为解决感染性骨缺损中成骨能力不足和感染持续存在的问题，研究人员开发了一种双功能化水凝胶，其将聚多巴胺（Polydopamine, PDA）和富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin, PRF）整合到三维打印的明胶甲基丙烯酰胺/甲基纤维素（Gelatin methacryloyl/methylcellulose, GM）基质中。采用了两种功能化策略，即表面吸附和共沉淀，以制备GM/PRF-A和GM/PRF-C支架。综合表征显示，两种支架均表现出良好的亲水性、可控的降解性以及改善的机械性能。水凝胶中掺入的PDA显示出近红外（NIR）响应的光热抗菌活性，同时作为一种生物粘合剂来稳定PRF，实现按需生长因子释放。两种功能化策略均促进了骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的增殖和成骨分化。与基于吸附的支架相比，共沉淀功能化的水凝胶在体外和感染性颅骨缺损模型中表现出更持久的生长因子释放、更好的抗菌效果和更优的成骨性能。这些发现表明，共沉淀功能化的GM/PDA/PRF水凝胶是一种用于感染性骨再生的有前景的策略。
论文解读：共沉淀功能化GM/PDA/PRF水凝胶用于感染性骨再生的研究
一、 研究背景与目的
由创伤、肿瘤切除或感染引起的骨缺损是临床重大挑战，尤其是感染性骨缺损，因存在持续性感染和复杂的病理生理过程而难以治疗。当前临床使用的自体骨移植和同种异体骨移植存在供体来源有限、供区并发症、免疫排斥和需要额外手术等问题。因此，开发合成骨替代物至关重要，特别是用于感染骨的再生。
三维（3D）打印技术能够制造具有患者特定几何形状和复杂结构的支架。明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）是一种可光聚合水凝胶，生物相容性和生物活性高，但自身粘度低、在生理温度下剪切稀化行为不足。加入甲基纤维素（Methylcellulose, MC）作为流变改性剂，可形成GM水凝胶，提升了可打印性、形状保真度和机械稳定性。然而，GM水凝胶本身缺乏骨诱导和抗菌特性，限制了其在感染性骨修复中的应用。
整合生物活性成分对有效再生至关重要。富血小板纤维蛋白（PRF）是一种富含生长因子（如血小板衍生生长因子PDGF、转化生长因子β TGF-β和血管内皮生长因子VEGF）的自体纤维蛋白基质，具有促成骨效应，但其临床转化受限于稳定性差和释放动力学不可预测。聚多巴胺（PDA）是一种生物启发聚合物，其邻苯二酚基团具有强粘附性，可稳定固定PRF并实现生长因子的持续保留。此外，PDA在近红外（NIR）照射下具有优异的光热转换效率，可实现高功率下的抗菌治疗和温和热疗（40-42°C）下的促骨生成刺激。然而，不同的基于PDA的功能化策略如何影响生物活性成分的保留和支架的整体再生性能值得更多关注。
生物活性剂的固定策略是决定工程支架功效的关键。常用的方法中，表面吸附和共沉淀各有优缺点，其效果在很大程度上取决于具体的材料设计。先前研究表明，这两种方法可能导致不同的负载行为、释放曲线和生物学结果，表明掺入模式是决定支架功能的重要因素。因此，本研究的主要目标是直接比较这两种策略，以阐明它们对支架性能的影响，并为设计用于感染性骨再生的多功能水凝胶提供合理依据。
二、 主要技术方法概述
本研究开发了两种双功能化3D打印支架：GM/PRF-A（表面吸附）和GM/PRF-C（共沉淀）。研究通过一系列物理化学表征、生长因子释放测试、体外抗菌（针对金黄色葡萄球菌S. aureus和大肠杆菌E. coli）和体外细胞实验（使用大鼠来源的骨髓间充质干细胞BMSCs）评价了两种支架的性能。转录组分析被用于探索潜在的成骨机制。此外，研究还建立了大鼠感染性颅骨缺损模型，以评估体内抗菌效果、生物安全性和骨再生能力。
三、 研究结果
3.1. 物理化学性质
通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）和能量色散X射线光谱（EDS）对支架进行了表征。所有组均保持了多孔的蜂窝状结构，孔径约60-120μm。GM/PRF-C和GM/PRF-A均成功引入了PDA/PRF功能组分。EDS分析显示GM/PRF-A表面N和P信号更强，而GM/PRF-C的元素分布更接近GM，支持了表面吸附策略的局部负载和共沉淀策略的更均匀内部分布。GM/PRF-C表现出比GM和GM/PRF-A更高的亲水性、更低的降解率和更高的初始抗压强度。在含菌环境下，GM/PRF-C也保持了最高的残留压缩模量。Zeta电位分析表明，共沉淀在降解过程中更好地保持了支架的表面特性。
