摘要
引言
幽门螺杆菌（H. pylori）感染在全球范围内非常普遍，并与多种胃十二指肠病理相关，包括胃癌。H. pylori 对药物的抗药性不断增加，这限制了可用的治疗选择。为了克服这一挑战，重新利用现有药物以及将当前药物作为辅助疗法已成为一种有价值的替代策略。二甲双胍是一种常用的2型糖尿病（T2DM）抗糖尿病药物，研究表明它具有抗菌特性。本研究旨在探讨二甲双胍的抗H. pylori活性，并评估其增强六种常规抗生素治疗效果的潜力。
方法
通过检测最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）来评估二甲双胍对H. pylori的抗菌效果，使用了临床和参考实验室菌株。此外，还进行了棋盘实验以评估二甲双胍与六种常规抗生素联合使用的效果。
结果
二甲双胍对H. pylori的抗菌活性有限，其MIC和MBC值介于6.83至9.75 mM（1131–1615 μg/mL）之间。MIC/MBC比值和时间杀灭研究表明其对测试的H. pylori菌株具有杀菌效果。对于所测试的组合，分数抑制浓度指数（FICI）为0.52–1.0（包括MDR菌株），表明存在叠加效应。未观察到协同或拮抗作用。
结论
二甲双胍的叠加效应和杀菌活性表明，对于已经接受这种药物治疗的糖尿病患者来说具有潜在的临床意义。然而，需要进一步的研究来全面评估其安全性、有效性以及其对H. pylori的杀菌机制。MBC（最低杀菌浓度）
在确定了MIC（最小抑制浓度）之后，按照之前的描述[30]进行了MBC测试。为了确定MBC，从MIC之前的最后一个混浊孔中取100 μL样本，以及4个没有可见生长的孔（浓度为MIC的1倍到8倍）进行再培养。还在琼脂板上设置了生长对照以检查纯度。每个样本被涂布在不含抗生素的淋病球菌（GC）琼脂基底（M434，Himedia，印度）上，并添加了2%的血红蛋白[31]。然后将在微需氧条件下于37°C孵育3天。孵育后，通过宏观观察来确定MBC，即能够使细菌菌落数量减少99.9%的最小浓度。通过标准平板计数法验证了菌落数量的减少。所有MBC测试都重复进行了三次。计算了二甲双胍的MBC/MIC比率，以确定其作用是杀菌性的（< 4）还是抑菌性的（≥ 4）[32]。
2.5. 杀菌动力学测定
为了评估二甲双胍对幽门螺杆菌的杀菌动力学，根据Feng等人的方法[33]对参考菌株（ATCC 700824）进行了时间-杀菌研究，并稍作修改。简要来说，在12孔板上，将细菌细胞（1×10^5 CFU/mL）接种到含有10% FBS的MHB培养基中，分别在有和没有二甲双胍的情况下进行培养，然后在37°C下微需氧条件下以120 rpm的速度摇动孵育72小时。幽门螺杆菌细胞暴露于培养基（对照）或二甲双胍（1倍MIC和2倍MIC）下0、4、18、24和72小时。对于每个样本，吸取100 μL并连续稀释10倍。随后，用玻璃刮刀将每个稀释液接种到含有7%血的外凝马血的Columbia琼脂基底表面；在微需氧条件下孵育6天以形成独立菌落。最后，计数菌落，并将结果表示为Log10（CFU/mL）并与时间作图。结果是三次独立测定的平均值。
2.6. 二甲双胍-抗生素组合
使用棋盘式肉汤微量滴定法，对二甲双胍与六种选定的抗生素（甲硝唑、阿莫西林、利福平、四环素、左氧氟沙星和克拉霉素）之间的潜在体外相互作用进行了评估，并对先前的协议进行了少量修改[29, 34, 35]。该实验使用两种参考幽门螺杆菌菌株（ATCC 43504和700824）和三种临床分离株（S1、S2和S3）进行。培养基、孵育条件和接种浓度与MIC实验中使用的相同。简要来说，在无菌的96孔微孔板中，二甲双胍沿着Y轴（行）连续稀释两倍，浓度范围从2×MIC到1/32×MIC。抗生素同样沿着X轴（列）连续稀释两倍，浓度从2×MIC到1/1028×MIC。每个孔接种100 μL的幽门螺杆菌悬浮液。通过混合50 μL的相关抗生素和50 μL的二甲双胍来生成双重组合孔。第H行和第11列分别用于仅含二甲双胍和仅含抗生素的对照。