正式的感官实验在标准感官实验室进行，将 20 mL 的桑葚酒随机编号并放入玻璃杯中。每个样品重复三次进行评价，每次评价之间间隔 20 分钟以防止味觉疲劳。
2.8. Se 暴露对 E. cristatum 中 HSP20 表达的影响
Se 暴露对 E. cristatum 中热休克蛋白 HSP20 表达的影响的鉴定基于我们之前的研究（Guo 等人，2025 年）。
2.9. 统计分析
所有实验均平行进行了三次。图表使用 Origin 软件制作，统计分析使用 SPSS 25.0 软件进行，显著性评估采用方差分析（ANOVA）。
3. 结果
3.1. 富硒枸杞酒中的 Se 含量
经 Se 暴露后，富硒 E. cristatum 中的 Se 含量为 189.60 μg/g，富硒 S. cerevisiae 中的 Se 含量为 462.26 μg/g。由于培养过程中未添加 Se，因此在原始的 E. cristatum 和 S. cerevisiae 细胞中未检测到 Se。JM 酒和 JHJM 酒中也未检测到 Se，因为培养过程中未添加 Se。SEJHJM 酒中的 Se 含量为 0.474 mg/L，显著高于 JM 和 JHJM 酒，符合富硒酒的标准要求。这表明富硒 E. cristatum 和 S. cerevisiae 从细胞中向酒体中释放了一些 Se。因此，富硒 E. cristatum 和 S. cerevisiae 可以作为发酵菌株用于制备富硒枸杞酒。实际上，这涉及两个问题：在产品制备过程中，追求的目标是获得相对较高的 Se 含量；而在商业应用中，则需要引导消费者通过科学消费安全地补充 Se。安全的 Se 补充剂量必须基于每日摄入量的上限和消费者的实际每日膳食摄入量。根据 EFSA 确定的每日可容忍摄入量上限 255 μg/天以及 SEJHJM 酒中的 Se 含量 0.474 mg/L（EFSA 营养小组，2023 年），最大日摄入量应限制在 538 mL 以内，以确保其保持在安全范围之内。然而，这没有考虑到不同地区的膳食摄入量差异。例如，根据《中国国家营养与健康监测报告（2015-2017 年）》，中国成年人的平均膳食 Se 摄入量仅为 33.9 μg/天。基于此，实际推荐日摄入量应进一步降低到 466 mL。此外，为了满足公众对更好的健康和安全的需求，各国陆续引入了推荐营养素摄入量（RNI）。例如，中国营养学会（2023 年）为成年人推荐的 Se 摄入量为 60 μg/天，美国国立卫生研究院（NIH）推荐的摄入量为 55 μg/天。因此，一个成年人每天可以饮用 50 mL 的这种枸杞酒，这提供大约 23.7 μg 的 Se，占中国推荐摄入量的 39.5%，仅占 EFSA 上限的 9.3%，代表了一种科学安全的长期 Se 补充策略。其他国家和地区面临 Se 缺乏问题的人也可以根据他们的摄入水平、RNI 和明确标注的 Se 含量 0.474 mg/L 来调整剂量。
3.2. 果杞酒的基本理化特性
三种发酵枸杞酒的基本理化特性，包括酒精含量、总糖（TS）、总酸（TA）、色空间及其差异，总结在表 1 中。
表 1. 三种枸杞酒的基本理化特性。
从表 1 可以看出，JHJM 和 SEJHJM 酒中的酒精含量分别比 JM 酒低 0.8% 和 1.2%。这一趋势与之前的研究结果一致（Rolle 等人，2018 年），但降低的值高于 Starmerella bacillaris 和 S. cerevisiae 共发酵时报告的 0.2% 至 0.3% 的下降范围。这可能归因于 E. cristatum 的早期发酵，因为一些还原糖首先被 E. cristatum 通过非糖酵解途径消耗，导致 S. cerevisiae 在酒精发酵过程中可用的还原糖减少。此外，三种酒的乙醇产量（6.2%-7.4% v/v）低于从初始总糖含量 200 g/L 计算出的理论值 11%-12% v/v。首先，一部分可发酵糖被用于细胞增殖、呼吸代谢以及酵母细胞中甘油、有机酸、高级醇、酯类和其他代谢物的合成（Lian 等人，2024 年；Wang 等人，2024 年）。最重要的是，许多关于葡萄酒的研究证实，在相同糖浓度下，不同的酵母菌株在糖的利用上存在显著差异。大多数酵母菌株的乙醇产量低于理论值。例如，一项研究发现，从脱水葡萄中分离出的不同酵母菌株在葡萄汁中的代谢能力、发酵速率、糖的利用以及甘油和有机酸的产量方面存在明显差异（Serafino 等人，2023 年）。另一项研究报告，在小麦乙醇生产中，五种商业葡萄酒酵母菌株的酒精转化率介于 57.4% 至 59.5% 之间，并且在底物利用和特定高级醇及乙酸的合成方面也存在差异（Blagoeva 等人，2023 年）。在这项工作中，所使用的酵母菌株产生了 32 种酯类化合物，如表 2 中的图（1）和图（2）所示，远高于普通发酵酒的常见范围 15-25%（Cao 等人，2022 年；Longo 等人，2020 年）。因此，可以假设部分葡萄糖被转移到了酯类生产的途径中，导致实际酒精含量低于理论值。
