J.K. Akintunde|S.O. Salami|E.O. Eteng|O.O. Adeleye|A.D. Folayan|D.A. Fadare|T.E. Oladele
医学生物化学与分子毒理学小组，生物化学系，阿贝奥库塔联邦农业大学，尼日利亚
**摘要**
本研究探讨了柚皮素-7-O-新葫芦苷（NAR）对莱施-尼汉综合征（Lesch-Nyhan syndrome）和大鼠模型中神经行为异常的化疗效果。90只雄性Wistar大鼠被分为9组（每组10只）。
- 第一组为对照组；
- 第二组暴露于100 mg/kg KBrO3；
- 第三组暴露于250 mg/kg CAF；
- 第四组同时暴露于100 mg/kg KBrO3和250 mg/kg CAF；
- 第五组同时暴露于100 mg/kg KBrO3和100 mg/kg HAL；
- 第六组同时暴露于100 mg/kg KBrO3和50 mg/kg NAR；
- 第七组同时暴露于250 mg/kg CAF和50 mg/kg NAR；
- 第八组同时暴露于100 mg/kg KBrO3、250 mg/kg CAF和50 mg/kg NAR；
- 第九组仅暴露于50 mg/kg NAR。
实验持续了五周。结果表明，仅暴露于KBrO3、CAF或KBrO3+CAF时，纹状体中的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶-1（HGPRT1）活性降低了52.5%。而NAR处理后，纹状体HGPRT1的活性分别提高了22.8%、31.6%、40.4%和14.0%。NAR还抑制了精氨酸酶和磷酸二酯酶-51（PDE-51）的活性，并上调了多巴胺和cAMP调节的磷酸蛋白（DARPP）、脑源性神经营养因子（BDNF）以及原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）的水平。此外，NAR还降低了AChE、BuChE、MAO-A以及ATP水解酶（ATPase、AMPase和ADA）的活性，同时增加了NO水平。治疗后，大鼠的运动能力、协调性和记忆力得到改善，自残行为、焦虑和抑郁症状也有所减轻。此外，黑质纹状体通路的血管充血、纹状体细胞退化以及血浆中的尿酸和丙二醛（MDA）含量也显著降低。本研究提示NAR可能通过NOS/cAMP/PKA和BDNF/TrkB信号通路上调纹状体HGPRT1基因，从而成为治疗莱施-尼汉综合征和神经行为异常的有效药物。
**引言**
当今世界存在许多发育和生理障碍，其中最奇特的一种是莱施-尼汉综合征（LNS）。LNS是一种X连锁隐性嘌呤代谢缺陷疾病，由次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT）酶的慢性先天性缺乏引起[1][2]。1964年，Michael Lesch和William Nyhan首次发现该病，认为其是一种与尿酸代谢和中枢神经系统功能障碍相关的家族性疾病[3]。据估计，加拿大每38万新生儿中约有1例，西班牙每23.5万新生儿中约有1例[4]；但在发展中国家，由于经济条件和生活水平较低，实际发病率可能更高[4]。
LNS患者出生时通常表现正常，但到了第三或第四个月时，他们难以坐直，甚至在某些情况下无法抬起头部。部分患者会出现肌张力低下（低张力），另一些则表现为运动控制障碍（肌张力障碍）。临床特征包括智力迟钝、舞蹈样动作、痉挛性脑瘫和攻击性自残行为[5]。自残行为通常在1岁左右出现[6]。牙齿萌出会引发口周自残行为，最终导致下唇、手指、脚趾和舌头的部分或完全破坏[7]。研究表明，大多数患者体质非常脆弱，寿命通常不超过二十岁[8]。LNS患者常因肾功能衰竭、纹状体损伤和呼吸问题死亡，并且容易感染其他疾病[8]。LNS的典型特征是尿液中尿酸水平升高，这与HPRT酶缺乏有关，表明患者可能因尿酸过度产生而引发高尿酸血症或肾结石[9]。尽管LNS患儿的血清尿酸水平可能正常（因为肾脏对尿酸的清除能力增强[10]，但可通过临床特征进行诊断，并通过直接测序HPRT基因的所有外显子进一步确认[11][12]。
HGPRT酶缺陷会干扰特定脑区的第二信使环磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信号通路，可能导致神经系统疾病的发展[13][14]。脑源性神经营养因子（BDNF）是一种在脑和脊髓中起作用的信号分子[15]，它与原肌球蛋白相关激酶B（TrkB）受体家族形成复合物[16]。BDNF/TrkB通路与神经精神疾病（包括LNS）有关[17][18][19]，激活该通路可增强cAMP/PKA信号，从而减轻神经系统疾病[20][21]。
HGPRT基因缺陷导致嘌呤代谢紊乱，这是由于X染色体长臂上的基因突变所致[1]。尽管已确定HGPRT为致病基因，但目前尚无有效的治疗方法，因为LNS的神经行为症状缺乏明确的解释机制，且其神经行为表型具有独特性[11]。目前，别嘌醇被用于治疗高尿酸血症[9]，但出生后接受别嘌醇治疗的LNS患者血液中的尿酸水平并未显著升高，但仍会出现神经行为症状[22]，这表明尿酸在LNS的神经症状中作用有限。
鉴于黄酮类化合物具有抑制黄嘌呤氧化酶和降低血清尿酸水平的能力[23]，我们推测柚皮素-7-O-新葫芦苷（NAR）可能能够控制尿酸的过度产生（高尿酸血症）并调节LNS的神经行为症状。先前的研究表明，NAR可抑制高血压引起的神经炎症[24]、预防眼肺损伤[25]并改善与莱施-尼汉病相关的肾功能衰竭[26]。长期使用NAR还能通过上调腺苷一磷酸（AMP）激活的蛋白激酶（AMPK）及其相关信号通路来降低代谢综合征的风险[27][28]。
本研究旨在探讨纹状体功能受损及HGPRT1表达降低如何影响咖啡因和溴酸钾（KBrO3）暴露后的学习和记忆能力，评估这些神经毒性物质引起的神经行为和生化变化，并评估NAR在恢复认知功能方面的化疗潜力。同时，研究还探讨了NAR的神经保护作用是否通过一氧化氮合酶（NOS）/cAMP/蛋白激酶A（PKA）信号通路和脑源性神经营养因子（BDNF）/TrkB通路介导。
**材料与方法**
2.1. 化学品和试剂
溴酸钾（KBrO3；309087）、乙酰胆碱碘化物（A7000）、三磷酸腺苷（ATP；A1852）、腺苷一磷酸（AMP；01930）、腺苷（A9251）、苄胺（185701）、对硝基苯基苯磷酸酯（PNPP；20–106）、P-二甲基氨基苯甲醛（DMAB；156477）、5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB；D8130）、1,3,7-三甲基黄嘌呤（CAF；C53）、柚皮素（NAR；71162）均购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。所有使用的化学品和试剂均为纯分析级，购自信誉良好的供应商。