还包括生长对照（孔A-B，第12列）和无菌对照（孔C-D，第12列）。孵育后，使用分光光度计在600 nm处确定每个孔的MIC，即没有可见生长的最低浓度。通过计算FICI（联合抑菌指数）来评估组合效果，FICI定义为每种测试药物的FIC之和。二甲双胍的FIC计算为组合中的二甲双胍MIC除以其单独的MIC；类似地，抗生素的FIC计算为组合中的抗生素MIC除以其单独的MIC。如果(FICI ≤ 0.5)，则认为相互作用是协同的；如果(0.5 > FICI ≤ 1)，认为是加性的；如果(1 < FICI ≤ 4)，认为是中性的；如果(FICI > 4)，认为是拮抗的[36, 37]。所有组合研究都重复进行了两次以确保可重复性。
2.7. 伦理考虑
本研究获得了An-Najah国立大学（参考编号：Mas. April 2024/22）的机构审查委员会（IRB）和An-Najah国立大学医院（NNUH）的临床研究中心（CRC）的批准（参考编号：CRC_2024_0332）。研究遵循所有相关的伦理指南和规定，并符合赫尔辛基宣言。
2.8. 参与同意
使用在An-Najah国立大学医院（NNUH）进行常规胃镜检查的患者的胃活检样本来分离幽门螺杆菌。参与研究的同意并提供书面同意书是入组研究的必要条件。三种幽门螺杆菌临床菌株及其抗生素谱的结果用于指导治疗方案。
3. 结果
3.1. 抗微生物药物的MIC和MBC
使用肉汤稀释法研究了两种参考菌株和三种临床菌株对六种不同抗微生物药物的敏感性，以确定MIC值。MIC和MBC结果总结在表1中。所有菌株都对四环素和利福平敏感。参考菌株对所有测试的抗生素都敏感，除了甲硝唑，ATCC 43504对其具有抗性。值得注意的是，所有临床分离株都对甲硝唑具有抗性。临床分离株S1是一种多药耐药菌株，对甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素和左氧氟沙星具有抗性。相比之下，S3分离株同时对甲硝唑和克拉霉素具有抗性。总体而言，三种临床菌株中有两种（S1和S3）对克拉霉素具有抗性。
表1. 使用肉汤稀释法测试的六种抗微生物药物对两种参考菌株和三种临床菌株的最低抑制浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。
抗微生物药物 | 平均MIC ± SD μg/mL | MBC μg/mL | 敏感性
参考菌株 | 临床菌株
ATCC 43504 | 46.9 ± 18 | 0.61 ± 0.24 | 39.06 ± 15.6 |
ATCC 700824 | 62.5 | 1.9 | 62.5 | 31.25 |
S1 | 46.9 ± 18 | 0.61 ± 0.24 | 39.06 ± 15.6 |
S2 | 62.5 | 1.9 | 62.5 | 39.06 ± 15.6 |
S3 | 46.9 ± 18 | 0.61 ± 0.24 | 39.06 ± 15.6 |
AMX | 0.02 ± 0.006 | 0.005 ± 0.001 | 0.78 ± 0.04 |
CLA | 0.068 ± 0.019 | 0.052 ± 0.02 | 5 ± 0 |
TCN | 0.11 ± 0.031 | 0.06 ± 0.03 | 0.11 |
RIF | 0.521 ± 0.18 | 0.521 ± 0.18 | 0.625 |
LVF | 0.24 ± 0.097 | 0.122 ± 0.04 | 21.88 |
TCN | 0.11 ± 0.031 | 0.06 ± 0.03 | 0.11 |
LEV | 0.24 ± 0.097 | 0.122 ± 0.04 | 21.88 |
3.2. 二甲双胍的MIC和MBC
为了研究二甲双胍对多种幽门螺杆菌菌株的抗菌活性，使用肉汤稀释法确定了MIC和MBC。如表2所示，二甲双胍对参考菌株和临床菌株均表现出抗菌活性。二甲双胍的MIC范围为6.83至9.75 mM（1131–1615 μg/mL），包括多重耐药（MDR）分离株。MBC值与MIC值相匹配；MBC/MIC比为1，表明二甲双胍对幽门螺杆菌具有杀菌活性。总之，这些发现证明了二甲双胍能够抑制各种幽门螺杆菌菌株，无论其抗生素耐药性如何。