3.2. 光热性能
不含PDA的GM水凝胶温度变化可忽略不计，而GM/PRF-C和GM/PRF-A在NIR照射下均显示出快速的光热响应。GM/PRF-C升温更平缓，5分钟后稳定在约52°C，而GM/PRF-A偶尔超过55°C。根据测试，1.0 W/cm2 的功率可产生适于成骨刺激的温和热疗，而2.0 W/cm2 则可达到抗菌治疗所需的温度范围。
3.3. 生长因子释放模式
以PDGF-BB和TGF-β1作为PRF衍生因子的代表进行量化。所有组在第一天均显示出突释现象。在特定时间点（第3、7、11天）施加NIR照射，GM/PRF-C+NIR和GM/PRF-A+NIR组均增强了生长因子的释放，这归因于光热升温减弱了氢键和疏水相互作用。相比之下，未经NIR照射的水凝胶在整个观察期内保持低基础释放速率。与GM/PRF-A相比，GM/PRF-C实现了更持久、更稳定的NIR触发释放，表明共沉淀方法为稳健的按需生长因子递送系统提供了优越性。
3.4. 体外抗菌性能
首先针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌评估了复合水凝胶的抗菌性能。在没有NIR照射的情况下，GM/PRF-A显示出中等的抗菌活性，而GM/PRF-C与对照组无差异。在NIR照射下，GM/PRF-C和GM/PRF-A均表现出强抗菌活性，对大肠杆菌的抗菌率分别达到98.67±0.58%和99.33±0.58%，对金黄色葡萄球菌分别达到98.33±0.58%和99.30±0.58%。扫描电镜图像显示NIR处理后细菌严重受损。结晶紫染色进一步表明，NIR处理有效抑制了两种细菌的生物膜形成。针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的附加测试也显示，复合水凝胶的光热抗菌效应对标准菌株和耐药菌株均有效。
3.5. 体外生物相容性
体外溶血实验显示，GM、GM/PRF-C和GM/PRF-A的溶血率均低于5%，表明其具有良好的血液相容性。细胞相容性方面，所有组的细胞增殖均随时间增加。与GM相比，GM/PRF-A和NIR处理组在第3天和第5天的增殖相对较低，但到第7天时所有组无显著差异。活/死染色表明大多数细胞在所有组中均存活。细胞骨架染色显示，在功能化支架上培养的BMSCs呈现良好的铺展形态。
3.6. 体外成骨性
通过碱性磷酸酶（ALP）活性和茜素红S（ARS）染色评估成骨效应。第7天，两个NIR处理组均显示出更高的ALP活性。第14天，NIR处理组显示出更多的矿化结节，其中GM/PRF-C+NIR组的矿化程度最高。定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析显示，在NIR照射下，GM/PRF-C上调成骨相关基因（Osx, Col I, OPN, OCN）表达最多。结果表明，温和的光热刺激与PDA/PRF衍生的生化信号协同促进了BMSCs的成骨分化。
3.7. 体内抗菌活性
在大鼠感染性颅骨缺损模型中评估体内抗菌功效。NIR照射后，GM/PRF-C和GM/PRF-A的抗菌效率分别达到86.8±2.2%和88.17±2.6%，显著高于GM组（8.7±1.6%）。吉姆萨染色显示NIR处理组细菌显著减少。H&E染色显示，与对照组和GM组相比，NIR处理组的炎症浸润明显减少。这些发现表明，光热治疗有效控制了感染，为缺损修复创造了更有利的微环境。
3.8. 体内生物安全性
血清生化分析显示，各组的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）均保持在正常范围内，与对照组无显著差异。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色未发现明显病理异常。对缺损周围软组织的组织学检查进一步确定，在重复NIR照射后没有明显的热损伤，而未照射的感染组表现出更严重的局部炎症。这些发现支持了复合水凝胶在体内具有良好的全身和局部生物安全性。
3.9. 体内成骨活性
