蔡云丽|赵亚楠|张旭|高文琪|李雪|刘玲爽
青岛大学附属医院口腔科，中国青岛266000
**摘要**
牙本质过敏（DH）的特点是由于暴露的牙本质受到各种外部刺激而引起的牙齿不适。牙本质暴露于口腔环境中会破坏胶原纤维的完整性。因此，管理DH的理想策略必须优先恢复胶原的完整性，实现牙本质矿化，并确保牙本质小管的长期封闭。为了探索更有效的治疗策略，本研究开发了一种胺功能化的中孔二氧化硅纳米系统，用于输送聚天冬氨酸稳定的无定形磷酸钙（PASP-ACP@AF-HMS），并使用原花青素（PA）来维持胶原的结构完整性。随后进行了纤维内矿化实验、体外和体内牙本质实验以及生物相容性测试。PASP-ACP@AF-HMS能够有效储存和释放ACP前体，实现纤维内矿化，而PA则增强了这一过程。PASP-ACP@AF-HMS几乎完全封闭了牙本质小管，其与PA的联合使用则实现了更紧密的封闭。再矿化的牙本质表现出更好的耐磨性和抗酸性。PASP-ACP@AF-HMS显著恢复了脱矿牙本质的密封性和机械性能，其与PA的联合应用进一步提高了性能，接近天然牙本质的水平。生物相容性测试证实了PASP-ACP@AF-HMS的优秀安全性。动物研究也表明，PA和PASP-ACP@AF-HMS的联合使用产生了更有效的牙本质封闭效果。本研究表明，PA与PASP-ACP@AF-HMS纳米系统的协同使用能够更有效地实现牙本质再矿化和小管封闭，显示出治疗DH的显著临床潜力。
**1. 引言**
目前，牙本质过敏（DH）已成为牙科领域的一个普遍问题，引起了广泛关注。DH是指当暴露的牙本质受到酸/甜味物质、热/冷物质或机械力等外部因素刺激时所经历的短暂剧烈疼痛或不适[1]。临床上，它通常由磨牙症或楔形缺损等原因引起[2]，其患病率从1%到98%不等[3]。其发病机制主要通过流体动力学理论解释，该理论认为牙本质小管内的流体运动刺激了牙髓神经，从而引发疼痛[4]。因此，传统的脱敏策略主要集中在封闭牙本质小管以中断流体流动和神经冲动传递[5]。然而，目前的治疗方法——包括化学制剂、激光疗法、修复程序和外科干预——效果有限，且长期耐久性不足[6,7]。
牙本质是牙齿的主要组成部分，被外层的牙釉质包裹，并具有复杂的管状结构。由于牙釉质的丧失，牙本质长期暴露在不良的口腔环境中，这会破坏胶原的完整性[8]。除了胶原纤维网络的破坏外，DH还伴随着牙本质中羟基磷灰石（HAP）矿相的大量丢失以及钙离子/磷酸根离子组成的失衡[8][9][10]。我们寻求的治疗方法不仅能够缓解DH，还能提高脱矿牙本质的化学和机械稳定性，并具有长期效果。因此，管理和预防DH的理想策略必须优先恢复胶原的完整性，促进HAP在胶原网络中的沉积以实现牙本质再矿化，并确保牙本质小管的长期封闭。
目前，仿生再矿化技术在牙本质小管封闭方面受到了广泛关注，因为它能够高度模拟自然生理矿化过程并精确调节矿化条件[11][12][13][14][15]。牙本质矿化的策略已经得到了广泛研究，包括氟化物、琼脂糖水凝胶系统和释放无定形磷酸钙的树脂[16]。牙本质矿化分为纤维间矿化（胶原纤维之间的无序矿物相沉淀）和纤维内矿化（沿c轴定向有序排列的矿物），后者是牙本质生物矿化的基础，通常更具优势[17][18][19]。牙本质中的非胶原有机成分，如牙本质特异性鞘磷脂蛋白（DSPP），属于非胶原蛋白（NCPs），已知可以调节胶原支架的矿化，从而驱动牙本质组织的形成[20]。NCPs、无定形磷酸钙（ACP）和胶原纤维是纤维内矿化的必要成分[21,22]。ACP可以封闭小管并作为牙科生物矿物的前体[23][24][25]。作为NCP类似物，聚电解质具有相似的结构和理化性质[26,27]，这使它们能够稳定ACP并促进仿生矿化[28]。迄今为止，已经研究了多种NCP类似物——包括聚丙烯酸和聚天冬氨酸（PASP）——它们能够在特定位置调节无定形矿物前体的自发聚集，从而形成更均匀的纤维矿物沉积[29,30]。阴离子PASP通过模拟DSPP来稳定ACP，并促进纤维内矿化[31,32]。一项研究进一步证实，在PASP的作用下，ACP在I型胶原内形成，随后结晶为HAP[33]。这些发现表明PASP-ACP可能适用于再矿化和牙本质小管封闭，使其成为治疗DH的有希望的候选物。
然而，在矿化过程中将足够的聚合物稳定的ACP保留在牙本质表面仍然具有挑战性。基于溶液的仿生系统不适用于临床现场应用，因为频繁更换溶液是不可行的。因此，迫切需要设计一种高效的递送系统，既能储存和释放ACP前体，又能实现长期的小管封闭。中孔二氧化硅纳米颗粒由于其热/化学稳定性、有序的框架以及可以在颗粒表面和内部孔隙中功能化硅醇基团的能力，已被广泛用作酶、药物、蛋白质和基因的递送载体[34][35][36]。先前的研究已经证实了中孔二氧化硅在封闭牙本质小管方面的有效性，因为它具有机械性能和抗酸性质[37][38][39]。中孔二氧化硅（HMS）具有中空核心和中孔壳的独特结构[40]，由于其宽敞的中心空腔，作为聚天冬氨酸稳定ACP的理想递送纳米平台具有巨大潜力。
此外，在矿化之前，胶原的完整性和稳定性至关重要。脱矿牙本质的化学和机械稳定性应得到改善，以作为矿物沉积的可行支架[41]。糖胺聚糖（GAGs）被视为连续胶原纤维之间的桥接分子，有助于维持胶原的结构和机械完整性[42]。GAGs可能像SIBLING蛋白一样促进矿物离子在胶原中的聚集，因为两者都含有高度负电荷的基团，并能紧密结合胶原纤维[43,44]。由于天然GAGs的局限性，原花青素（PA）被优选为替代品，以模拟GAGs的交叉桥接和生物活性[45]。PA可以通过共价键和氢键连接和桥接胶原纤维，保持脱矿胶原的几何稳定性[46]。PA具有高度羟基化的结构，具有多个识别位点，能够螯合质子化的磷酸根和钙离子。PA处理过的胶原纤维与酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙溶液结合，不仅促进矿物吸收和沉积，还能成功诱导磷灰石的成核和形成[47]。PA交联显著保持了胶原纤维的机械和结构完整性，与钙磷酸盐聚合物诱导的液体前体（CaP-PILP）在仿生再矿化中协同作用[48]。
本研究旨在制备一种新型的PASP-ACP@AF-HMS纳米系统，并研究其与PA结合时的理化和矿化特性，用于DH治疗。在这里，我们首次报道了PASP-ACP@AF-HMS纳米系统的制备。通过体外和体内实验评估了该纳米系统在胶原纤维内矿化、牙本质小管封闭以及与人类牙髓干细胞（HDPSCs）的生物相容性方面的作用。本研究假设PA可能在保持胶原结构完整性的同时，功能性替代GAGs。与现有的仿生再矿化系统、PILP模型或基于中孔二氧化硅的治疗方法相比，PA与PASP-ACP@AF-HMS纳米系统的联合使用有望最大化胶原的纤维内矿化并促进牙本质修复。PA和PASP-ACP@HMS的联合使用为暴露牙本质的仿生防御层提供了有希望的好处和新的方法，用于DH管理。
**2. 材料与方法**
2.1. 化学试剂