3.3. 果杞酒的基本理化特性
三种发酵枸杞酒的基本理化特性，包括酒精含量、总糖（TS）、总酸（TA）、色空间及其差异，总结在表 1 中。然而，JHJM和SEJHJM葡萄酒的a*值分别为23.81和23.93，两者之间没有显著差异，但都显著高于JM葡萄酒的-3.09（p<0.05）。这表明前两种酒的红色程度高于后者。JHJM和SEJHJM葡萄酒的b*值显示出相似的趋势，表明这两种酒的黄色程度显著增加。这些结果表明，E. cristatum的发酵可以增加葡萄酒的颜色空间。硒（Se）暴露并没有显著改变E. cristatum对枸杞酒颜色的影响（p>0.05）。大部分产生的红色色素应归因于E. cristatum的发酵作用，而大部分黄色色素应归因于S. cerevisiae的发酵作用。此外，枸杞汁中的多酚类化合物在各种酶的作用下可以被氧化成醌类物质，随后通过进一步的聚合和重排反应形成黄色色素（Chen等人，2024年）。所有传统枸杞酒的典型颜色都是淡黄色，但JHJM和SEJHJM葡萄酒更倾向于玫瑰色。与淡黄色相比，这种玫瑰色在中国人节日宴会上更受欢迎。
总之，E. cristatum和S. cerevisiae的共发酵可以有效降低枸杞酒中的乙醇含量，同时增加总酸度（TS）、总酚量（TA）和色差（ΔE），从而提高其化学稳定性和颜色多样性。硒暴露除了增加硒含量外，并不影响枸杞酒的基本物理化学性质。图1A显示了三种葡萄酒在酿造过程中总酚含量的变化。单接种S. cerevisiae后，JM葡萄酒中的总酚含量在第一天增加，从第二天到第五天保持相对稳定。相比之下，JHJM或SEJHJM葡萄酒中的总酚含量在接种E. cristatum或富硒E. cristatum后的第一天到第四天缓慢增加，但从第四天到第六天迅速增加到最高点。然而，从第六天到第九天，总酚含量略有下降，从第九天到第十一天，在接种S. cerevisiae菌株或富硒S. cerevisiae菌株后保持稳定（图1A）。JHJM或SEJHJM葡萄酒在接种后第七天到第十一天，总酚含量没有显著变化（p>0.05）。如图1B所示（p<0.05），JHJM和SEJHJM的总酚含量在第十一天结束时显著高于JM葡萄酒。这一发现与之前的研究一致，即E. cristatum可以增加固态发酵产物中的多酚含量（Y. Chen等人，2022年；Zhang等人，2024年）。换句话说，我们的结果表明E. cristatum也可以提高枸杞酒中的多酚含量。据推测，E. cristatum可能产生多种酶，如多酚氧化酶、过氧化氢酶、纤维素酶和α-淀粉酶（Fan等人，2025年），这些酶可以将枸杞汁中的多羟基苯环大分子分解成葡萄酒中的酚类物质。类似地，S. cerevisiae也可以增加JHJM葡萄酒中的多酚含量，但在文献中也报道了例外情况（Y. Chen等人，2022年）。然而，S. cerevisiae发酵的葡萄酒中的多酚含量增加量低于E. cristatum发酵的葡萄酒。此外，硒暴露对SEJHJM葡萄酒中的总酚含量没有显著影响（p>0.05）。
为了进一步揭示多酚单体的变化，通过HPLC测定了所用枸杞汁和三种枸杞酒中的多酚单体含量，并在图1C中进行了展示。可以观察到，单接种S. cerevisiae菌株酿造的JM葡萄酒中的芦丁和其他6种单体酚的含量均显著增加（p<0.05）。关于这些多酚单体在枸杞酒酿造过程中的变化，相关文献较少，但之前有报道在青藏高原的浆果中首次鉴定出11种酚酸（没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、2-羟基苯乙酸和鞣花酸）（C. Chen等人，2022年）。其中一些酚酸也存在于番荔枝科果实（de Moraes等人，2020年）和黑桑葚酒（Türköz Acar等人，2018年）中）。我们的结果表明，酵母发酵可以显著增加JM葡萄酒中这些多酚的含量。与JM葡萄酒相比，JHJM葡萄酒中的芦丁、没食子酸、对香豆酸和咖啡酸的含量持续显著增加，而（+）-儿茶素和阿魏酸的含量显著下降（p<0.05）。7种单体酚的总含量显著增加，这与图1A和图1B的结果一致。在之前的文献中，只有通过固态发酵的茶中曾报道过（+）-儿茶素（Xiao等人，2021年）。