2.2. 实验方案
90只体重为110±10克的雄性Wistar大鼠来自阿贝奥库塔联邦农业大学动物房，用于本实验。大鼠被饲养在生物化学系的动物房中，环境条件符合相关标准。实验前两周进行适应性训练，所有实验操作均遵循国家研究委员会的规定[29]。实验方案获得学术委员会批准（编号PG/18/0007）。大鼠随机分为9组（每组10只）：
- 第一组（对照组）未接受处理，仅给予蒸馏水；
- 第二组（仅KBrO3）暴露于100 mg/kg KBrO3，持续21天，随后给予蒸馏水；
- 第三组（仅CAF）暴露于250 mg/kg CAF，持续21天，随后给予蒸馏水；
- 第四组（CAF+KBrO3）同时暴露于100 mg/kg KBrO3和250 mg/kg CAF，持续21天，随后给予蒸馏水；
- 第五组（KBrO3+HAL）暴露于100 mg/kg KBrO3，随后给予100 mg/kg Haloperidol，持续14天；
- 第六组（KBrO3+NAR）暴露于100 mg/kg KBrO3，随后给予50 mg/kg NAR，持续14天；
- 第七组（CAF+NAR）暴露于250 mg/kg CAF，随后给予50 mg/kg NAR，持续14天；
- 第八组（KBrO3+CAF+NAR）同时暴露于100 mg/kg KBrO3、250 mg/kg CAF和50 mg/kg NAR，持续21天；
- 第九组（仅NAR）暴露于50 mg/kg NAR，持续14天。
2.3. 剂量/浓度选择
大鼠适应两周后，实验条件符合国家研究委员会（2010）的规定。溴酸钾和咖啡因的剂量分别为100 mg/kg和250 mg/kg，持续21天；Haloperidol和NAR的剂量分别为100 mg/kg和50 mg/kg，持续14天。剂量选择基于先前的研究[30][31][32][24]。
2.4. 实验动物伦理声明
所有实验动物均符合ARRIVE指南，实验过程遵循国家研究委员会《实验室动物护理和使用指南》（2010）。实验方案获得学术委员会批准（编号PG/18/0007）。
2.5. 神经行为检测
2.5.1. T迷宫测试评估焦虑
T迷宫测试依据斯坦福行为与功能神经科学实验室的标准操作程序（SOP）4.0进行。测试前，大鼠在塑料笼中放置至少1小时以减少压力对行为的影响。测试过程：打开左右臂门，将大鼠放入起始臂并开始记录；当大鼠背对目标臂时打开起始门并开始计时；大鼠返回起始臂时关闭起始门。若大鼠在目标臂静止超过90秒，用纸巾轻轻触碰引导其返回起始臂。每组进行5次试验（每次2次，包括对照试验和自由试验，共10次）。记录正确转弯次数（NCT）和错误转弯次数（NIT）：当对照试验和自由试验结果相同时记为正确转弯（例如R/R和L/L）；反之记为错误转弯（例如R/L）。每次试验后清洁实验场地。
2.5.2. 高架十字迷宫测试评估记忆
高架十字迷宫测试依据斯坦福行为与功能神经科学实验室的标准操作程序（SOP）4.0进行。测试前，将大鼠放在起始笼中至少1小时以减少压力影响。测试过程中，大鼠在装置中心区域自由移动5分钟。记录其在开放臂和封闭臂中的总时间。每次试验后用消毒湿巾和纸巾清洁实验场地。在每个实验过程中，都穿戴了适当的个人防护装备（PPE）、手套和实验服。2.5.3 使用悬线测试确定抑郁和协调能力悬线测试是按照斯坦福行为与功能神经科学实验室的标准操作程序（SOP）1.0版进行的。测试程序：在测试前一小时，将大鼠适应测试环境。将大鼠放置在距离地面60-70厘米的金属网格上，使其能够用所有前肢抓住网格。网格的直径为3毫米，长度为90厘米。然后翻转网格，使大鼠倒挂，同时启动计时器。记录大鼠能够抓住网格的时间（介于60到180秒之间）。每只大鼠进行三次试验，每次试验之间给大鼠30秒的休息时间，并使用消毒湿巾、小刷子和纸巾进行充分清洁。2.5.4 使用站立测试估计运动能力站立测试也是按照斯坦福行为与功能神经科学实验室的标准操作程序4.0版进行的。测试前准备：将大鼠放在测试房间中至少1小时，以减少测试期间压力对行为的影响。测试程序：将大鼠单独放入站立箱中，允许其自由探索5分钟。记录大鼠第一次站立的时间以及总共站立的次数。每次试验后，将大鼠放回其笼子中，并使用消毒湿巾、纸巾和小刷子清洁箱子30秒。2.6.6 生化检测2.6.1 神经元纹状体（Striatum）的制备使用特氟龙匀浆器将0.2克的神经元纹状体组织与1.8毫升的匀浆介质混合，制成10%的匀浆液。匀浆介质为0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。匀浆后，将混合物以4000转/分钟的速度离心10分钟。收集上清液，放入适当标记的试管中，用于后续的生化检测。2.6.2 脂质过氧化程度的测定根据[33]的方法，通过测量测试样本中硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）的含量来确定脂质过氧化程度。取400微升样本与1.6毫升Tris-KCI缓冲液和500微升30% TCA混合，然后加入500微升0.75% TBA，在80°C的水浴中加热45分钟。随后在冰上冷却，并以3000转/分钟的速度离心10分钟。收集透明上清液，在532纳米处测量吸光度。2.6.3 一氧化氮（NO）水平的测定根据[34]的方法测定神经元纹状体匀浆液中的一氧化氮水平。取100微升匀浆液，加入400微升蒸馏水，再加入100微升25毫摩尔/升的硝普钠（261.92克/摩尔）。混合物在37°C下孵育2小时，然后加入500微升Greiss试剂。在570纳米处读取吸光度。结果以μM/毫克蛋白质表示。计算一氧化氮水平的公式为：NO = 吸光度 × 混合物体积 / 0.01 × 蛋白质毫克数 × 亚硝酸盐的摩尔消光系数。2.6.4 乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的测定根据[35]的方法测定神经元纹状体匀浆液中的AChE活性。向100微升上清液中加入100微升3.3毫摩尔/升的5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）溶液和500微升pH 8.0的磷酸盐缓冲液。