所有实验中使用的化学试剂包括：氢氧化钠（NaOH，0.5M，Macklin，中国）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，Macklin，中国）、碳酸钠（Na2CO3，Macklin，中国）、正硅酸四乙酯（TEOS，Macklin，中国）、无水乙醇（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.，中国）、氨溶液（28%，Rhawn，中国）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，分子量221.37，Macklin，中国）、氯化钙二水合物（CaCl2⋅2H2O，Macklin，中国）、十二水合磷酸二钠（Na2HPO4•12H2O）、Tris缓冲盐水（TBS，Macklin，中国）、百里酚（Rhawn，中国）、PA（>95%寡聚原花青素，Macklin，中国）、乙二胺四乙酸（EDTA，Solarbio，中国）、人工唾液（Leagene，中国）、PASP（Rhawn，中国）、氢氧化钠（NaOH，Aladdin，中国）、醋酸（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.，中国）、Gluma脱敏剂（Gluma，德国）、HEPES缓冲液（10 mM，pH 7.4，Saint-Bio，中国）、柠檬酸（Codow，中国）、I型胶原冻干粉（鼠尾，MedChemExpress，美国）、α-MEM培养基（Pricella，中国）、Calcein AM/PI双染色试剂盒（Elabscience，中国）、青霉素-链霉素溶液（Pricella，中国）、胎牛血清（FBS，Pricella，中国）、Cell Counting Kit8（MedChemExpress，美国）和磷酸盐缓冲盐水（PBS，Pricella，中国）。所有材料均按原样使用。
2.2. 中孔二氧化硅（HMS）的制备
HMS的制备遵循先前报道的协议，并进行了少量修改[49]。首先，将0.69 g CTAB、8.4 mL 0.5 M NaOH和300 mL去离子水混合。将混合溶液在80°C下搅拌15分钟。然后，将2.25 mL TEOS稀释在15 mL乙醇中，将此乙醇溶液逐滴加入前一种混合物中，再搅拌2小时。随后进行离心处理，然后用去离子水和无水乙醇交替冲洗三次。在60°C的干燥箱中过夜干燥，得到目标SiO2纳米球。
通过自模板方法[50][51][52]，将SiO2纳米球转化为HMS：将150 mg SiO2纳米球分散在75 mL去离子水中，其中含有225 mg CTAB、45 mL乙醇和0.825 mL氨。将所得混合物在室温下搅拌30分钟。接着加入1.8 mL TEOS，搅拌6小时。离心后，用去离子水和无水乙醇依次洗涤三次。在60°C的干燥箱中过夜干燥，得到SiO2纳米球。
2.3. 胺功能化HMS（AF-HMS）的制备
将300 mg HMS分散在60 mL乙醇中。向分散的HMS中逐滴加入APTES（0.6 mL），在室温下持续磁力搅拌20小时。离心后得到白色沉淀物，用乙醇洗涤三次，并在65°C的干燥箱中过夜干燥，得到AF-HMS。
2.4. 装载PASP-ACP的AF-HMS（PASP-ACP@AF-HMS）的制备
首先，将50 mg PASP粉末溶解在50 mL TBS配制的CaCl2·2H2O（9 mM）溶液中，搅拌15分钟。然后将此混合物与50 mL TBS配制的Na2HPO4·12H2O（4.2 mM）溶液混合，制备PASP-ACP矿化前体，PASP浓度为500 μg/mL。接着，将200 mg AF-HMS溶解在50 mL PASP-ACP溶液中，在室温下搅拌24小时，再振荡24小时以促进PASP-ACP渗透到AF-HMS中。通过离心回收沉淀物，用去离子水洗涤，并在-20°C下保存为湿样品，用于后续使用，标记为PASP-ACP@AF-HMS。
2.5. 原花青素（PA）溶液的制备
将固体PA溶解在去离子水中，配制6.5%的PA溶液，并充分混合。所有制备步骤均在4°C的黑暗条件下进行（棕色玻璃器皿，暗色通风橱），并将制备好的溶液储存在密封的棕色瓶中，避光保存4°C，24小时内使用以防止PA降解。
2.6. PASP-ACP@AF-HMS的表征
使用透射电子显微镜（TEM，JEM-1400Flash，日本）确定HMS、AF-HMS和PASP-ACP@AF-HMS的超微结构和形态。应用能量分散光谱（EDS）配备的扫描TEM来研究元素组成特性。使用粉末X射线衍射仪（Bruker D8 Advance，德国）进行X射线衍射（XRD）分析，包括广角和小角衍射模式。典型的官能团通过傅里叶变换红外光谱（FTIR，Nicolet is50，美国）进行鉴定。具体表面积和平均孔隙体积是使用全自动多功能气体吸附分析仪（ASAP 2020Plus HD88，美国）测定的，随后根据BET和BJH方法进行了计算。Zeta电位和粒径分布是通过Zetasizer Nano ZS系统（Malvern Instruments，英国）监测的。负载效率是通过热重分析（TGA）和导数热重分析（DTG）在10°C/min的加热速率下，在N2气氛中，使用TG 209 F3热重分析仪（NETZSCH，德国）来检测的。2.7. 钙（Ca）和磷（P）的释放为了消除人工唾液、PBS或模拟体液中的Ca和P干扰，使用了HEPES缓冲液来评估PASP-ACP@AF-HMS释放的Ca和P的量。简而言之，100 mg的PASP-ACP@AF-HMS浸泡在10 mL的10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中。分别在1、2、3、4、5、6和7天时定量释放的Ca和P的浓度[53,54]。在每个预定时间点，混合物以4000 rpm的速度离心4分钟。然后收集5 mL的上清液，并补充等体积的预加热的HEPES缓冲液。使用电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP-OES，Agilent 725，美国）来确定样品中的Ca和P水平。该测试重复进行了三次。2.8. 重组胶原蛋白的纤维内矿化重组胶原蛋白模型用于研究纤维内矿化的两个方面：1）从PASP-ACP@AF-HMS纳米系统中释放的PASP-ACP的影响；2）PA和PASP-ACP@AF-HMS联合应用的影响。I型胶原蛋白的浓度为1 mg/mL，通过将冻干胶原蛋白粉末溶解在0.1 M醋酸中制备，整个溶解过程保持在4°C。然后将200目镍（Ni）TEM网格浸入预先制备的胶原蛋白溶液中，随后使用1 M NaOH溶液将混合物的pH调整至中性，以实现胶原蛋白的自组装。胶原蛋白纤维自组装后，Ni网格被分为两组。一组直接用去离子水冲洗，然后空气干燥30分钟，从而在Ni TEM网格上沉积胶原蛋白纤维。另一组用6.5%的PA交联30分钟，用去离子水冲洗，然后也空气干燥30分钟，同样在Ni TEM网格上沉积胶原蛋白纤维。50 mg的PASP-ACP@AF-HMS分散在1.5 mL的TBS（pH 7.4）中。覆盖有重组胶原蛋白纤维的两组TEM网格随后浸入之前的PASP-ACP@AF-HMS溶液中，并在37°C的培养箱中培养。1天、3天和5天后，依次收集两组TEM网格，轻轻洗涤以去除残留物质，并用醋酸铀进行负染色。