与JHJM葡萄酒相比，SEJHJM葡萄酒中的（+）-儿茶素、绿原酸和阿魏酸的含量显著增加（p<0.05），而芦丁、没食子酸和对香豆酸的含量没有显著变化（p>0.05），表明硒暴露可以显著增加枸杞酒中的（+）-儿茶素、绿原酸和阿魏酸的含量。然而，JHJM葡萄酒和SEJHJM葡萄酒中7种单体酚的总含量没有显著差异，这与图1B的结果一致（p>0.05）。这些在枸杞酒中发现的多酚单体由于其抗氧化作用可以保护葡萄酒的颜色和感官特性（Li等人，2017年）。此外，硒暴露显著增强了（+）-儿茶素、绿原酸和阿魏酸的形成。然而，关于E. cristatum与S. cerevisiae之间，以及富硒E. cristatum与富硒S. cerevisiae之间的相互作用，现有的知识仍然有限。毫无疑问，多酚含量的显著增加对枸杞酒的颜色保护特性和健康益处是有益的（Gutiérrez-Escobar等人，2021年）。
通过HPLC测定了葡萄酒中的有机酸含量，并在图1D中展示了结果。可以观察到检测到了五种有机酸，包括苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。如图1D所示，JHJM和SEJHJM葡萄酒中的苹果酸含量分别为0.198和0.184克/升，均显著低于JM葡萄酒的0.27克/升（p<0.05）。JHJM和SEJHJM葡萄酒之间的苹果酸含量没有显著差异（p>0.05）。JHJM和SEJHJM葡萄酒中的乳酸含量分别为0.318和0.314克/升，两者都显著高于JM葡萄酒的0.118克/升（p<0.05）。可以看出，E. cristatum的发酵显著降低了具有酸味的苹果酸含量，并增加了具有甜味的乳酸含量，这与苹果酸-乳酸发酵（MLF）过程的特性一致（Genisheva等人，2014年；Tian等人，2024年）。因此，E. cristatum的发酵可以通过调节苹果酸和乳酸的含量来改善枸杞酒的口感特性。此外，硒暴露对E. cristatum中的苹果酸和乳酸代谢没有显著影响。
与JM葡萄酒相比，JHJM和SEJHJM葡萄酒中的乙酸含量分别减少了约4%（p<0.05）。JHJM和SEJHJM葡萄酒之间存在显著差异，表明共发酵可以显著降低乙酸的含量，而硒暴露对乙酸的代谢没有显著影响。乙酸含量的降低有助于降低酸度并改善JHJM和SEJHJM葡萄酒的口感。JHJM和SEJHJM葡萄酒中的柠檬酸含量分别为0.248和0.268克/升，分别比JM葡萄酒高出约25%（p<0.05）。JHJM和SEJHJM葡萄酒之间的柠檬酸含量没有显著差异，表明共发酵可以显著增加柠檬酸的含量，而硒暴露对柠檬酸的代谢没有显著影响。据报道，柠檬酸代谢与三羧酸循环（TCA）有关，可能会影响糖酵解途径以及一些脂肪酸、磷脂、氨基酸、维生素和烟酰胺的代谢途径（Mei等人，2023年），但E. cristatum对柠檬酸代谢的影响尚不清楚。值得注意的是，柠檬酸浓度的增加可以由于其强大的抗氧化功能而保护JHJM和SEJHJM葡萄酒的颜色和营养稳定性。JHJM和SEJHJM葡萄酒中的琥珀酸含量分别为0.208和0.205克/升，分别比JM葡萄酒低约25%（p<0.05）。JHJM和SEJHJM葡萄酒之间的琥珀酸含量没有显著差异，表明共发酵可以显著降低琥珀酸的含量，而硒暴露对琥珀酸的代谢没有显著影响。值得注意的是，琥珀酸含量的降低有助于JHJM和SEJHJM葡萄酒的口感协调性和一致性，因为琥珀酸常被用作酸度调节剂。上述五种有机酸的总含量在JHJM和SEJHJM葡萄酒之间没有显著差异。JHJM和SEJHJM葡萄酒的pH值分别为3.80±0.01和3.81±0.01，两者之间没有差异（p>0.05），表明硒暴露对枸杞酒中的有机酸没有显著影响。然而，JM葡萄酒的pH值为3.69±0.01，显著低于JHJM和SEJHJM葡萄酒（p<0.05）。适当的酸度对葡萄酒的质量非常重要，它可以增加葡萄酒的层次感和深度，而酸度过高或过低都可能破坏葡萄酒的整体协调性。因此，最终的风味评估对这三种葡萄酒非常重要。