反应混合物在25°C下孵育20分钟，然后加入100微升0.05毫摩尔/升的乙酰硫代胆碱碘化物。在412纳米处读取吸光度，结果以AChE活性/毫克蛋白质/分钟表示。计算AChE活性的公式为：活性（毫摩尔/分钟/毫升）= [(Δ吸光度 / 总反应体积) × 加入的底物体积] × 0.001。2.6.5 单胺氧化酶A（MAO-A）活性的测定根据[36]的方法测定神经元纹状体匀浆液中的MAO-A活性。反应混合物包括100毫摩尔/升的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、200微摩尔/升的苄胺和0.4毫克/毫升的匀浆液，最终体积为250微升，在37°C下孵育1小时，然后在冰上冷却。接着加入500微升蒸馏水、250微升10%硫酸锌和50微升氢氧化钠（1摩尔/升），加热2分钟，然后在冰上冷却。以1000转/分钟的速度离心10分钟。所得上清液用1摩尔/升的NaOH稀释5倍。在450纳米处测量吸光度。单胺氧化酶A活性以MAO-A活性/毫克蛋白质表示。计算MAO-A活性的公式为：活性（毫摩尔/分钟/毫升）= 生成的H2O2量 / 反应时间 × 加入的底物体积。2.6.6 PDE-51活性的测定根据[37]的方法测定神经元纹状体匀浆液中的PDE-51活性。简要来说，向100微升神经元纹状体匀浆液中加入800微升125毫摩尔/升的Tris缓冲液（pH 7.4）。在37°C下孵育10分钟，然后加入约100微升的对硝基苯基磷酸（PNPP）。在1分钟、2分钟和3分钟时分别读取吸光度。PDE-51活性以μ摩尔/分钟/毫克蛋白质表示。计算PDE-51活性的公式为：PDE-51活性 = 最终吸光度 - 初始吸光度 / 反应时间 × PPNPP的摩尔吸光度 × 蛋白质毫克数。2.6.7 ADA活性的测定ADA活性的测定方法如[38]所述，基于腺苷脱氨酶作用于过量腺苷时产生的氨的直接测量。制备0.561克/升的腺苷，并将其pH调整至6.5。将3000微升腺苷溶液和50微升样本匀浆液在37°C下孵育60分钟。结果以单位/毫克蛋白质（U/mg蛋白质）表示。一个单位（1U）的ADA定义为在标准条件下每分钟从腺苷中释放1毫摩尔氨所需的酶量。计算ADA活性的公式为：ADA单位 = [样本吸光度] / 标准品吸光度 × 50。2.6.8 ATP酶和AMP酶活性的测定ATP酶和AMP酶的活性根据[39]的方法测定。简要来说，首先向介质中加入20毫摩尔/升的CaCl2，使Ca2+作为反应的辅因子，并孵育10分钟以调节介质。通过加入20毫升ATP或AMP使最终浓度达到10毫摩尔/升，然后孵育20分钟。向混合物中加入100毫摩尔/升的钼酸铵和20毫摩尔/升的抗坏血酸。在630纳米处读取吸光度，活性以纳米摩尔/分钟/克组织表示。计算酶活性的公式为：活性（ATP酶或AMP酶）(毫摩尔/分钟/毫升) = 生成的磷酸盐体积 / 反应时间 × 反应体积 × 稀释因子。2.6.9 血浆尿酸水平的测定使用Randox实验室试剂盒检测实验大鼠血浆中的尿酸水平。计算血浆尿酸水平的公式为：尿酸（微摩尔/毫克蛋白质）= 样本吸光度 / 标准品吸光度 × 标准品浓度/毫克蛋白质。2.6.10 精氨酸酶（Arginase）活性的测定使用[40]的方法测定神经元纹状体匀浆液中的精氨酸酶活性。将含有800微升Tris-HCl、50微升样本匀浆液和50微升精氨酸酶底物的溶液在37°C下孵育10分钟。之后加入Ehrlich溶液（2.5毫升）。反应混合物静置20分钟。在450纳米处测量神经元纹状体匀浆液中的精氨酸酶活性，结果以每毫克蛋白质的活性表示。计算酶活性的公式为：精氨酸酶活性（毫克蛋白质）= 尿素转化因子 / 样本吸光度 × 蛋白质毫克数。2.6.11 RNA的提取根据制造商的说明，使用Trizol（Invtrogen Life Technologies，美国加利福尼亚州卡里斯巴德）从组织中提取总RNA。将收集的海马组织放入Trizol中，取约100毫克组织，在1毫升RibozolTM试剂（美国）和Polytron匀浆器中匀浆。将100微升氯仿加入匀浆液中。分别使用手动自动匀浆器和塑料特氟龙在无菌、无核酸酶条件下对不同组的少量样本（海马组织）进行匀浆。向匀浆液中加入100微升氯仿作为分离剂。混合物静置10分钟，然后以11,300转/分钟的速度离心，得到三个不同的相。将上层相吸入新的无菌1.5毫升Eppendorf管（适当标记），加入异丙醇（250微升）。通过颠倒混合液使内容物混合，静置10分钟以沉淀总mRNA。以12,000转/分钟的速度离心10分钟，分离上清液。每个管中的沉淀物用500微升75%乙醇洗涤，然后在DNA浓缩器中旋转5分钟。使用Nanodrop在260纳米处测定每个管中的mRNA浓度。2.6.12 神经元纹状体HGPRT1、DARPP、TrKBBCI11b和BDNF的实时PCR分析根据制造商的说明，对提取的RNA进行RT-PCR分析。使用RevertAid™ First strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）和特定引物（表1）对总RNA进行反转录。表1. DARPP-32、BDNF、TrKB、HGPRT1、BCl11b和β-actin基因的引物序列（用于RT-PCR）。表1. DARPP-32、BDNF、TrKB、HGPRT1、BCl11b和β-actin基因的引物序列（51–31）Tm（°C）DARPP-32正向：CTACACACCACCTTCGCTGA 55.00反向：TCTGAGGCCTGGTTCTCATT 55.00BDNF正向：CCAATCGAAGCTCAACCGAAGA 50.00反向：ACTCAGGGTCCACACAAAGC 55.00TrKB正向：TTCTGCGACCCAAAGAGTCC 55.00反向：CAGTCAGTCAGAGTGCGTGT 55.00HGPRT1正向：GTCCCAGCGTCGTGATTAGT 55.00反向：CTTGCCGCTGTCTTTTAGGC 55.00BCl11b正向：CTGTCACCCACGAAAGGCAT 55.00反向：TGGAAGGCTCATCTTTACACTGG 47.83β-actin正向：TGGAAGGCTCATCTTTACACTGG 55.00反向：GAAGGTAGTTTCGTGGATGCC 55.002.6.13 相补DNA（cDNA）的合成将25微升纯化的mRNA加入干净、干燥且标记好的Eppendorf管中，使用Reverse Transcriptase Super Mix（EasyScript® One-Step RT – PCR SuperMix，产品编号AE411）合成cDNA。