使用TEM/SAED（JEM-1400Flash，日本）来表征胶原蛋白纤维中的矿物相沉积和Ca/P矿物的结晶度，从而反映胶原蛋白纤维的矿化状态。2.9. DH模型的制备在获得所有牙齿捐赠者的知情同意后，共收集了150颗完整无龋的人类第三磨牙，符合青岛大学附属医院医学伦理委员会（QYFYWZLL30604）批准的伦理标准。收集的第三磨牙用钝器处理以去除根表面的软组织和牙石，然后彻底冲洗并保存在0.1%的百里酚溶液中，温度为4°C。使用低速精密切割机（DTQ-5，中国）切割磨牙；切割方向垂直于磨牙的长轴，具体是在釉质-牙本质交界处下方，以获得牙本质盘样本。远端牙髓表面被指定为实验表面。样品依次使用600、800、1200、2000和3000目的碳化硅砂纸进行湿抛光，直至厚度达到1 mm。然后彻底用超纯水冲洗每个样品的表面。牙本质盘用0.5 M EDTA溶液蚀刻5分钟，然后用超声波清洗15分钟，最终得到DH模型[52,55]。2.10. DH模型的分组在准备脱矿的DH模型后，进行了顺序编号。一个独立监督的计算机生成的随机化过程确保了分配的无偏性。未参与后续程序的研究人员使用随机数表生成随机化计划，确保每个样本的分配概率相等。脱矿的牙本质盘根据不同的表面处理方案随机分为五组（每组30个样本）：A组（对照组）：每个牙本质盘表面用小刷子涂抹两次超纯水，每次30秒，然后用超纯水冲洗，不施加压力。B组（PA）：每个牙本质盘用6.5%的PA交联3分钟，然后用超纯水冲洗，不施加压力。C组（Gluma）：每个牙本质盘用小刷子涂抹两次Gluma脱敏剂，每次30秒；当液体膜消失且牙本质表面失去光泽后，用超纯水冲洗，不施加压力。D组（PASP-ACP @AF-HMS）：每个牙本质盘用PASP-ACP @AF-HMS浆液（粉末与超纯水的比例为5 mg/100 μL）涂抹两次，每次30秒，然后用超纯水冲洗，不施加压力。E组（PA + PASP-ACP @AF-HMS）：每个牙本质盘用6.5%的PA交联3分钟，然后用PASP-ACP @AF-HMS浆液（粉末与超纯水的比例为5 mg/100 μL）涂抹两次，每次30秒，然后用超纯水冲洗，不施加压力。所有组都在相同的暗条件下处理。处理后，所有组都保存在37°C的新鲜人工唾液中，保存1天或28天，每天更换人工唾液。2.11. 牙本质小管封闭的SEM观察使用扫描电子显微镜（SEM）评估每组不同处理后牙本质小管的封闭能力以及它们在酸性和耐磨性方面的稳定性。处理1天和28天后，从每组中随机选择牙本质盘，用超纯水冲洗，然后依次使用25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液脱水。之后，将脱水的盘子在60°C的烤箱（HHG-9148A，中国）中干燥。在SEM分析之前，样品经过金喷涂处理以评估牙本质小管表面的封闭情况。28天后，从每组中选择额外的牙本质盘观察横截面的小管封闭情况。为了防止对牙本质盘实验表面造成任何影响，从未处理的一侧切割至大约0.2 mm的深度，然后在中间和远端位置施加压力将其分成两半。随后冲洗、乙醇脱水、烤箱干燥和金溅射涂层后，使用SEM观察横截面的小管封闭情况。所得到的切开的牙本质盘分别用于酸耐受性或耐磨性分析。对于酸耐受性测试，样品浸泡在6%的柠檬酸溶液中1分钟。对于耐磨性测试，样品在标准化恒定力下用软毛牙刷机械刷洗3分钟[52,56]。处理过的牙本质盘也用SEM观察。使用EDS确定用PASP-ACP @AF-HMS处理28天的牙本质盘中的Ca和P含量。该测试重复进行了三次。2.12. 牙本质气密性的确定由于只有未阻塞的牙本质小管允许气体流动，因此可以通过使用改进的气压渗透装置来评估封闭效果[57]。每组牙本质盘被夹在两个带有中央开口的橡胶环之间，并固定在腔室中。将一滴超纯水放入连接到腔室的管中。使用注射器注入空气，压力计记录观察到水移动时的气压；这个值被指定为临界压力。值得注意的是，较高的临界压力表示更有效的牙本质封闭和更低的牙本质渗透性。每组测试三个样本。2.13. 牙本质硬度和弹性模量的确定使用维氏硬度计（Buehler-VH-1102，中国）测定脱矿牙本质、天然牙本质和A-E组牙本质盘的宏观硬度。施加50 g的负载，保持10秒。测试力移除后测量压痕的对角线长度。维氏硬度值（HV）计算为施加的力除以压痕的表面积。每组测试三个样本，每个样本进行四次测量。为了进一步表征每组牙本质盘的纳米硬度和弹性模量，进行了纳米压痕测试。所有样品都通过纳米压头（Agilent-G200，美国）进行测试。实验在100 mN的恒定负载下进行，保持时间为10秒。从负载-位移曲线计算纳米硬度和弹性模量值。每个样本的所有测试重复五次。2.14. 人类牙髓干细胞（HDPSCs）的提取、培养和鉴定在获得知情同意后，从18-25岁的健康个体中获取了无龋洞和裂纹的第三磨牙。在无菌条件下分离牙髓组织，并使用组织提取方法获得HDPSCs。原代培养在含有10% FBS和1%青霉素-链霉素溶液的α-MEM培养基中维持，在37°C的含5%二氧化碳的湿润环境中进行。通过流式细胞术（Novocyte，美国）检测第三代细胞的表面标记物（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45），以验证其符合国际标准，用于识别牙髓干细胞。该研究获得了代码QYFYWZLL30604的伦理批准。2.15. 细胞毒性测试在培养基中准备了不同浓度的PASP-ACP@AF-HMS提取物（40、80、160、320、640和1280 μg/mL）。在不同浓度的PASP-ACP@AF-HMS溶液中，于37°C下以100 rpm的速度孵育72小时，以促进可提取成分的释放。孵育后，通过无菌膜过滤提取物以去除颗粒物质，获得最终用于后续使用的提取物。将第三代HDPSCs（1 × 10^5细胞）重新悬浮在培养基中，然后接种到35 mm玻璃底盘中，在37°C的湿润环境中培养24小时。随后，细胞与逐渐增加浓度的PASP-ACP@AF-HMS提取物（0、40、80、160、320、640和1280 μg/mL）孵育2天。接下来，丢弃细胞培养基，替换为100 μL的Calcein AM/PI工作染色剂，然后在黑暗中孵育30分钟。在EVOS M5000荧光显微镜下观察染色结果，并使用ImageJ软件量化活细胞/死细胞的数量。所有实验都进行了三次重复测量。同时，将第三代HDPSCs接种到96孔板（每孔5 × 10^3细胞）中，在37°C下培养24小时。随后，细胞与逐渐增加浓度的PASP-ACP@AF-HMS提取物（0、40、80、160、320、640和1280 μg/mL）孵育1、2或3天。在每个特定时间点，用含有10% Cell Counting Kit-8（CCK-8）的新鲜培养基替换原始培养基，然后在37°C下孵育2小时。然后在450 nm处测定光密度（OD）。每个浓度的结果表示为相对于仅含培养基的组的细胞存活率百分比。所有实验都进行了三次重复测量。2.16. 血细胞溶解试验从实验室部门获取健康个体的血液样本。血液样本（1 mL）用PBS（7 mL）稀释，轻轻摇晃后，以1500 rpm的速度离心5分钟。离心后，丢弃上清液，并将PBS加至8 mL刻度。细胞用PBS冲洗四次，直至上清液清澈。在最后一次冲洗过程中，去除上清液，留下红细胞悬浮液。