表2. 使用肉汤稀释法测试的二甲双胍对两种参考菌株和三种临床菌株的体外最低抑制浓度（MICs）和杀菌浓度（MBCs）及MBC/MIC比率。
分离株 | 二甲双胍MIC（mM） | 二甲双胍MIC（μg/mL） | MBC（mM） | MBC/MIC比率 | 相互作用
ATCC 43504 | 9.75 ± 3.9 | 9.75 ± 3.9 | 1 | 杀菌性
ATCC 700824 | 9.75 ± 3.9 | 9.75 ± 3.9 | 1 |
S1 | 7.81 ± 0 | 1293 ± 0 | 7.81 ± 0 |
S2 | 6.83 ± 1.95 | 1131 ± 323 | 6.83 ± 1.95 |
S3 | 7.81 ± 0 | 1293 ± 0 | 7.81 ± 0 |
注：MBC/MIC比率 ≤ 4表示具有杀菌效果，如果MBC/MIC比率 > 4，则表示具有抑菌效果。
3.3. 杀菌动力学
为了评估不同浓度的二甲双胍对幽门螺杆菌的杀菌速率，针对参考菌株ATCC 700824进行了动力学时间-杀菌研究。如图1所示，对照组幽门螺杆菌细胞在孵育的前48小时内呈指数生长阶段；CFU/mL从基线的5 log10增加到超过10 log10。用1-2倍MIC的二甲双胍处理后，细菌负荷以剂量依赖性方式减少。暴露于1倍MIC的二甲双胍的幽门螺杆菌在<72小时内逐渐减少到3-log10。此外，在初始下降后，细胞计数持续保持较低水平，表明具有持续但较慢的杀菌活性（时间依赖性）。同时，用2倍MIC的二甲双胍处理的幽门螺杆菌在<20小时内使生存力减少了约5 log10；这反映了快速的杀菌活性，计数在18小时内降至检测限以下（0 log10）。这种效果在整个72小时内保持，证实了二甲双胍的快速且完全的杀菌活性。
3.4. 二甲双胍-抗生素组合的协同作用测试
使用棋盘式肉汤稀释法评估了二甲双胍与选定的抗生素之间的体外相互作用，使用了之前测试的相同幽门螺杆菌菌株。结果显示在表3中。二甲双胍与每种抗生素的组合导致MIC值降低，但未观察到协同作用或拮抗作用。组合的FICI值介于0.52至1.56之间。0.52到1.0之间的结果表明具有加性效应。除了其抗糖尿病作用外，许多研究还强调了二甲双胍的抗菌活性及其作为辅助药物增强现有抗生素对多重耐药（MDR）病原体作用的潜力。这种抗菌潜力已在多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中观察到[13, 14, 47–51]。然而，其对幽门螺杆菌（H. pylori）的活性尚未得到充分探索。因此，本研究旨在调查二甲双胍对幽门螺杆菌的活性，并评估其与常用的一线和二线治疗方案中六种抗生素联合使用的协同潜力。在本研究中，二甲双胍对幽门螺杆菌参考菌株的最低抑制浓度（MIC）为9.75 mM（1615 μg/mL），而对临床菌株的MIC为6.83–7.81 mM（1131–1293 μg/mL）。这些发现表明二甲双胍可能对幽门螺杆菌具有抗菌活性，包括多重耐药菌株。这与Courtois等人的研究结果一致，他们通过体内和体外实验表明二甲双胍具有直接的抗幽门螺杆菌作用。他们的纸盘扩散实验显示，在0.5和1 mM浓度下具有抗菌活性，而在0.1 mM浓度下则没有效果。在同一报告中，生存曲线数据显示10 mM的二甲双胍显著减少了处理细胞中的幽门螺杆菌数量[52]。此外，先前的一项研究报告称，在感染幽门螺杆菌的小鼠中，口服二甲双胍成功地改变了肠道微生物群组成[12]。然而，我们的发现与Valadbeigi等人最近发表的报告不同，后者的研究评估了二甲双胍对克拉霉素耐药的幽门螺杆菌的抗菌活性，报告的MIC值高于我们研究中的值[18]。这些差异可能是由于多种因素造成的。