2.6.14 cDNA的扩增根据上述3.9.2步骤获得的cDNA，使用聚合酶链反应（PCR）技术进行扩增。简要来说，将等体积（2微升）的DNA模板分配到PCR管中，加入10微升PCR缓冲液（含有2.4微升无核酸酶的水）、目标基因的正向和反向引物（各0.2微升）以及5微升2X ES一步反应混合物（EasyScript® One-Step酶混合物，0.2微升）。然后将管子转移到PCR热循环仪中，进行30轮扩增。2.6.15 聚合产物的凝胶制备和电泳将1克琼脂糖溶解在100毫升1x Tris-硼酸-乙二胺四乙酸（TBE）缓冲液中，用微波加热2分钟直至完全溶解。每隔30秒取出烧瓶并摇晃以确保充分溶解。让凝胶冷却以便操作，然后加入4微升溴化乙锭（Ethidium bromide）以染色核酸，并在紫外光下观察。将凝胶倒入已准备好的电泳槽中，待其固化后，加入1x TBE缓冲液，然后取出梳子和塞子。将DNA扩增产物加载到梳子形成的孔中并覆盖好。在90毫伏电压和250毫安电流下进行电泳10分钟。将凝胶转移到Fotophoresis U/V透射仪（Thermo Fischer，德国）上进行观察。使用Image-J软件根据[41]的方法，将迁移带的强度与β-actin基因的cDNA片段强度进行归一化。2.6.13 组织学切片将收获的神经元纹状体组织用10%甲醛溶液固定，然后嵌入石蜡中。将嵌入的组织切成5微米厚的切片并安装在载玻片上，准备进行苏木精和伊红染色，用于细胞和形态学鉴定及评估。所有切片均用奥林巴斯CX43光学显微镜观察和拍照。2.7 统计分析定量变量以平均值±标准误差（n=10）表示（S.E.M）。统计显著性是通过方差分析（多变量ANOVA）确定的，随后使用SPSS 20.0统计软件包进行事后（Duncan’s）检验，p<0.05和p<0.01被认为具有统计学意义。数据使用GraphPad prism（版本8.0）绘制为条形图。
3. 结果
3.1. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的自咬行为及运动能力的影响
图1（A和B）显示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对KBrO3和咖啡因中毒引起的自咬行为及运动能力的影响。仅暴露于咖啡因或KBrO3+咖啡因的大鼠中观察到了显著的自伤行为（p<0.05）（图1A）。然而，在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，自伤行为显著减少（p<0.05）（图1A）。相反，仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠的运动能力分别比对照组降低了72.5%、79.3%和78%（图1B）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，运动能力分别增加了41.8%、67.2%和56.6%（图1B）。同样，治疗药物（HAL）也显著提高了运动能力（p<0.05）（图1B）。
3.2. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的抑郁和协调能力的影响
图2（A和B）显示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对KBrO3和咖啡因中毒引起的抑郁和协调能力的影响。仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠的抑郁程度分别比对照组增加了81.5%、88.1%和95%（图2A）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，抑郁程度分别降低了82.3%、80.1%和80.9%（图2A）。同样，氟哌啶醇也显著降低了抑郁程度（p<0.05）（图2A）。相比之下，仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠的协调能力分别降低了55.1%、53.7%和50.1%（图2B）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，协调能力分别增加了50.3%、50.1%和47.9%（图2B）。
3.3. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的焦虑的影响
图3（A和B）显示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对KBrO3和咖啡因中毒引起的焦虑（开放臂和闭合臂时间）的影响。仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠在 elevated plus 迷宫测试中花费在开放臂的时间分别减少了79.3%、72.8%和72%（图3A）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，花费在开放臂的时间分别增加了31.2%、38.9%和30.3%（图3A）。同样，氟哌啶醇也显著增加了开放臂的时间（图3A）。此外，仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠在闭合臂的时间分别增加了64.7%、61.8%和61.2%（图3B）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，闭合臂的时间分别减少了39.4%、38.7%和38.9%（图3B）。
3.4. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的记忆能力的影响
图4（A和B）显示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对KBrO3和咖啡因中毒引起的记忆能力（错误转弯次数（NIT）和正确转弯次数（NCT）的影响。仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠的错误转弯次数分别增加了7.3%、8.2%和10.7%（图4A）。而在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，错误转弯次数分别减少了6.4%、7.1%和6.9%（图4A）。相反，仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠的正确转弯次数分别减少了61.3%、63.1%和61.9%（图4B）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，正确转弯次数分别增加了58.2%、61.5%和57.8%（图4B）。