分别准备纯红细胞和红细胞/PBS溶液（10%）。实验组设置如下：(a) 正对照组，50 μL纯红细胞与950 μL蒸馏水；(b) 负对照组，500 μL红细胞/PBS溶液（10%）与500 μL PBS；(c) PASP-ACP@AF-HMS组，500 μL红细胞/PBS溶液（10%）与500 μL浓度为0.25、0.5、1、2、3、4和5 mg/mL的PASP-ACP@AF-HMS混合液，这些溶液已在PBS中浸泡24小时。样品在37°C下孵育1.5小时，然后以3000转/分钟的速度离心15分钟。收集上清液并转移到96孔板中，在540纳米处进行吸光度检测。每个实验重复三次。计算溶血率（%）的公式如下：溶血率（%）= (ODPASP−ACP@AF−HMS−ODnegative)/(ODpositive−ODnegative)×100%。溶血率≤5%表示材料符合临床使用的安全要求。该研究获得了代码QYFYWZLL30604.2.17的伦理批准。动物实验该研究获得了代码QYFYWZLL30604的伦理批准。在本研究中，使用了8周大的Sprague-Dawley雄性大鼠（体重220-300克）。本研究严格实施了盲法。大鼠被关在标准聚丙烯笼子里，垫料为高压灭菌的玉米芯。提供无菌木制啃咬棒和塑料筑巢材料以丰富环境。采用12小时光照/12小时黑暗的周期，大鼠可以自由获取标准商业大鼠饲料和高压灭菌的蒸馏水。每天进行福利检查。对于有轻微异常症状的大鼠，立即采取针对性干预措施。大鼠通过腹腔注射麻醉。将牙本质样本制备成1毫米厚，然后在每个样本上对称钻两个孔。牙本质圆盘随机分配到五个处理组：A（对照组）、B（PA）、C（Gluma）、D（PASP-ACP @AF-HMS）和E（PA + PASP-ACP @AF-HMS），具体分组见DH模型。处理后的牙本质圆盘通过穿过两个孔的缝线固定在大鼠口腔的颊黏膜上。每个牙本质圆盘表面暴露于天然大鼠唾液中，以模拟人体口腔中的管状封闭过程。孵育14天后，所有牙本质圆盘被取出，用超纯水冲洗，并在扫描电子显微镜（SEM）下观察其表面和横截面的管状封闭情况。对于符合人道终点标准或完成实验程序的大鼠，进行人道安乐死。
2.18 统计分析为了确定所需的牙本质样本量，使用G∗Power 3.1软件进行了功效分析，显著性水平α=0.05，效应量为0.4。为了达到80%的统计功效来检测显著效应，所需的最小样本量为80个。为了应对潜在的样本损失并提高统计功效，牙本质样本量增加到150个。所有数据均表示为至少三个独立实验的平均值±标准差。使用Shapiro-Wilk检验验证数据的正态性，使用Levene检验评估方差的齐性。在确认数据的正态性和方差的齐性后，进行单因素方差分析（ANOVA）以评估组间差异的统计显著性。随后通过Tukey检验进行后续的成对比较。在不符合正态性和方差齐性假设的情况下，采用非参数统计检验。统计分析使用GraphPad Prism 10.4软件进行。统计显著性视为双侧p<0.05（α=0.05）。此外，显著性大小表示为ns（不显著）、p<0.05、p<0.01或p<0.0001。
3. 结果与讨论本研究开发了一种PASP-ACP@AF-HMS纳米系统，并研究了PA和PASP-ACP@AF-HMS在仿生矿化中的协同机制。在材料设计中，选择Gluma作为阳性对照，因为它是一种经过临床验证的DH治疗金标准，并且表现出良好的牙本质管封闭效果。本研究系统地比较了Gluma、PA、PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS的特性，以全面评估它们在治疗DH中的潜力。此外，还进行了生物相容性实验和体内动物研究，以验证PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS的适用性和临床实施的可行性。
3.1 PASP-ACP@AF-HMS的表征HMS通过自模板方法成功合成[[50], [51], [52]]。透射电子显微镜（TEM）图像（图1A1和A2）显示了均匀的球形形态（直径约400纳米）和具有大HMS腔体的核壳结构，显示出优异的药物装载潜力。在装载APTES和PASP-ACP后，AF-HMS（图1B1）和PASP-ACP@AF-HMS（图1C1）的球形形态保持良好，而核心结构变得不那么明显。由于胺基团和装载在二氧化硅纳米颗粒中的无定形矿物前体无法通过TEM轻易识别，因此使用扫描TEM/EDS映射模式确定元素分布（图1B2-B4, C2-C6）。N信号的存在证实了胺基团被纳入AF-HMS中（图1B4）。Ca和P信号的存在也表明ACP前体渗透到了纳米颗粒中（图1C5和C6）。随后，对HMS的粒径进行分析，显示出相对均匀的分布（图1D），平均直径为452.9纳米，这与TEM结果一致。
下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图1. HMS、AF-HMS和PASP-ACP@AF-HMS的表征。(A1) HMS的TEM图像；刻度尺=200纳米。(A2) A1的局部放大TEM图像；刻度尺=100纳米。(B1) AF-HMS的TEM图像；刻度尺=200纳米。(C1) PASP-ACP@AF-HMS的TEM图像；刻度尺=200纳米。(B2–B4) AF-HMS和(C2–C6) PASP-ACP@AF-HMS的扫描TEM-EDS元素映射模式。(D) HMS的粒径分布。(E) HMS、AF-HMS和PASP-ACP@AF-HMS的小角XRD图像。(F) HMS、AF-HMS和PASP-ACP@AF-HMS的广角XRD图像。(G) HMS、AF-HMS和PASP-ACP@AF-HMS的FTIR光谱。(H) HMS、AF-HMS、PASP-ACP和PASP-ACP@AF-HMS的Zeta电位图像。(I) HMS、AF-HMS和PASP-ACP@AF-HMS的热重分析（TG）和差热分析（DTG）。(K) HMS、AF-HMS和PASP-ACP@AF-HMS的氮吸附-脱附等温线。(L) PASP-ACP@AF-HMS中Ca和P的累积释放曲线。(M) PASP-ACP@AF-HMS释放的矿物相的Ca/P比率。XRD分析用于检查材料的介孔结构和晶体相。对于小角图案（图1E），HMS在2θ=2.6°处显示出特征性衍射峰（100），对应于介孔结构[51]，这在装载APTES和PASP-ACP后仍然保持。对于广角图案（图1F），在2θ=22°附近的宽无定形散射带表明是无定形固体。FTIR显示了纳米材料的化学官能团（图1G）。HMS的特征吸收峰分别为1055 cm−1（Si-O-Si伸缩振动）、960 cm−1（Si-OH弯曲振动）以及804 cm−1和444 cm−1（Si-O伸缩和弯曲振动）。对于AF-HMS，在687 cm−1、1570 cm−1和1630 cm−1处分别观察到N-H弯曲振动、伯胺振动和NH3+变形，表明成功接枝了官能胺基团（-CH2-CH2-CH2NH2）[58,59]。PASP-ACP@AF-HMS的FTIR光谱中出现了1558 cm−1和1400 cm−1的新峰，这些峰归因于PASP的-COO-伸缩振动[60]。