通过微型计算机断层扫描（Micro-CT）评估体内骨再生。第4周和第8周，对照组和GM组愈合极少，而两个NIR处理组均显示出显著增强的骨再生。在第8周，GM/PRF-C+NIR组实现了最高的骨体积分数（BV/TV: 52.76±3.06%）、骨小梁厚度（Tb.Th: 0.53±0.04 mm）和最低的骨表面积分数（BS/BV: 6.32±0.42 mm-1 ）。组织学分析（H&E和马松三色染色）显示，在GM/PRF-C+NIR组中，缺损区域不仅在边缘，而且在中心区域也出现了广泛的新骨组织和血管浸润，表明骨再生更 robust。第8周的骨钙素（OCN）免疫组化染色证实了GM/PRF-C+NIR组中增强的成骨活性。
3.10. BMSCs的转录组分析
对RNA测序数据的生物信息学分析旨在阐明由GM/PRF-C支架内光热刺激触发的成骨机制。差异表达基因（DEGs）分析显示，与对照组相比，GM/PRF-C+NIR组有1034个基因上调和359个基因下调。基因本体（GO）富集分析表明，上调基因显著富集于对骨形成至关重要的生物学过程和分子功能，如细胞分化、细胞发育过程、骨化、骨矿化、细胞外基质组织和细胞粘附。关键分子功能包括信号受体结合，如BMP信号通路和对转化生长因子β刺激的细胞反应。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，上调的DEGs在GM/PRF-C+NIR组中显著富集于多个成骨相关通路，包括PI3K-Akt信号通路、粘着斑和ECM-受体相互作用，这些通路对细胞存活、增殖及与细胞外环境的整合至关重要。
四、 讨论与结论
本研究开发的3D打印GM水凝胶，通过表面吸附或共沉淀功能化了PDA和PRF，阐明了掺入模式强烈影响支架性能。与表面吸附相比，共沉淀使得PDA/PRF在水凝胶基质中更均匀地整合，从而产生更有利的物理化学性质、更持久的生长因子释放和更优的成骨性能。这些发现凸显了功能化策略在设计用于感染性骨再生的多功能支架中的重要性。
研究成功建立了一种双阶段NIR照射策略，通过参数调节实现了从即时抗菌作用到持续促骨生成的精确转换。在早期抗菌阶段，高功率NIR照射将含PDA支架的温度迅速升高至杀菌水平，有效根除细菌。在后期成骨阶段，温和的光热刺激维持温度在40-42°C左右，有利于成骨分化。除了抗菌活性，NIR照射还触发了PRF衍生因子的按需释放。周期性的NIR照射暂时破坏了PDA和PRF之间的氢键和疏水相互作用，在预定时间点触发精确的生长因子释放。GM/PRF-C显示出比GM/PRF-A更稳定和更持久的释放，表明共沉淀提供了一个更 robust 的生长因子递送平台。
与之前报道的光热抗菌平台相比，本系统提供了几个实际优势。它将PDA介导的光热抗菌活性、PRF为基础的再生支持以及与早期骨修复相匹配的降解特性整合在一个单一的3D打印支架中。更重要的是，与表面吸附相比，共沉淀导致更稳定的PRF整合以及抗菌和再生功能之间更好的耦合，为感染性骨缺损修复提供了更合适的设计。
GM/PRF-C+NIR的优越成骨作用通过显著升高的ALP活性、增强的矿化结节形成以及成骨标志物的上调表达得到证实。转录组分析进一步揭示了在与多细胞生物过程、胶原蛋白细胞外基质组成、对外部刺激的反应以及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路相关的生物学过程中的显著富集。这表明GM/PRF-C支架增强了细胞外基质的沉积和成熟，有效地协调了对骨再生至关重要的细胞因子信号网络，并创造了一个强大的协同微环境，促进了干细胞募集、增殖和分化。
最后，使用大鼠感染性颅骨缺损模型进行的体内评估证实了GM/PRF-C在炎症条件下的双重功能。植入后第一周应用的光热抗菌疗法有效清除了细菌感染并控制了炎症，建立了一个有利于再生的无菌微环境。随后温和的NIR刺激与持续的生长因子释放协同作用，显著增强了骨修复，这在第4周和第8周的Micro-CT分析中得到证实。组织学检查进一步证实了增强的胶原沉积、基质成熟和强烈的骨钙素表达。
五、 研究结论
本研究报告了一种3D打印的GM/PDA/PRF支架，其将NIR触发的光热抗菌活性与PRF介导的再生能力相结合，用于感染性骨修复。与表面吸附相比，共沉淀策略实现了更稳定的PRF整合，并带来了更好的物理化学性质、抗菌功效和成骨性能。因此，所得支架是感染性骨缺损（特别是那些具有不规则几何形状，需要早期感染控制和后续再生支持的缺损）的一种有前景的策略。未来的研究将评估其在大动物模型中的性能，优化NIR治疗方案和针对缺损的支架设计，并评估其在临床相关环境中的长期转化可行性。
打赏