3.5. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的纹状体丙二醛（MDA）含量的影响
图5显示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对KBrO3和咖啡因中毒引起的纹状体MDA含量的影响。仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠的纹状体MDA水平分别增加了63.9%、70.2%和77.8%（图5）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，纹状体MDA水平分别降低了81.7%、76.3%和80%（图5）。同样，氟哌啶醇治疗14天后也显著降低了纹状体MDA水平。然而，纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷组与正常对照组之间的纹状体MDA水平没有显著差异（p>0.05）。
3.6. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的血浆尿酸水平的影响
由于已知血液中尿酸异常积累是高尿酸血症的标志，因此我们检查了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的血浆尿酸水平的影响（图6）。仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因的大鼠的血浆尿酸水平分别增加了51%、17.4%和53.4%（图6）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷14天后，血浆尿酸水平分别降低了63.5%、18.9%和61%（图6）。同样，氟哌啶醇治疗14天后也显著增加了血浆尿酸水平（图6）。而仅接受纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷治疗的大鼠的血浆尿酸水平与正常对照组没有显著差异（p<0.05）。
3.7. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的神经递质酶（AChE、BuChE和MAO-A）的影响
图7（A、B和C）显示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对KBrO3和咖啡因中毒引起的神经递质酶（AChE、BuChE和MAO-A）的影响。仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因使纹状体AChE活性分别降低了54%、52.7%和53.9%（图7A）。而在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷后，这种降低分别减少了51.6%、54.6%和52%（图7A）。氟哌啶醇治疗也显著增加了纹状体AChE活性。同样，仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因使纹状体BuChE活性分别降低了63.2%、62.1%和70%（图7B）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷后，这种降低分别减少了50.2%、48.7%和50.5%（图7B）。氟哌啶醇治疗也显著增加了纹状体BuChE活性。
3.8. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的ATP水解酶（ATPase和AMPase）及腺苷脱氨酶的影响
图8（A、B和C）显示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对KBrO3和咖啡因中毒引起的ATP水解酶（ATPase、AMPase和ADA）的影响。仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因使纹状体ATPase活性分别增加了73.1%、74.5%和73.6%（图8A）。而在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷后，这种增加分别减少了84.5%、84.7%和88.2%（图8A）。氟哌啶醇治疗也显著降低了纹状体ATPase活性。同样，仅暴露于KBrO3、仅暴露于咖啡因以及KBrO3+咖啡因使纹状体AMPase活性分别增加了43.2%、51.1%和53.1%（图8B）。在给予纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷后，这种增加分别减少了63.2%、62.1%和70%（图8B）。氟哌啶醇治疗也显著增加了纹状体AMPase活性。
3.9. 纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷对KBrO3和咖啡因中毒引起的NOS/cAMP/PKA信号级联相关标志物的影响