通过气相色谱-质谱（GC-MS）测定了枸杞酒中的所有挥发性芳香化合物的含量，并在表2中列出。气味活性值（OAV）通常用于评估这些挥发性化合物对枸杞酒香气特征的贡献。根据现代风味理论（Wang等人，2017年；Wei等人，2020年；Zhang等人，2016年），OAV值高于1.0的化合物对葡萄酒的整体香气有显著影响。因此，所有可用的OAV值都被计算并列在表2中。可以观察到，JM葡萄酒中含有52种挥发性化合物，包括13种醇、32种酯、3种酸、2种醛和2种酚；JHJM葡萄酒中含有55种挥发性化合物，包括11种醇、37种酯、3种酸、3种醛和1种酚；SEJHJM葡萄酒中含有57种挥发性化合物，包括11种醇、39种酯、3种酸、3种醛和1种酚（表2-图（1））。表2-图（2）的统计数据显示，挥发性酯和醇在五种挥发性物质类别中的质量百分比分别为69%-75%和26%-23%。挥发性酸、醛和酚的总质量百分比之和小于或等于4%。可以看出，与JM葡萄酒相比，SEJHJM和JHJM葡萄酒中的挥发性酯的总质量百分比有所增加。相比之下，SEJHJM和JHJM葡萄酒中挥发性醇和酸的总质量百分比都有所降低，这是这两种通过共同发酵生产的枸杞酒中这些挥发性风味类别的一般变化规则。JM葡萄酒是中国传统上使用单一S. cerevisiae菌株发酵的枸杞酒，其挥发性成分与原材料、加工条件、发酵条件和微生物群落密切相关（Gu等人，2023年；Jingjin等人，2024年）。与JM葡萄酒中的挥发性醇相比，JHJM葡萄酒中的1-辛醇、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、异丁醇和3-甲基-1-戊醇的含量显著增加（表2中以红色背景表示，p<0.05）。相反，JHJM葡萄酒中的戊醇、1-己醇、苯乙醇、异肌醇、丁醇、异戊醇、叶醇和庚-1-醇的含量显著降低（表2中以蓝色背景表示，p<0.05）。两组之间的二甲基硅烷二醇含量没有差异（p>0.05）。与JM葡萄酒中的挥发性酯类相比，JHJM葡萄酒中的22种酯类的含量显著增加，包括己酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸丙酯、异丁基癸酸酯、邻苯二甲酸二乙酯、苯甲酸乙酯、6-甲基庚酸乙酯、2-甲基丁基己酸酯、庚酸乙酯、硬脂酸乙酯、2-甲基丙基辛酸酯、3-甲基丁基辛酸酯、3-甲基丁基己酸酯、丙酸乙酯和4-羟基丁酸甲酯、苯乙酸乙酯、壬酸乙酯（表2中以红色背景表示，p<0.05）。其中，己酸乙酯、2-甲基丙基辛酸酯、3-甲基丁基辛酸酯和乙酸辛酯的OAV（气味值）大于1.0，它们的OAV分别从7.86增加到56.66、15.16增加到24.71、1.63增加到1.74、1356.11增加到1867.08。这表明这些酯类浓度的增加可以导致可感知的风味变化。己酸乙酯的增加赋予了葡萄酒苹果或香蕉的风味；2-甲基丙基辛酸酯和3-甲基丁基辛酸酯的增加增强了葡萄酒的果香和白兰地香气；乙酸辛酯的增加赋予了JHJM葡萄酒明显的菠萝和白兰地风味。因此，这四种酯类的含量增加突出了由E. cristatum SHBCC D15081和S. cerevisiae HYJ-2组合发酵的JHJM葡萄酒的白兰地和菠萝风味。相反，JHJM葡萄酒中的11种酯类的含量显著降低（表2中以蓝色背景表示，p<0.05），包括异戊酸乙酯、月桂酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸甲酯、十四酸乙酯、己酸乙酯、十六酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和丁酸乙酯。苯乙酸乙酯、甲基己酸酯、甲基辛酸酯和甲基（E）-肉桂酸酯在JHJM葡萄酒中未检出。在这17种酯类中，异戊酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯的OAV超过1.0，它们的OAV分别从143.01降低到121.59、225.18降低到117.05、2.58降低到2.00。结果表明，它们含量的降低导致其特征风味的减弱。异戊酸乙酯常被用作人工香料，为食品增添香蕉风味；己酸乙酯和丁酸乙酯可以为葡萄酒赋予菠萝风味。因此，这三种酯类含量的降低减弱了由E. cristatum SHBCC D15081和S. cerevisiae HYJ-2组合发酵的JHJM葡萄酒的香蕉和菠萝风味。这种菠萝风味的损失可能部分被上述其他具有类似风味的酯类所补偿。此外，JM葡萄酒和JHJM葡萄酒中的戊酸乙酯、癸酸乙酯、3-甲基戊酸乙酯和9-十六烯酸乙酯的含量没有显著差异（p>0.05），表明它们对两种葡萄酒的风味影响不大。与JM葡萄酒中的挥发性酸相比，JHJM葡萄酒中的辛酸、1-己酸和癸酸的含量显著降低（表2中以蓝色背景表示，p<0.05）。只有辛酸的OAV大于1.0，表明其不愉快的脂肪和奶酪风味在JHJM葡萄酒中有所减弱。与JM葡萄酒中的挥发性醛类相比，JHJM葡萄酒中的苯甲醛和2,4-二甲基苯甲醛的含量显著增加（表2中以红色背景表示，p<0.05）。然而，苯甲醛的OAV远小于1.0，其变化对JHJM葡萄酒的风味影响不大。尽管2,4-二甲基苯甲醛的OAV数据不可得，但它的结构与苯甲醛相似，可以推断其变化也不会影响JHJM葡萄酒的风味。