图1H显示了HMS、AF-HMS、PASP-ACP和PASP-ACP@AF-HMS的平均Zeta电位。尽管HMS可以通过毛细作用装载PASP-ACP[61]，但这不是一个有效的控释系统。由于PASP-ACP（-11.62 mV）和HMS（-21.17 mV）都具有负Zeta电位，仅通过毛细作用实现高装载量具有挑战性。这导致PASP-ACP在没有静电吸引的情况下迅速释放。药物装载到多孔二氧化硅中的主要驱动力是吸附剂和吸附物之间的静电吸引[62]。为了有效装载和控释PASP-ACP，通过用APTES后接枝使HMS胺基化，生成一个带正电的表面以装载PASP-ACP[58]。在氨基丙基团共价结合后，HMS的Zeta电位从-21.17 mV升高到+28.07 mV。AF-HMS的Zeta电位反转促进了PASP-ACP（-11.62 mV）的装载，这是通过静电吸引实现的。这一发现表明HMS完成ACP前体吸附和递送的潜在机制途径。通过TGA（图1I）和DTG（图1J）评估了HMS中胺基团的附着、ACP前体的封装和热稳定性。由于物理吸附的水分被去除（63.6°C），HMS的重量损失为2.98 wt%。AF-HMS的总重量损失为9.51%，分为两个阶段：第一阶段类似于HMS的脱水，而第二阶段涉及氨基丙基团的分解和硅醇基团的脱羟基（412.8°C和516.5°C）[54]。由于PASP的进一步分解（355.1°C），PASP-ACP@AF-HMS的重量损失达到16.18 wt%[63]。氮吸附-脱附结果表明，未掺杂和掺杂的HMS都显示出具有滞后环的IV型等温线（图1K），其中滞后与介孔结构内的毛细凝结有关[64]。这些特性归因于介孔结构的存在，这与TEM和XRD分析的结果一致。使用BET/BJH方法计算出HMS的比表面积和孔体积分别为819.5 m2/g和0.559 cm3/g（表1）。氨基化后，AF-HMS的比表面积和孔体积分别降至459.4 m2/g和0.351 cm3/g（表1）。AF-HMS的大比表面积和孔体积促进了其装载PASP-ACP的能力。PASP-ACP@AF-HMS的比表面积和孔体积进一步降至263.1 m2/g和0.293 cm3/g（表1），表明ACP渗透到了介孔二氧化硅中。
3.2 Ca和P离子的释放从介孔二氧化硅纳米载体中有效释放活性成分在生物医学应用中起着关键作用。图1L显示了PASP-ACP@AF-HMS中Ca和P的体外累积释放曲线。Ca和P在最初的4天内迅速释放，随后逐渐减速至稳定状态。释放矿物的Ca/P比率始终保持在1.5（图1M），这是在中性pH条件下ACP的典型Ca/P比率[65]。PASP-ACP从AF-HMS的释放可能是由于HEPES两性离子对物理吸附的PASP-ACP的竞争性置换[66]。在体内，多种两性离子——如体液中的磷酸蛋白、磷脂甚至游离氨基酸——可能会竞争在胶原蛋白中的吸附。因此，AF-HMS成为在体内环境中递送生物矿物中间前体的可行载体。介孔壳和宽敞的核心的结合，加上矿物的可持续释放，使PASP-ACP@AF-HMS成为理想的递送载体。早期快速的离子释放为HAP晶体的成核和牙本质的早期再矿化提供了足够的矿物质来源[52,67]。本研究设置7天的检测周期来研究Ca-P释放动力学，主要是基于相关现有研究的证据，这些研究已经证实装载在介孔二氧化硅上的ACP纳米系统可以在一周内实现Ca和P的稳定释放[53,54]。同时，本研究的实验结果进一步验证了这种释放模式。我们还打算在后续研究中进行28天的长期Ca-P释放检测，以评估其长期释放稳定性。
3.3 重组胶原蛋白的纤维内矿化使用单层重组胶原蛋白模型来检查从PASP-ACP@AF-HMS释放的ACP前体矿化胶原蛋白纤维的能力，并将其与用PA处理胶原蛋白纤维后的PASP-ACP@AF-HMS的矿化能力进行比较。TEM图像显示，在1天的孵育后，可以观察到从PASP-ACP@AF-HMS释放的球形液体前体，其中一些附着在胶原蛋白表面（图2A1和A2），并且没有检测到明显的衍射信号（图2A2的插图）。相比之下，在PA处理后，从PASP-ACP@AF-HMS释放的更多球形液体前体可见并附着在胶原蛋白表面（图2B1和B2）。SAED分析（图2B2的插图）显示样品的(002)晶面上存在弧形衍射环，表明发生了轻微的矿化。在3天的孵育后，未经PA处理的组中，虽然前体渗透到了胶原蛋白纤维中，但在(002)晶面上仅观察到微弱的弧形衍射环，表明仅有轻微的矿化（图2A3和A4）。然而，在PA处理的组中，在(002)和(211)晶面上都检测到明显的弧形衍射环，证实了HAP晶体沿着胶原蛋白纤维的c轴沉积。胶原蛋白纤维实现了几乎完全的纤维内矿化，电子密度更高（图2B3和B4）。在5天的孵育后，未经PA处理的胶原蛋白纤维显示出显著更高的电子密度，表明与孵育1天或3天相比，纤维内矿化基本完成（图2A5和A6）。SAED分析（图2A5的插图）也基于(002)和(211)平面的弧形衍射图案验证了HAP晶体沿胶原蛋白纤维的c轴沉积。在PA处理后，5天观察到了完全的纤维内矿化，与1天或3天相比（图2B5和B6）。SAED分析（图2B5中的插图）同样验证了HAP晶体沿胶原纤维的c轴有序沉积的现象，这通过(002)、(211)和(004)平面上出现的弧形衍射图案得到了证实，其矿化程度比PASP-ACP@AF-HMS组更为明显。这些结果表明，从AF-HMS中释放出的PASP-ACP仍具有渗透并诱导胶原纤维内矿化的能力，而PA则促进了胶原纤维内的矿化。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像
图2. PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS对重组胶原的影响。用(A1-A6) PASP-ACP@AF-HMS或(B1-B6) PA + PASP-ACP@AF-HMS处理的胶原纤维的TEM图像。对于PASP-ACP@AF-HMS，在第1天时，一些矿化前体从颗粒中释放出来并附着在胶原表面，并逐渐渗透到胶原纤维中；到第3天时，只有轻微的部分矿化现象，SAED显示(002)平面上有弧形衍射图案；到了第5天，胶原纤维内基本上实现了完全矿化，SAED在(002)和(211)平面上都显示了弧形衍射图案。对于PA + PASP-ACP@AF-HMS，在第1天时，更多的矿化前体从PASP-ACP@AF-HMS中释放出来并附着在胶原表面，显示出部分矿化现象，SAED在(002)平面上显示了弧形衍射图案；到第3天时，它们渗透到胶原纤维中，导致胶原纤维内基本上实现了完全矿化，SAED在(002)和(211)平面上都显示了弧形衍射图案；到了第5天，胶原纤维内实现了完全矿化，SAED在(002)、(211)和(004)平面上都显示了弧形衍射图案。刻度尺：A1、A3、A5、B1、B3、B5 = 50 nm，A2、A4、A6、B2、B4、B6 = 200 nm；插图刻度尺：A1、A3、B1、B3 = 200 nm。