虽然两项研究都使用了肉汤稀释法，但不同的实验方案（如接种密度、培养基组成、培养时间和菌株异质性）可能会影响结果[53]。此外，二甲双胍溶液的pH值和溶剂的选择也可能导致MIC值的差异[54]。在我们的研究中，二甲双胍的最低杀菌浓度（MBC）与其MIC相同，反映了其对测试的幽门螺杆菌菌株的杀菌活性。Masadeh等人也对MRSA和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）报告了类似的杀菌潜力[13]。同样，在猪链球菌（Streptococcus suis）中也观察到了杀菌效果[55]。相比之下，吴等人未能检测到二甲双胍对粪肠球菌（Enterococcus fecalis）的杀菌潜力[56]，可能是因为他们的浓度范围没有超过MIC。进一步地，我们的时间-杀菌曲线结果显示，2X MIC浓度的二甲双胍可以显著杀死幽门螺杆菌ATCC 700824，这种杀菌效果在72小时内持续存在，证实了没有再生长以及可能抑制耐药突变体的选择。观察到的杀菌活性可能表明其作用机制涉及攻击对细菌生存至关重要的成分，包括质膜、细胞壁、DNA/RNA合成甚至蛋白质合成[57]。最近的一项转录组分析揭示了二甲双胍能够积极降低与大肠杆菌菌株质膜完整性相关的基因表达及其他代谢基因的表达，从而增强其杀菌活性[58]。此外，分子对接分析描述了二甲双胍与多个幽门螺杆菌靶蛋白的相互作用，这些靶蛋白具有杀菌活性，包括参与生产必需芳香氨基酸和叶酸的莽草酸途径中的酶（如莽草酸激酶和chorismate合成酶[59]）以及蛋白质合成过程的关键酶肽脱甲酰酶[60]。然而，二甲双胍对幽门螺杆菌的具体杀菌机制仍需进一步阐明。如果进一步分析证实，二甲双胍能够对敏感和多重耐药的幽门螺杆菌菌株发挥杀菌作用，那么它可能具有治疗潜力[61]。特别是如果其与抗生素联合使用能够产生协同杀菌效果，在较低剂量下增强杀菌效果，则这一发现尤为重要[62]。多项提出的机制分析表明，当二甲双胍与β-内酰胺类抗生素联合使用时，可能通过抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）的外排泵（例如tet(B)基因）来介导协同作用[58]；在多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida）中，多西环素联合使用时也观察到了类似的协同作用，从而增加了膜的通透性[63]。另一方面，二甲双胍的杀菌活性可用于设计内镜室和胃镜设备的新表面消毒剂[64]。通过FICI（Fractional Inhibitory Index）分析确定了二甲双胍与不同抗生素之间的相互作用。FICI值介于0.56到1.0之间，表明二甲双胍与这六种测试抗生素（阿莫西林、克拉霉素、四环素、甲硝唑、左氧氟沙星和利福平）联合使用时具有叠加效应。这些叠加效应与细菌菌株的耐药模式无关，因为无论是参考菌株还是临床分离株（包括多重耐药菌株S1）都观察到了类似的结果。二甲双胍与甲硝唑联合使用在五种菌株中的四种中显示出叠加效应，而与其他抗生素的联合使用则在三种和两种菌株中显示出叠加效应。未显示叠加相互作用的其余分离株的FICI结果为1 > FICI ≤ 1.56，表明为中性相互作用；未检测到拮抗或协同作用。迄今为止，只有一项最新研究调查了二甲双胍与阿莫西林联合使用对抗幽门螺杆菌的效果。与我们的发现相反，该研究报告称联合使用的协同作用很强，FICI值为0.34，表明二甲双胍能够增强阿莫西林对幽门螺杆菌的疗效[18]。在我们的研究中，相同联合使用的FICI值为0.52和0.76，也表明具有叠加效应。研究间FICI结果的差异可能是由于多种因素造成的，包括菌株异质性、不同的耐药机制以及实验方案（如细胞密度、培养基组成和培养条件）的变化。此外，联合使用的二甲双胍和阿莫西林的浓度以及工作溶液的pH值也可能导致FICI值的差异[65]。另一方面，多项先前的研究报道了二甲双胍与多西环素联合使用的辅助活性。