此外，JHJM葡萄酒中的乙醛浓度显著低于JM葡萄酒（p<0.05），其OAV小于1.0，其浓度的变化对JHJM葡萄酒的风味没有明显影响。此外，乙醛浓度的降低对健康有益。同样，由于4-乙烯基酚的阈值未知，其含量在JHJM葡萄酒中的显著降低对风味的影响也不明显。2,4-二丁基酚的显著降低对其风味的影响也不明显，因为其OAV较低。与JHJM葡萄酒中的挥发性醇相比，SEJHJM葡萄酒中的异丁醇、苯乙醇和异肌醇的含量显著增加（表2中以红色字体表示，p<0.05）。相反，SEJHJM葡萄酒中的五种挥发性醇的含量显著降低（表2中以蓝色字体表示，p<0.05），包括1-辛醇、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、戊醇、1-己醇和二甲基硅烷二醇。根据它们的阈值和含量，所有上升或下降的挥发性醇的OAV都低于1.0，表明这些挥发性醇的浓度变化消费者无法感知。与JHJM葡萄酒中的挥发性酯类相比，SEJHJM葡萄酒中的16种酯类的含量显著增加（表2中以红色字体表示，p<0.05），包括2-甲基丙基辛酸酯、3-甲基丁基辛酸酯、3-甲基丁基己酸酯、丙酸乙酯、4-羟基丁酸甲酯、苯乙酸乙酯、壬酸乙酯、十六酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、丙酸丙酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯、3-甲基戊酸乙酯和9-十六烯酸乙酯。其中，2-甲基丙基辛酸酯、3-甲基丁基辛酸酯、己酸乙酯和癸酸乙酯的OAV超过1.0，它们的OAV分别从24.71增加到32.66、1.74增加到1.99、117.05增加到149.47、5.99增加到6.25。这表明它们浓度的增加可能导致风味的改变。作为香料，2-甲基丙基辛酸酯的增加可以增强葡萄酒的果香；3-甲基丁基辛酸酯的增加可以改善葡萄酒的白兰地风味；乙酸辛酯的增加赋予了葡萄酒菠萝风味；癸酸乙酯的增加增强了SEJHJM葡萄酒的白兰地和椰子风味。因此，这四种酯类含量的增加突出了由Se-enriched E. cristatum SHBCC D15081和Se-enriched S. cerevisiae HYJ-2组合发酵的SEJHJM葡萄酒的白兰地、菠萝和椰子风味。相反，SEJHJM葡萄酒中的17种酯类的含量显著降低（表2中以蓝色字体表示，p<0.05），包括己酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁基癸酸酯、邻苯二甲酸二乙酯、苯甲酸乙酯、6-甲基庚酸乙酯、2-甲基丁基己酸酯、硬脂酸乙酯、异戊酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、丁酸乙酯和十四酸乙酯。其中，己酸乙酯和异戊酸乙酯的OAV超过1.0，它们的OAV分别从56.66降低到53.00和从121.59降低到109.22。结果表明，它们含量的降低导致SEJHJM葡萄酒的梨子和香蕉风味减弱。此外，SEJHJM葡萄酒和JHJM葡萄酒中的乙酸辛酯、壬酸乙酯、3-甲基丁基癸酸、甲基苯甲酸和丙酸己酯的含量没有显著差异（p>0.05），表明它们对两种葡萄酒的风味没有显著影响。与JHJM葡萄酒中的挥发性酸相比，SEJHJM葡萄酒中的辛酸含量显著降低（p<0.05），而1-己酸的含量显著增加（p<0.05），两组之间的癸酸含量没有显著变化（p>0.05）。这三种物质的OAV都低于1.0，表明它们的浓度变化不会显著影响味道。JHJM葡萄酒和SEJHJM葡萄酒中的三种挥发性醛类和两种挥发性酚类也没有显著变化（p>0.05），包括苯甲醛、2,4-二甲基苯甲醛、乙醛和4-乙烯基酚。从表2可以看出，两种菌株的顺序组合发酵可以增强JHJM枸杞酒的白兰地风味并减弱香蕉风味。Se暴露可以进一步增强菠萝、椰子和白兰地的香气，同时减弱SEJHJM枸杞酒的梨子和香蕉风味。尽管OAV在0.1到1.0之间的化合物可能不会直接改变整体香气，但它们仍可能通过潜在的相互作用、协同效应或基质效应影响某些水果酒的风味。因此，进行了主成分分析（PCA），使用OAV大于0.1的化合物的含量或OAV来确定三种葡萄酒的差异程度和主成分。分析结果分别显示在表2-Fig.（3）和（4）中。无论使用含量还是OAV，都得到了相同的PC1和PC2，有效地区分了三种枸杞酒，PC1和PC2分别贡献了72.2%和23.9%的方差，累积贡献率超过95%。从表2-Fig.（3）和（4）可以看出，JM葡萄酒位于第一象限。