使用PASP-ACP@AF-HMS递送系统和胶原纤维作为矿化模板进行生物矿化的过程可以这样解释：TBS中的两性离子的竞争性置换可能有助于从AF-HMS中释放出带负电的PASP-ACP前体[68]。PASP-ACP的吸引力可能是通过胶原纤维表面存在的净正电荷与PASP-ACP上的负电荷-COOH基团之间的静电相互作用实现的[33,69]。这些前体与胶原纤维的净正电荷区域（如a-带）结合，并通过静电相互作用或毛细作用渗透到纤维中[33,70]。PASP通过聚合物诱导的液态前体（PILP）过程在分子水平上促进ACP进入纤维[71][72][73]。一旦ACP进入胶原，它会在胶原分子之间扩散并固化，随后沿着胶原纤维的纵向轴转化为羟基磷灰石微晶体[33,74]。考虑到胶原纤维的模板作用，交联可能增强CaP-PILP诱导的牙本质的仿生再矿化[48]。PA可能表现出类似于GAGs的行为，维持胶原的形态并调节矿化过程。PA可以通过共价键和氢键连接和桥接胶原纤维，从而帮助维持胶原的几何稳定性[46]。PA可以促进仿生再矿化，其作用机制如下：PA是一种富含羟基苯基团的多酚化合物，可以作为钙离子的配体；PA可以与钙离子螯合，从而在原花青素诱导的生物修饰后促进钙在胶原基质中的沉积[48]。PA可以增强矿物离子的结合，并促进磷酸钙的非均匀成核，从而促进胶原的矿化过程[75]。因此，PA和PASP-ACP@AF-HMS的联合应用在增强胶原纤维内矿化方面具有协同潜力。
3.4. 牙本质小管封闭的SEM观察
在研究了PASP-ACP@AF-HMS对胶原纤维的矿化能力以及PA和PASP-ACP@AF-HMS在胶原纤维矿化中的协同作用后，本研究随后通过体外测试评估了它们对牙本质小管封闭和牙本质再矿化的影响，以确定它们在暴露牙本质上的潜在应用（图3A）。在建立DH模型后（见DH模型的制备），使用SEM检查了不同组在处理后1天和28天的小管封闭稳定性和有效性。
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图3. (A) 牙本质过敏模型的制备，随后对牙本质盘进行分组处理以实现仿生再矿化和牙本质小管封闭，接受磨损和酸挑战（n = 150）。处理后1天的对照组(B1)牙本质表面的SEM图像；处理后28天的对照组(B2)牙本质表面、(B3)横截面、(B4)磨损后和(B5)酸浸泡后的SEM图像。(C–F)其他四组的SEM图像。所有面板的刻度尺 = 5 μm，所有插图的刻度尺 = 10 μm。
处理1天后，对照组显示牙本质小管完全开放，内部没有显著沉积物。牙本质表面的胶原纤维仍然暴露在外，显示出明显的结构变化，如塌陷、断裂和分支（图3B1）。处理28天后，对照组表面的胶原纤维完全被覆盖，小管内只有少量的矿物沉积物（图3B2），没有矿物渗透到更深的牙本质小管区域的迹象（图3B3）。处理1天后，PA组观察到胶原纤维的交联和完整的致密胶原纤维网络，小管内几乎没有沉积物（图3C1）。处理28天后，表面胶原纤维完全被覆盖，牙本质小管直径显著减小，一些小管完全矿化，而其他小管部分封闭，有些未封闭（图3C2）。PA组的连续封闭深度在28天时达到6 μm，有些渗透深度达到约11 μm（图3C3）。在Gluma组中，处理1天和28天后，表面胶原纤维都完全被覆盖。一小部分小管几乎完全被矿化封闭，一些小管部分封闭，其他小管未封闭（图3D1和D2）。Gluma组在28天后实现了大约12 μm的连续封闭深度（图3D3）。处理1天后，PASP-ACP@AF-HMS组的表面胶原纤维完全被覆盖，小管几乎充满了矿物和纳米颗粒（图3E1）。处理28天后，表面胶原纤维完全被覆盖，完全封闭的小管通过矿物和纳米颗粒的填充得到了有效保护（图3E2），连续封闭深度达到约12 μm（图3E3）。处理1天后，PA + PASP-ACP@AF-HMS组的表面胶原纤维完全被覆盖，小管被矿物完全封闭，显示出更紧密的封闭（图3F1）。处理28天后，表面胶原纤维仍然完全被覆盖，完全封闭的小管内的矿物仍然保存良好，封闭紧密（图3F2）。连续的牙本质小管封闭深度达到15 μm，有些渗透深度达到约18 μm（图3F3）。
各组在处理28天后的磨损挑战和酸挑战测试中表现出不同的稳定性特征。在刷牙攻击下，对照组显示小管开放，表面粗糙，胶原暴露（图3B4）。在酸攻击下，对照组显示小管开放，表面均匀光滑（图3B5）。PA组在机械磨损后表现出矿物损失（图3C4），酸蚀后矿物损失更明显，小管直径显著增大（图3C5）。Gluma组在两种挑战后都表现出矿物损失和纤维重新暴露，酸蚀后的效果更为明显（图3D4和D5）。PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS组表现出显著的稳定性，在两次挑战后保持了相同的矿物含量（图3E4、E5、F4和F5）。
为了验证PASP-ACP@AF-HMS对脱矿牙本质的再矿化效果，进行了EDS分析。处理28天后，SEM-EDS结果显示PASP-ACP@AF-HMS组的牙本质中Ca和P分布均匀（图4A1-A3），Ca/P比为1.66（图4B），这与理论上的HAP值1.67高度一致。EDS结果证实ACP成功转化为类似天然牙本质的结晶形式，证明PASP-ACP@AF-HMS成功诱导了再矿化效果。
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图4. (A1–A3)元素分布的EDS分析以及(B)处理28天后脱矿牙本质中Ca和P含量的EDS分析；刻度尺 = 2 μm。(C)牙本质气密性检测的示意图。(D)处理28天后各组的牙本质气密性数据。不同字母表示有显著差异（p < 0.05）。(E)处理28天后各组的牙本质维氏硬度数据。不同字母表示有显著差异（p < 0.05）。(F)处理28天后各组的牙本质纳米硬度数据。不同字母表示有显著差异（p < 0.05）。(G)处理28天后各组的牙本质弹性模量数据。不同字母表示有显著差异（p < 0.05）。
可以得出结论，PASP-ACP@AF-HMS显著促进了脱矿牙本质的再矿化。PASP-ACP@AF-HMS在封闭牙本质小管方面非常有效，表现出抗酸性和耐磨性，有助于对抗过敏和脱矿，为牙科硬组织的矿化提供了合理的策略。PASP是一种含有天冬氨酸残基的NCP类似物，通过其酸性结构域稳定ACP，加速其转化为HAP，并通过靶向胶原活性位点创建矿化成核中心来促进再矿化[76,77]。重要的是，以糊剂形式装载PASP-ACP的二氧化硅纳米颗粒足够小，可以渗透到牙本质小管的一定深度。从PASP-ACP@AF-HMS中连续释放的Ca和P最终转化为HAP晶体进行矿化，完全占据牙本质小管并与其内壁结合[52,78]。此外，二氧化硅的耐酸性和其强大的机械强度确保了小管封闭的耐酸性和耐磨性[79,80]。与单独使用PA或PASP-ACP@AF-HMS相比，PA和PASP-ACP@AF-HMS的联合使用导致牙本质小管更紧密的封闭、更深的矿物渗透以及更好的耐酸性和耐磨性，这与PA维持脱矿胶原的稳定性及其交联作用以增强磷酸钙聚合物诱导的牙本质流体前体的仿生再矿化密切相关[46,48]。值得注意的是，PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS组表现出的长期稳定性和耐酸/耐磨性证实了临床耐久性与再矿化HAP晶体的形成和晶体质量之间的相关性[81]。