在其中一项研究中，二甲双胍被确定为一种新的增强剂，可增强四环素对携带tet(A)耐药基因的多重耐药革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的活性。该研究检测到与所有测试的四环素（除替加环素外）都有协同作用。然而，在四环素敏感菌株中观察到叠加效应[47]。这可以部分解释我们在二甲双胍与四环素联合使用中观察到的叠加效应，因为所有测试的幽门螺杆菌菌株均未表现出对四环素的耐药性。同样，Masadah等人报告称，将二甲双胍与包括多西环素和左氧氟沙星在内的抗生素联合使用对抗MRSA和铜绿假单胞菌时也观察到了协同效果[13]。Hossain等人也在体外、体内和计算机模拟模型中报告了二甲双胍-多西环素组合的协同作用，对抗枯草芽孢杆菌（Bacillus cereus）和鲍德志贺菌（Shigella boydii）[49]。相关研究中，研究人员探讨了这种协同作用的机制，发现二甲双胍可以增加抗生素的细胞内浓度，调节免疫反应，并抑制细菌外排泵的活性[47, 50, 51, 63]。类似地，将二甲双胍与米诺环素联合使用已被证明可以破坏鲍曼埃杆菌（A. baumannii）的外膜完整性并增加膜电位[14]。尽管这种协同作用在多重耐药革兰氏阳性和革兰氏阴性分离株中得到了充分记录，但这些发现可能不直接适用于幽门螺杆菌。因此，需要进一步的研究来验证这些组合对幽门螺杆菌的效果。棋盘法实验结果显示这些组合没有拮抗作用；与我们的数据相反，有报道指出二甲双胍与左氧氟沙星联合使用对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）具有拮抗作用[52]。研究团队将这种拮抗作用归因于二甲双胍的抗氧化活性，后者降低了氟喹诺酮类的氧化应激介导的杀菌潜力[51]。二甲双胍的抗菌机制尚不完全清楚。然而，现有文献提出了几种假设，包括其可能激活AMPK、对结核分枝杆菌（M. tuberculosis）产生ROS（活性氧）[19]，以及其抗毒力特性，包括抑制革兰氏阴性细菌（如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌）的生物膜形成[20, 21, 58]。此外，Shafik等人报告二甲双胍在减少肺炎克雷伯菌产生的尿素酶方面发挥了重要作用[21]。对于幽门螺杆菌，有研究表明二甲双胍可能下调cagA基因的表达[18]。在同一背景下，患有幽门螺杆菌感染的患者服用二甲双胍还被证明可以抑制PTEN启动子的甲基化，此外还能减少ROS并抑制基质金属蛋白酶10，从而可能降低胃炎和胃癌的风险[66, 67]。未来研究应重点关注二甲双胍抗幽门螺杆菌活性的机制评估。我们的未来工作将集中于二甲双胍对幽门螺杆菌生物膜形成、尿素酶产生及其他毒力因子（包括cagA基因）的表型和基因型评估。
5. 强项与局限性
本研究的优点之一是使用了临床菌株和参考菌株来评估二甲双胍对幽门螺杆菌的抗菌活性，包括敏感菌株、耐药菌株和多重耐药菌株。此外，实施棋盘法实验为量化二甲双胍-抗生素组合提供了系统化的框架。最后，时间-杀菌实验提供了二甲双胍杀菌活性的动态评估。然而，该研究也存在一些局限性：临床分离株的数量较少，限制了结果的可推广性，特别是考虑到幽门螺杆菌群体内的显著遗传多样性。因此，未来的研究应纳入更多的临床分离株，并进行23S rRNA、gyrA和rdxA基因等耐药标记的基因型分析，以加强现有发现并包括相关的统计分析。另一个局限性是测试的分离株中没有任何四环素耐药菌株。此外，通过体内研究验证二甲双胍的抗幽门螺杆菌效果以及全面评估其潜在毒性是必要的。最后，研究中使用的二甲双胍浓度（MIC）范围为6.83至9.75 mM（1131–1615 μg/mL），高于典型的系统水平，可能无法直接反映临床应用性。然而，其在胃肠道中的浓度可能是血浆中的10到300倍；先前的研究报告称，由于低生物利用度和部分吸收，其肠道腔内的浓度范围为10至50 mM[68]。因此，这些浓度仍适用于探索胃肠道内的潜在局部效应以及体外环境中的潜在协同作用。
6. 结论