其特征风味主要与异戊酸乙酯（OAV=143.01）、辛酸（OAV=1.12）、丁酸乙酯（OAV=2.58）、己酸乙酯（OAV=225.18）、月桂酸乙酯（OAV=0.72）、苯乙酸乙酯（OAV=0.90）和甲基辛酸（OAV=0.17）等化合物相关。除了上述OAV大于1.0的化合物外，其他OAV在0.1到1.0范围内的化合物，如月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯和甲基辛酸，也参与了枸杞酒的特征风味。甲基辛酸和甲基己酸仅在水JM葡萄酒中检出，增强了某种甜橙风味。水JHJM和SEJHJM葡萄酒中的月桂酸乙酯和苯乙酸乙酯的浓度显著高于JM葡萄酒（p<0.05），增加了某种葡萄和玫瑰风味。JHJM葡萄酒位于第三象限。其特征风味与以下化合物密切相关：己酸乙酯（OAV=56.66）、辛酸乙酯（OAV=1867.08）、苯甲酸乙酯（OAV=0.46）、甲基苯甲酸（OAV=0.35）和壬酸乙酯（OAV=0.83）。除了OAV大于1.0的己酸乙酯和辛酸乙酯外，OAV在0.1到1.0范围内的苯甲酸乙酯和甲基壬酸也参与了枸杞酒的特征风味。JHJM葡萄酒中的苯甲酸乙酯浓度显著高于JM和SEJHJM葡萄酒（p<0.05），赋予了一种冬青油和依兰油的风味。JHJM葡萄酒中的甲基苯甲酸和壬酸乙酯的浓度显著高于JM葡萄酒（p<0.05），与SEJHJM葡萄酒相比没有显著差异（p>0.05）。它们增加了某些花香和樱桃风味以及香蕉和梨子风味。SEJHJM葡萄酒位于第二象限。其特征风味与以下化合物密切相关：癸酸乙酯（OAV=6.25）、2-甲基丙基辛酸酯（OAV=32.66）和丙酸乙酯（OAV=0.51）。除了OAV大于1.0的癸酸乙酯和2-甲基丙基辛酸酯外，只有OAV在0.1到1.0范围内的丙酸乙酯也参与了枸杞酒的特征风味。SEJHJM葡萄酒中的丙酸乙酯浓度显著高于JM和JHJM葡萄酒（p<0.05），赋予了菠萝香气。分析结果解释了OAV在0.1到1.0之间的挥发性物质对三种枸杞酒风味的不同影响。感官分析
枸杞酒的感官评估从四个方面进行：外观、香气、口味和酒体特性。所得结果列于表3中。可以看出，JM、JHJM和SEJHJM酒的得分分别为73.80±3.44、82.30±3.45和84.90±1.95。与JM酒相比，JHJM和SEJHJM酒在颜色和香气方面的得分显著提高（p<0.05）。SEJHJM酒的香气得分最高，但JHJM和SEJHJM酒之间没有显著差异。JM酒呈淡黄色，清澈透明，没有明显的沉淀物。相比之下，混合发酵组的颜色更深，呈玫瑰色调，同样清澈透明，也没有明显的沉淀物。尽管JM酒口感平衡，但其香气相对简单，缺乏足够的发酵香味。JHJM酒展现出丰富复杂的果香，酒体和谐顺滑，口感圆润，风味独特。SEJHJM酒则具有浓郁的果香，并伴有微妙的花香和草本香气，口味和质地都十分平衡。
表3. 三种枸杞酒的感官评分
| 酒类 | 外观 | 香气 | 口味 | 酒体 | 总分 | 描述 |
|------------|----------------|------------------|------------------|------------------|-----------------------------|
| JM | 淡黄色，清澈透明，无沉淀物，轻果香，酸甜平衡 | 5.00±1.25b | 8.20±0.21a | 22.50±1.46b | |
| JHJM | 玫瑰色，清澈透明，无沉淀物，具有枸杞果香，口感顺滑 | 8.60±1.25a | 8.00±0.17a | 25.70±0.59a | |
| SEJHJM | 玫瑰色，清澈透明，无沉淀物，果香浓郁，花香和草本香气交织 | 8.20±0.71a | 8.10±0.47a | 25.90±0.94a | |
**3. 硒（Se）对E. cristatum蛋白质表达的影响**
在本研究中，富硒的E. cristatum SHBCC D1508和富硒的S. cerevisiae HYJ-2中的硒含量分别为189.60 μg/g和462.26 μg/g。这两种菌株中的主要硒形式是硒半胱氨酸（Sec）和硒甲硫氨酸（SeMet）（数据未显示）。Sec和SeMet都参与了某些硒蛋白的合成，如谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx1-4），并在生物体内发挥重要的抗氧化功能（Borchert等人，2018年）。换句话说，硒暴露可能会导致富硒E. cristatum和富硒S. cerevisiae的蛋白质组发生部分变化。我们团队之前已经报道了富硒S. cerevisiae菌株中的硒蛋白（Zhang等人，2023年）。因此，本研究探讨了富硒E. cristatum与普通E. cristatum之间的蛋白质组差异，结果展示在表4-图1中。在富硒E. cristatum的蛋白质组中观察到一个位于15至25千道尔顿（kDa）之间的条带（用红色框标记），而在普通E. cristatum的蛋白质组中则没有这个条带。该条带被切下，用胰蛋白酶消化后通过LC-MS/MS鉴定，结果列于表4中。鉴定出的目标蛋白是小热休克蛋白20（HSP20），该蛋白主要参与生物过程和应激反应。