图9（A、B和C）展示了纳瑞金宁-7-O-新藿皮苷在21天内对大鼠模型纹状体中NOS/cAMP/PKA信号级联相关标志物的影响。纹状体中的一氧化氮（NO）水平在仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理的大鼠中显著降低（p < 0.05），分别降低了51.2%、53.4%和63.1%（图9A）。治疗后，使用纳瑞金（naringin）14天，纹状体中的NO水平分别增加了39.7%、35.4%和35.7%（图9A）。而仅使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷（naringenin-7-O-neohesperidoside）14天处理后，与正常对照组相比，纹状体中的NO水平没有显著差异（p > 0.05，图9A）。此外，在仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理的大鼠中，纹状体中精氨酸酶（arginase）的活性显著增加（p < 0.05），分别增加了56.1%、57.3%和57%（图9B）。使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理14天后，与相应组相比，纹状体中精氨酸酶活性的升高幅度分别减少了41%、44.1%和42.7%（图9B）。最后，在仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理的大鼠中，纹状体中的PDE-51活性显著增加（p < 0.05），分别增加了16.7%、19.1%和20.9%（图9C）。使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理14天后，与相应组相比，纹状体中的PDE-51活性分别降低了29.1%、33.6%和37.2%（图9C）。
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**图9.** （A、B和C）：纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒后纹状体中NO水平（图A）、精氨酸酶活性（图B）和PDE-51活性（图C）的影响。数据以10只大鼠的平均值±标准误差（S.E.M）表示。不同数量的*表示具有统计学显著性（p < 0.05）。ns表示无显著性。
**3.10.** 纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒后纹状体中HGPRT1的影响**
纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒大鼠纹状体中HGPRT1蛋白的影响如图10所示。与对照组相比，仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理21天显著降低了纹状体中HGPRT1的表达（p < 0.05，图10）。然而，治疗后使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷14天，与相应处理组相比，纹状体中HGPRT1的表达显著增加（p < 0.05，图10）。
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**图10.** 纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理后对实验大鼠纹状体中次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1（HGPRT1）表达的影响，以β-actin为内参基因进行标准化。数据以10只大鼠的平均值±标准误差（S.E.M）表示。不同数量的*表示具有统计学显著性（p < 0.05）。ns表示无显著性。
**3.11.** 纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒后纹状体中BCl11b的影响**
图11显示了纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理后，相对于β-actin，实验大鼠纹状体中编码BCl11b的基因表达的变化。与正常对照组相比，仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理的大鼠中BCl11b的表达显著增加（p < 0.05，图11）。KBrO3和咖啡因联合处理显著增强了纹状体中BCl11b的表达（p < 0.05，图11）。纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷分别单独与KBrO3（KBrO3 + HAL）和咖啡因（CAF + NAR）联合处理后，与仅接受KBrO3和咖啡因处理相比，BCl11b的表达没有显著差异（p > 0.05，图11）。然而，CAF + NAR处理显著增加了纹状体中BCl11b的表达（p < 0.05，图11）。有趣的是，KBrO3 + CAF + NAR和纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷联合处理显著抑制了纹状体中BCl11b的表达（p < 0.05，图11）。
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**图11.** 纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对实验大鼠纹状体中BCl11b表达的影响，以β-actin为内参基因进行标准化。数据以10只大鼠的平均值±标准误差（S.E.M）表示。不同数量的*表示具有统计学显著性（p < 0.05）。ns表示无显著性。
**3.12.** 纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒后与LNS相关的关键mRNA蛋白（DARPP-32、BDNF/TrkB）的影响**
纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对大鼠模型中多巴胺和分子量32 kDa的cAMP调节磷酸蛋白（DARPP-32）、脑源性神经营养因子（BDNF）以及肌动蛋白相关激酶B（TrkB）水平的影响如图12（A、B和C）所示。与对照组相比，仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理21天显著降低了纹状体中DARPP-32的表达（图12A）。治疗后使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷14天，与相应处理组相比，纹状体中DARPP-32的表达显著增加（图12A）。同样，仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理21天的大鼠中纹状体中BDNF水平显著降低（图12B）。治疗后使用治疗药物（氟哌啶醇）和纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷14天未能显著恢复纹状体中BDNF的表达至正常水平（p > 0.05，图12B）。此外，仅接受KBrO3、仅接受咖啡因以及同时接受KBrO3和咖啡因处理21天的大鼠中纹状体中TrkB的表达显著降低（p < 0.05，图12C）。而使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷（KBrO3 + CAF + NAR和NAR）处理14天后，与相应处理组相比，纹状体中TrkB的表达显著增加（p < 0.05，图12C）。