尽管Gluma组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组在局部SEM视野下显示出某些视觉形态上的相似性，但它们的封闭机制和长期稳定性根本不同：Gluma通过戊二醛诱导的蛋白质沉淀来封闭牙本质小管，而Gluma诱导的封闭层无法承受长期降解[82]；相比之下，PASP-ACP@AF-HMS组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组形成的矿化沉积层实现了更稳定和持久的牙本质小管密封。从临床角度来看，Gluma是牙科实践中广泛采用的标准化敏化剂。因此，选择Gluma作为阳性对照，以反映临床材料的封闭效果。然而，Gluma与本研究中使用的仿生再矿化方法在蛋白质沉淀机制上存在差异。因此，未来的研究将纳入再矿化机制的对照组，以便进行更全面的比较。此外，本研究主要在受控的体外条件（恒定温度/湿度）下研究了PA和纳米系统的仿生矿化效应。为了进一步验证它们的临床适用性，未来的研究将采用pH循环和热循环的动态模拟实验模型进行功能评估，以更好地模拟实际的口腔微环境，从而促进这项研究的临床转化。
3.5. 牙本质气密性的确定
本研究采用了一种优化的空气压力测试方法来评估牙本质的密封能力和渗透性，并同时比较了28天后各处理组的密封效果（图4C和D）。与正常牙本质相比，PASP-ACP@AF-HMS组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组的牙本质密封能力没有显著差异（p ≥ 0.05），表明两组都有效地恢复了牙本质的密封。PA + PASP-ACP@AF-HMS组的密封效果优于PASP-ACP@AF-HMS组，但两者之间没有显著差异（p ≥ 0.05）。与脱矿组、对照组、PA组和Gluma组相比，它们的密封能力有所提高，但其密封性能仍显著低于正常牙本质（p < 0.05），PA组和Gluma组之间没有显著差异（p ≥ 0.05），表明在恢复牙本质密封方面效果有限。这些测试的结果与观察到的管状封闭和再矿化现象相符，进一步证实了扫描电子显微镜（SEM）所获得的形态学证据，即PASP-ACP@AF-HMS组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组均能有效恢复脱矿牙本质的结构完整性。后者显示出比PASP-ACP@AF-HMS组更优异的修复效果。牙髓腔内的生理正压可以驱动管状液体的外流，并可能影响封闭材料的稳定性[83]。后续研究将优化实验装置，以模拟牙髓腔的正压，并结合模拟的口腔动态环境，进行更具临床相关性的体外评估，从而进一步提高研究结果的临床转化价值。
3.6. 牙本质硬度和弹性模量的测定
在机械性能方面，维氏硬度测试显示，PASP-ACP@AF-HMS组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组的牙本质硬度显著高于脱矿组（p < 0.05），与正常牙本质相比没有显著差异（p ≥ 0.05），这表明其机械性能得到了有效恢复（图4E）。此外，PA + PASP-ACP@AF-HMS组表现出更高的硬度值，接近自然牙本质的水平，表明其修复效果更佳。PA组和Gluma组的硬度也显著高于脱矿组（p < 0.05），与正常牙本质、对照组、PASP-ACP@AF-HMS组或PA + PASP-ACP@AF-HMS组相比没有显著差异（p ≥ 0.05），表明PA组和Gluma组在机械性能上也具有一定的修复效果。我们注意到，牙本质宏观硬度测试结果显示Gluma组、PASP-ACP@AF-HMS组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组之间的表面硬度没有统计学上的显著差异（p ≥ 0.05），但Gluma组的标准偏差相对较大。这一现象可能归因于牙本质样本的宏观结构不均匀性。为了更准确地表征各组牙本质的机械性能，本研究进一步进行了纳米压痕测试，以确定不同处理后牙本质的纳米硬度和弹性模量（图4F和G）。结果证实，Gluma组的纳米硬度显著低于PA + PASP-ACP@AF-HMS组和自然牙本质组（p < 0.05，图4F），与PA组、对照组和PASP-ACP@AF-HMS组相比没有显著差异（p ≥ 0.05，图4F），但显著高于脱矿牙本质组（p < 0.05，图4F），表明Gluma组的牙本质纳米硬度仅部分得到恢复。Gluma组的弹性模量显著低于PASP-ACP@AF-HMS组、PA + PASP-ACP@AF-HMS组和自然牙本质组（p < 0.05，图4G），表明PASP-ACP@AF-HMS组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组在弹性模量方面的修复效果更好。此外，PASP-ACP@AF-HMS组、PA + PASP-ACP@AF-HMS组和自然牙本质组之间的纳米硬度和弹性模量没有显著差异（p ≥ 0.05，图4F和G），表明这两组的牙本质局部纳米硬度和弹性模量得到了有效恢复。值得注意的是，PA + PASP-ACP@AF-HMS组的纳米硬度和弹性模量甚至高于自然牙本质，这可能与原位形成的矿物相对牙本质的增强作用有关。
这些结果表明，PASP-ACP@AF-HMS能够显著提高牙本质管状封闭的密封性，同时有效改善牙本质的机械性能。PA和PASP-ACP@AF-HMS的联合应用使脱矿牙本质具备了更优异的机械性能，这对预防和治疗牙本质敏感（DH）具有重大潜力。
3.7. 生物相容性评估
介孔二氧化硅纳米材料由于其高表面积和有序的框架结构，在疾病诊断、治疗和监测方面显示出潜力，同时可以避免对周围细胞和组织的不良影响[84]。尽管二氧化硅被认为毒性较低[85]，但仍需评估PASP-ACP@AF-HMS的生物相容性。为了评估PASP-ACP@AF-HMS的细胞毒性，从新鲜提取的第三磨牙中分离出HDPSCs（人类牙髓干细胞）并进行培养。这些分离出的细胞表现出特征性的纺锤形形态（图5A），并通过流式细胞术验证符合HDPSCs的标准：间充质干细胞标记物（CD73、CD90、CD105）呈高阳性（每种超过95%），而造血谱系标记物（CD34、CD45）呈低阳性（每种低于2%）（图5B–F）。
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图5. (A) 在显微镜下观察从牙髓组织中迁移出的HDPSCs的形态照片；比例尺=100 μm。 (B-F) 第三代细胞中表面标记物（CD73、CD90、CD105、CD34和CD45）的阳性率。
活细胞/死细胞的荧光染色显示，在不同浓度的PASP-ACP@AF-HMS组中细胞活力良好（图6A和B）。对照组与40、80、160和320 μg/mL组之间活细胞与死细胞的比例没有显著差异（p ≥ 0.05）。尽管640和1280 μg/mL组与对照组之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05），但活细胞比例仍保持在95%以上。