据我们所知，这是第一项研究二甲双胍与六种常见传统抗生素联合使用对抗幽门螺杆菌感染的潜在协同作用的研究。重要的是要指出，在体外实验中，二甲双胍显示出直接但弱的抗幽门螺杆菌活性，并且与所有测试的抗生素联合使用时具有叠加效应，而在测试的分离株之间没有拮抗作用。在糖尿病患者中，二甲双胍可能同时提供血糖控制的优势和帮助抵抗感染。然而，需要进一步研究来探索其疗效和安全性。
名词解释：
- H. pylori：幽门螺杆菌
- ADA：美国糖尿病协会（American Diabetes Association）
- WHO：世界卫生组织（World Health Organization）
- DM：糖尿病（Diabetes mellitus）
- AMPK：腺苷单磷酸化激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase）
- ROS：活性氧（Reactive oxygen species）
- ATCC：美国典型培养收集（American-Type Culture Collection）
- DMSO：二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide）
- MIC：最低抑制浓度（Minimal inhibitory concentration）
- MBC：最低杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration）
- FICI：分数抑制浓度指数（Fractional Inhibitory Index）
- NNUH：安-纳贾国家大学医院（An-Najah National University Hospital）
- BHI：脑心灌注（Brain-heart infusion）
- FBS：胎牛血清（Fetal bovine serum）
- EUCAST：欧洲抗菌药物敏感性测试委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing）
- MNZ：甲硝唑（Metronidazole）
- TCN：四环素（Tetracycline）
- LEV：左氧氟沙星（Levofloxacin）
- RIF：利福平（Rifampicin）
- AMX：阿莫西林（Amoxicillin）
- CLA：克拉霉素（Clarithromycin）
- S：敏感（Susceptible）
- R：耐药（Resistant）
- CRC：临床研究中心（Clinical Research Center）致谢
作者感谢安-纳贾赫国立大学（https://www.najah.edu）的医学院及附属医学科学学院、研究生院，以及安-纳贾赫国立大学医院（https://www.nnuh.org）在本次研究过程中所提供的支持与协助。资金情况
本研究未获得任何外部 funding，但得到了安-纳贾赫国立大学的资助，作为博士研究生项目的一部分。伦理声明
本研究已获得安-纳贾赫国立大学机构审查委员会（IRB，参考编号：Mas. April 2024/22）和安-纳贾赫国立大学医院临床研究中心（NNUH，参考编号：CRC_2024_0332）的批准。研究过程遵循了所有相关的伦理准则和规定，并符合《赫尔辛基宣言》的要求。知情同意
本研究使用了在安-纳贾赫国立大学医院接受常规胃镜检查的患者样本中的胃活检组织来分离幽门螺杆菌（H. pylori）。参与研究的患者的书面同意书是必须的。根据分离出的三种幽门螺杆菌菌株及其对抗生素的敏感情况，制定了相应的治疗方案。每位参与者在参与研究前都被告知了研究的目的，并通过签署同意书表达了他们的同意。利益冲突
作者声明不存在任何利益冲突。数据可用性声明
用于支持本研究结果的数据已包含在论文中。如需了解关于数据可用性的更多细节（包括如何获取本研究中分析的原始数据），请联系通讯作者 Mohammad Qadi（m.qadi@najah.edu）。补充信息
额外的支持性信息可在线查阅“补充信息”部分。