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**图12.** （A、B和C）：治疗后纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对实验大鼠纹状体中多巴胺和cAMP调节磷酸蛋白32（DARPP-32）、脑源性神经营养因子（BDNF）以及肌动蛋白受体激酶B（TrkB）表达的影响，以β-actin为内参基因进行标准化。数据以10只大鼠的平均值±标准误差（S.E.M）表示。不同数量的*表示具有统计学显著性（p < 0.05）。ns表示无显著性。
**3.13.** 纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒后大鼠纹状体组织形态学变化的影响**
纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒后大鼠纹状体组织形态学的影响如图13所示。
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**图13.** 纹状体组织病理学的代表性显微照片（放大400倍）。
**对照组：** 纹状体结构正常。
**KBrO3：** 纹状体中可见黑质纹状体束（细箭头）穿插在小神经元之间。
**CAF：** 纹状体中可见局部血管淤积区域（黑箭头）。
**KBrO3 + CAF：** 纹状体中可见局部血管淤积区域（黑箭头）。
**KBrO3 + HAL：** 纹状体结构正常。
**KBrO3 + NAR：** 纹状体结构正常。
**CAF + NAR：** 纹状体结构正常。
**KBrO3 + CAF + NAR：** 纹状体结构正常。
**NAR：** 纹状体结构正常。
在对照组大鼠中，纹状体结构正常（13A）。仅接受KBrO3处理21天的大鼠纹状体中可见黑质纹状体束（细箭头）穿插在小神经元之间（13B）。仅接受CAF处理21天的大鼠（13C）中亦可见局部血管淤积区域（黑箭头）。同样，同时接受KBrO3和CAF处理21天的大鼠（13D）中可见局部血管淤积区域（黑箭头）。然而，使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理14天后，纹状体结构恢复正常（13E-13I）。
**4.** **讨论**
本研究提供了新的证据，表明单独或联合使用咖啡因和溴酸钾（KBrO3）会导致纹状体中次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1（HGPRT1）的显著下调，伴随自伤行为、神经行为缺陷以及类似Lesch-Nyhan综合征（LNS）的生化紊乱。自伤行为仅出现在接受咖啡因和KBrO3+咖啡因联合处理的组中，而未出现在仅接受KBrO3或对照组的动物中，这强烈表明咖啡因是主要的神经行为诱因，而KBrO3可能作为加剧纹状体功能障碍的附加风险因素。这些发现补充了早期观察结果，即HGPRT缺乏会导致LNS特征的强迫性自毁行为和运动异常[42]。我们的数据进一步表明，环境中的神经毒素，特别是过量的咖啡因和氧化性污染物如KBrO3，可以在非基因改造的动物中模拟该综合征的关键特征。先前的研究已经显示，各种环境污染物可以引起基因不稳定、表观遗传修饰和行为异常[43][44][45]。与这些报告一致，本研究表明，长期咖啡因暴露会破坏嘌呤代谢和纹状体信号传导，类似于先天性HGPRT缺乏的情况。同样，已知的氧化剂KBrO3也被证明会导致影响神经元兴奋性、突触功能和神经递质稳态的分子变化[45]。当前的研究结果与早期研究一致，表明KBrO3会改变细胞外神经递质水平并破坏突触通讯[44]，这些过程对于维持稳定的情绪、学习和运动协调至关重要。这一机制可能解释了我们研究中观察到的与KBrO3相关的行为异常，包括类似焦虑的行为、运动障碍和协调能力下降。
在咖啡因或KBrO3+咖啡因处理的大鼠中观察到的神经行为结果与其他毒素诱导的行为模型中的结果相似。例如，先前的研究报道，长期摄入亚硝酸钠会导致Wistar大鼠在开放场地探索、社交互动、情绪反应和学习任务方面的显著缺陷[45]。亚硝酸钠引起的异常与我们咖啡因/KBrO3模型中观察到的行为紊乱相似，支持环境毒素会破坏维持认知和情绪稳定性的基本神经化学和代谢途径的假设。本研究的一个核心贡献是证明了纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理后可以有效缓解自毁行为和与毒素诱导的纹状体功能障碍相关的更广泛神经行为障碍。在给药14天内，纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷显著逆转了自伤行为，改善了运动能力，恢复了运动协调性，增强了记忆表现，并纠正了类似抑郁的症状。这些发现与先前的报告一致，表明纳瑞金衍生物具有神经保护、抗炎、抗氧化和神经营养作用，能够缓解包括阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫在内的中枢神经系统（CNS）疾病的症状[47]。实验和行为研究还表明，纳瑞金衍生物可以增强啮齿动物模型中的学习、记忆巩固和突触可塑性[48]。
本研究的一个关键发现是，在咖啡因或KBrO3+咖啡因联合处理21天后，纹状体中丙二醛（MDA）水平显著升高。MDA是脂质过氧化的公认标志物，反映了神经元膜的氧化损伤增加，这与实验模型中的情绪紊乱和行为异常密切相关[49]。这种关系在生物学上是合理的，因为氧化应激会破坏膜流动性，损害离子通道功能，影响线粒体完整性，并最终引发导致成年大鼠神经退行性和行为功能障碍的级联反应[50]。在本研究中，KBrO3和咖啡因联合处理产生了最高的纹状体MDA水平，表明强氧化剂（KBrO3）和神经活性兴奋剂（咖啡因）之间可能存在协同或叠加的毒性作用。先前的研究也表明，KBrO3单独处理会导致大脑严重的氧化损伤，这与神经元出血、空泡形成和脑组织退行性变化有关[51]。本研究证实了早期观察结果，并进一步表明，行为障碍（如运动能力下降、焦虑加剧和记忆受损）与纹状体中的氧化应激生化证据同时发生。重要的是，使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理后，MDA水平显著降低，表明膜完整性得到显著恢复，脂质过氧化也有所减少。这种抗氧化作用可能解释了治疗大鼠中观察到的行为改善，强调了氧化应激与神经行为功能障碍之间的密切关系。