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图6. (A) 对照组和不同浓度PASP-ACP@AF-HMS（40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL、640 μg/mL、1280 μg/mL）处理后的活细胞/死细胞荧光图像。活细胞用Calcein AM染成绿色，死细胞用PI染成红色；比例尺=300 μm。 (B) 不同浓度PASP-ACP@AF-HMS组（0 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL、640 μg/mL、1280 μg/mL）中活细胞/死细胞的百分比（***p < 0.0001，***p < 0.01）。
(C) 不同浓度PASP-ACP@AF-HMS组（0 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL、640 μg/mL、1280 μg/mL）中HDPSCs的CCK-8结果，在1天、2天和3天时的情况（ns = 无显著差异，*p < 0.05，***p < 0.01）。
(D) 不同浓度PASP-ACP@AF-HMS对红细胞溶血的影响。
(E) 用不同浓度PASP-ACP@AF-HMS进行的溶血实验的代表照片。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）
进一步的CCK-8实验评估了不同浓度（0、40、80、160、320、640和1280 μg/mL）的PASP-ACP@AF-HMS对培养1天、2天和3天的HDPSCs的细胞毒性（图6C）。经过1天和2天的培养后，对照组与各浓度组之间的HDPSC存活率没有显著差异（p ≥ 0.05），表明没有明显的细胞生长抑制。尽管在3天的培养后，对照组与640和1280 μg/mL组之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05），但HDPSC的存活率仍保持在90%以上。先前的研究表明，二氧化硅与膜蛋白的相互作用可能导致红细胞溶血[86,87]。因此，对PASP-ACP@AF-HMS进行了溶血实验，结果如图6D和E所示。对于蒸馏水（阳性对照），观察到亮红色溶液，表明红细胞破裂并释放了血红蛋白。相比之下，对于PBS（阴性对照），观察到透明溶液，表明没有发生溶血。随着PASP-ACP@AF-HMS浓度的增加（0.25、0.5、1、2、3、4和5 μg/mL），溶血率相应增加。然而，即使在5 μg/mL的浓度下，溶血率也低于5%，表明其对红细胞的溶血活性极低。
细胞毒性和溶血实验的结果证实，PASP-ACP@AF-HMS具有良好的细胞相容性和血液相容性，符合材料体内应用的安全要求。
3.8. 体内效率评估
为了研究PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS在实际口腔环境中对暴露牙本质的临床效果，设计了一项体内动物实验。A组（对照组）、B组（PA）、C组（Gluma）、D组（PASP-ACP@AF-HMS）和E组（PA + PASP-ACP@AF-HMS）处理的牙本质盘标本被固定在大鼠的口腔腔内（图7A）。经过14天的培养后，通过SEM观察到牙本质管状封闭（图7B1-F1和B2-F2）。对照组（图7B1）仅观察到最小的牙本质管状封闭，没有证据表明矿物质渗透到管状结构的深层（图7B2）。PA组和Gluma组仅观察到部分牙本质管状封闭（图7C1和D1）；PA组实现了长达10 μm的连续封闭深度，在某些区域渗透深度约为18 μm（图7C2），而Gluma组在部分区域的连续封闭深度达到10 μm，渗透深度约为14 μm（图7D2）。相比之下，用PASP-ACP@AF-HMS处理的样本的牙本质管状几乎完全被纳米颗粒和矿物相封闭（图7E1），显示出长达14 μm的连续封闭深度和约19 μm的部分渗透深度（图7E2）。对于用PA + PASP-ACP@AF-HMS处理的样本，牙本质管状实现了完全的矿物相封闭，密封效果更佳（图7F1），连续封闭深度达到16 μm，某些区域的渗透深度约为20 μm（图7F2）。这些发现与体外实验的结果一致，证实PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS在体内应用中能有效封闭牙本质管状结构。这项研究表明PASP-ACP@AF-HMS及其与PA的联合应用在有效治疗牙本质敏感方面具有显著的临床潜力。
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图7. 大鼠牙本质管状封闭的体内动物实验，包括对照组、PA组、Gluma组、PASP-ACP@AF-HMS组和PA + PASP-ACP@AF-HMS组。(A) 用于动物研究的牙本质盘标本在处理后固定在大鼠口腔腔内。(B1-F1) 处理后14天在大鼠口腔腔内孵育后的牙本质表面SEM图像，(B2-F2) 横截面图像。所有面板的比例尺=5 μm，所有插图的比例尺=10 μm。
体内实验模型（将牙本质盘固定在颊黏膜上）可以模拟牙本质与口腔内唾液之间的接触过程；然而，它与实际牙本质敏感（DH）的病理状态和口腔微环境存在一定的差异。未来的研究将探索更符合DH实际条件的动物模型，以促进临床转化。
4. 结论
牙本质管状结构的暴露是导致牙本质敏感的关键病因因素。在本研究中，我们成功合成了用于保护暴露牙本质的PASP-ACP@AF-HMS纳米材料系统。PASP-ACP@AF-HMS在治疗牙本质敏感方面表现出明显优势，它通过仿生再矿化机制形成与天然羟基磷灰石（HAP）高度相似的矿物结构。这一过程修复了脱矿的牙齿结构，并有效封闭了牙本质管状结构，抵抗刺激，从而提供持久的治疗效果。与传统脱敏剂相比，PASP-ACP@AF-HMS显示出更优异和持久的疗效。PA和PASP-ACP@AF-HMS的联合应用通过模拟GAGs的生物活性特性，成功维持了胶原蛋白的完整性，促进了更有效的牙本质再矿化。同时，PASP-ACP@AF-HMS的优异生物相容性为其体内应用提供了可靠的基础。体内动物研究进一步验证了PASP-ACP@AF-HMS和PA + PASP-ACP@AF-HMS组合在体内应用的适用性，为临床治疗提供了更多实质性的证据。预计PASP-ACP@AF-HMS的单独使用以及PA和PASP-ACP@AF-HMS的联合应用将在临床上用于保护暴露的牙本质免受敏感。然而，仍需要进一步的长期临床评估来验证其安全性、稳定性和实际可行性。先前的研究表明，PA对致龋细菌具有令人满意的抑制作用[75]。未来的研究将进一步探讨PA和PASP-ACP@AF-HMS之间的协同抗菌作用，这对协调管理牙本质敏感和龋齿具有前景。
CRediT作者贡献声明
蔡云：研究、方法学、可视化、撰写——原始草稿。
赵亚楠：正式分析、验证。
张旭：数据管理、撰写——审阅与编辑。
高文琪：数据管理、资源获取。
李雪：数据管理、资金获取、资源。
刘凌霜：概念构思、项目管理、监督、撰写——审阅与编辑。
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