表4. E. cristatum与富硒E. cristatum的蛋白质组表达差异
| 蛋白质 | 表达谱 | 鉴定信息 | 结果 | 匹配排名 | 独特肽数量 | 唯一序列覆盖率 [%] | 最高分 | 分子量 [kDa] | 序列长度 | 蛋白质家族 |
|--------------|------------------|------------------|------------------|---------------|--------------|-----------------|-------------|----------------|----------------|-------------------|
| HSP20 | involved in various biological processes | 93.20 | 4 | 171 | 30 kDa | | 19.42 | | heat shock protein |
| | | | | | | | | |
**注：** 图中从左到右的蛋白条带分别为蛋白标记、普通E. cristatum蛋白和富硒E. cristatum蛋白。HSP20已被证明参与催化多种生化反应，如细胞呼吸、基因表达、固氮作用和辅因子生物合成（Amy等人，2021年；Huynen等人，2001年）。根据这些发现，可以推断硒摄入影响了富硒E. cristatum中某些酶的活性，进而影响了枸杞酒的发酵性能并改变了其风味。类似地，根据我们之前的研究（Zhang等人，2023年），硒暴露也改变了富硒S. cerevisiae的蛋白质组表达谱，进一步影响了发酵性能，导致酒中风味化合物的种类或含量发生变化，可能产生有益、中性或不利的影响，这些现象此前很少有报道。本研究发现，某些挥发性化合物显著增加，有些显著减少，而有些则保持不变。通过对显著不同的挥发性化合物的OAV分析，发现硒暴露赋予枸杞酒更明显的椰香、菠萝香和白兰地香。
**4. 讨论**
颜色是果酒最重要的品质之一，也是消费者选择的重要依据。传统酵母发酵的枸杞酒颜色通常是淡黄色，远不如深红色诱人。因此，中国消费者在节日宴会上难以选择这种酒。葡萄和蓝莓酒的颜色主要由花青素及其衍生物决定（Sun等人，2022年）。枸杞果实不含花青素，导致传统酵母发酵的枸杞酒缺乏鲜艳的色素。因此，除非添加人工色素，否则很难改变枸杞酒的淡黄色。大多数天然色素通常比合成色素更安全、成本更低，甚至可能具有某些药用价值（Poorniammal等人，2021年）。本研究通过E. cristatum的发酵，将枸杞酒的淡黄色自然转变为玫瑰色，这是一种创新，提供了更具成本效益的替代方案。红茶中的颜色变化主要是由于茶多酚（如（+）-儿茶素）氧化聚合形成茶黄素（Chen等人，2024年）。然而，JM酒中的（+）-儿茶素含量相对于原始果汁有所增加，而在JHJM酒中减少；但在SEJHJM酒中显著增加。两组酒之间的颜色没有显著差异，因此这一机制不适用。因此，E. cristatum发酵过程中枸杞酒的颜色变化可能与多种酚类的氧化有关。
以往的研究探讨了S. cerevisiae与非酿酒酵母的共发酵在 fruit wine 和其他酒类中的应用。例如，共发酵提高了柑橘酒中的高级醇和酯的含量（Hu等人，2020年），并促进了酯的形成同时抑制了白酒中的酸生成（C. Chen等人，2022年）。然而，有机酸和多酚的组成变化以及挥发性化合物对酒的风味和感官评估的影响至今很少有研究。本研究采用E. cristatum和S. cerevisiae的顺序发酵生产了JHJM枸杞酒，结果发现乳酸和柠檬酸的含量显著增加，改善了口感，提高了枸杞酒的喜爱度。多酚化合物具有良好的生物和药理活性（Rocchetti等人，2018年）。E. cristatum和S. cerevisiae的顺序发酵增加了总多酚含量，尤其是咖啡酸和绿原酸的水平。咖啡酸是一种天然有机化合物，具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌和降血脂及降血糖作用（Pavlíková，2022年）。此外，作为一种天然抗氧化剂，咖啡酸可用于食品保存和加工，延长食品的保质期，改善其颜色和口味，并增强营养价值。绿原酸作为一种天然食品添加剂，常用于各种食品的生产中，以提升风味和质地。此外，绿原酸还具有抗氧化能力，能清除体内的自由基并减轻氧化应激对细胞的损害（Heitman & Ingram，2016年）。目前EFSA和JECFA尚未为咖啡酸和绿原酸设定ADI或UL（Behne等人，2023年）。因此，可以得出结论，E. cristatum和S. cerevisiae的顺序发酵具有生产功能性饮料的潜力。此外，这种顺序发酵的优势在于显著增强了JHJM和SEJHJM酒中的梨香、菠萝香、奶油香和花香，而缺点是香蕉香和椰香显著减弱。因此，E. cristatum和S. cerevisiae的顺序发酵也可以用于生产梨香和菠萝味的饮料。
**研究的局限性**
本研究的一个局限性是尚未研究JHJM和SEJHJM酒的功能。另一个局限性是尚未进一步研究硒积累对富硒E. cristatum和S. cerevisiae的蛋白质组和代谢物变化的影响。下一步将进行细胞实验，进一步验证富硒枸杞酒的功能特性，并进一步探索硒积累对蛋白质组和代谢物的影响。
**5. 结论**
可以得出以下结论：
(1) E. cristatum能够在不添加人工色素的情况下将传统枸杞酒的淡黄色转变为吸引人的玫瑰色。
(2) E. cristatum显著降低了果汁酸、乙酸和琥珀酸的含量，同时增加了乳酸的含量，使酒体口感柔和，酸度降低，从而提高了枸杞酒的口感和接受度。
(3) E. cristatum和S. cerevisiae的联合顺序发酵显著增加了芦丁、没食子酸、对香豆酸和咖啡酸的含量，尽管（+）-儿茶素和阿魏酸的含量相对于单独用S. cerevisiae发酵的JM酒有所减少。
(4) 两种菌株的联合顺序发酵主要增强了白兰地和菠萝风味、某些花香、樱桃风味以及梨香味，同时减弱了香蕉香味。
(5) 富硒E. cristatum和S. cerevisiae的联合顺序发酵并未显著改变SEJHJM酒的颜色、清澈度或风格，但显著改善了其香气和口味，特别是增强了菠萝香、椰香和白兰地香，这可能是由于硒暴露导致其蛋白质组表达的部分变化。本研究提供了一种非常有效且创新的方法来提高枸杞酒的质量，并为E. cristatum在酿酒领域的应用开辟了新的途径。
**伦理声明**
本感官评估研究遵循《赫尔辛基宣言》的伦理原则。需要注意的是，根据中国监管要求，普通食品的感官评估不属于强制伦理审查范围，因为它不涉及身体伤害、敏感个人信息或实验干预。本研究遵守了《涉及人类的生命科学和医学研究的伦理审查措施》（中华人民共和国国家卫生健康委员会）。在参与研究之前，所有评委（n = 10）都收到了详细的知情同意书，说明了研究目的、程序、潜在风险、益处以及他们随时自愿退出的权利。每位参与者在确认理解研究细节后均签署了书面知情同意书。所有感官样品符合国家食品安全标准，可安全食用。参与者的个人信息被匿名处理和编码，以确保保密性，研究结果和出版物中未包含可识别数据。评委获得了适当的报酬，研究期间的一切询问都得到了及时回应。
**资助来源**
本研究得到了宁夏特色复合果酒关键技术研究项目（20240112301451）、宁夏特色复合果酒关键酿造技术新产品研究项目（NKYG-24-08）以及宁夏重点研发项目（2025FRF05011）的支持。
**作者声明**
我们声明本稿件是原创的，尚未发表，也未在其他地方考虑发表。我们确认所有署名作者都已阅读并批准了本稿件，且不存在其他符合作者资格但未列入名单的人。我们进一步确认稿件中作者的排序已得到所有人的同意。我们理解通讯作者是编辑流程的唯一联系人。他负责与其他作者沟通研究进展、提交修改内容以及最终审核论文版本。
**CRediT作者贡献声明**
张欣：方法论、形式化分析。
冯娇：形式化分析。
李阿博：形式化分析。
赵志慧：资源获取、数据调研。
王嘉树：资源获取、数据调研。
毛双喆：写作——审稿与编辑、撰写——初稿、概念构建。
董建国：资源获取、数据管理。
魏庆凯：写作——审稿与编辑、撰写——初稿、概念构建。
刘建华：资源获取、数据管理。
张涵：写作——审稿与编辑、结果验证。
胡中秋：写作——审稿与编辑、项目监督、资金筹措。
孙梦梦：方法论、形式化分析。
蔡静仪：方法论、形式化分析。
郭旭萌：结果验证。
崔海晨：撰写——初稿、概念构建。
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