本研究还探讨了纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷对KBrO3和咖啡因中毒大鼠纹状体组织形态学变化的影响。
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**图13.** KBrO3和咖啡因中毒后大鼠纹状体组织病理学的代表性显微照片（放大400倍）。
**对照组：** 纹状体结构正常。
**KBrO3：** 纹状体中可见黑质纹状体束（细箭头）穿插在小神经元之间。
**CAF：** 纹状体中可见局部血管淤积区域（黑箭头）。
**KBrO3 + CAF：** 纹状体中可见局部血管淤积区域（黑箭头）。
**KBrO3 + HAL：** 纹状体结构正常。
**KBrO3 + NAR：** 纹状体结构正常。
**CAF + NAR：** 纹状体结构正常。
**KBrO3 + CAF + NAR：** 纹状体结构正常。
**NAR：** 纹状体结构正常。
在对照组大鼠中，纹状体结构正常（13A）。仅接受KBrO3处理21天的大鼠纹状体中可见黑质纹状体束（细箭头）穿插在小神经元之间（13B）。仅接受CAF处理21天的大鼠（13C）中亦可见局部血管淤积区域（黑箭头）。同样，同时接受KBrO3和CAF处理21天的大鼠（13D）中可见局部血管淤积区域（黑箭头）。然而，使用纳瑞金-7-O-新葫芦糖苷处理14天后，纹状体结构恢复正常（13E-13I）。因此，这里观察到的高尿酸血症支持了这样的假设：这两种物质都促进了类似于LNS（Lesch-Nyhan综合征）中看到的代谢事件。重要的是，我们的研究提供了临床前证据，将高尿酸血症与神经和行为缺陷联系起来，这与早期观察结果一致，即过量的尿酸不仅仅是一种代谢副产品，还与神经毒性有关[54]。尽管我们实验组中观察到的神经行为异常的确切机制尚未完全阐明，但现有文献指向了多个共同的途径。例如，研究表明HPRT1缺乏会导致基底节的多巴胺能功能障碍、cAMP稳态改变以及神经元能量代谢受损[53]。这一观点得到了研究的支持，这些研究表明高尿酸血症会加剧氧化应激、线粒体损伤和炎症信号传导，所有这些都会影响神经兴奋性和行为结果[53]。因此，我们处理过的老鼠体内尿酸的增加可能反映了与人类LNS相似的病理生理级联反应。我们的结果证实了早期报告，即HPRT1的基因缺陷会导致LNS患者尿酸过量产生，这是该疾病的标志性代谢特征[53]。KBrO3和咖啡因暴露后尿酸水平的升高可能因此作为嘌呤回收途径受损的功能替代指标，进一步增强了该模型的有效性。此外，先前关于嘌呤代谢异常的动物研究表明，这些异常与攻击性、强迫行为和运动障碍等行为表型相关，支持了高尿酸血症会导致神经行为缺陷的解释[54]。本研究最重要的发现是naringenin-7-O-neohesperidoside的治疗效果，它在14天的治疗后成功将血浆尿酸水平恢复到接近正常值。这表明该化合物具有强大的降尿酸和神经保护作用。早期研究证据表明，naringenin衍生物具有抗氧化、抗炎、调节嘌呤代谢和稳定线粒体的作用[54,55]。特别是，研究强调了naringenin-7-O-neohesperidoside的优越药代动力学特性，这提高了其治疗效果[54,55]。该分子在降低尿酸水平方面的能力与这些早期发现相符，并通过将其效果与类似LNS的神经行为异常联系起来，进一步扩展了其重要性。鉴于观察到的疗效，naringenin-7-O-neohesperidoside作为一种有前景的植物治疗剂出现，有可能补充或替代目前用于治疗高尿酸相关神经行为障碍的方法。目前LNS的治疗主要集中在症状管理上，还没有批准的治疗方法能够同时针对代谢缺陷和神经表现[56]。因此，我们的结果提供了新的见解，表明这种黄酮苷可能影响与尿酸控制和神经元功能相关的上游代谢途径。
神经递质失衡是LNS的一个公认特征，在LNS中，单胺（多巴胺、血清素、组胺、肾上腺素）、乙酰胆碱、丁酰胆碱和嘌呤（腺苷及其磷酸盐）都严重失调。与先前的报告一致[57]，本研究证明，咖啡因、KBrO3或其组合的暴露会诱导关键神经递质调节酶（乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）和单胺氧化酶-A（MAO-A）发生显著变化。AChE和BuChE的统计学显著下降（p<0.05）表明胆碱能传递受到明显损害，导致认知缺陷、协调能力差和记忆功能障碍。这些变化与LNS患者和实验模型中报告的胆碱能异常相符[57]，进一步验证了我们的模型。这里观察到的咖啡因和KBrO3的胆碱毒性效应与早期发现一致，即氧化性神经毒素会破坏胆碱能周转，导致乙酰胆碱和丁酰胆碱过度积累。这种积累是有害的，因为胆碱酯酶活性降低与突触通信受损和神经功能退化有关[57]。先前的研究也表明，胆碱能失调直接导致记忆丧失和认知能力下降[57]，支持了我们的解释，即本研究中AChE和BuChE活性的显著下降导致了观察到的神经行为缺陷。此外，有证据表明，异常的AChE活性可能会在大脑组织中引发过多的自由基形成[58]，这与KBrO3神经毒性通常引起的广泛氧化应激特征一致。另外，有报告指出乙酰胆碱的生物积累会抑制腹足类动物神经系统中的一氧化氮合成[59,60]，这与我们的发现一致，表明失调的胆碱能信号传导可能会干扰NO介导的神经血管和神经调节过程。这些机制可能共同导致了KBrO3和咖啡因暴露组中检测到的认知障碍。关于单胺能信号传导，我们的发现还显示，在咖啡因和KBrO3暴露后MAO-A活性显著增加（p<0.05）。已知升高的MAO-A会增强多巴胺、血清素和去甲肾上腺素等单胺的降解，从而导致神经递质可用性降低。这一观察结果与现有文献一致，这些文献指出升高的MAO-A是导致包括抑郁症[46]、睡眠障碍[62]、帕金森病[63]和阿尔茨海默病[64]在内的神经退行性疾病的分子因素。因此，本研究中升高的MAO-A活性强化了这些外源性物质引起的神经化学失衡。naringenin-7-O-neohesperidoside的治疗干预显示出令人信服的神经保护潜力，这体现在AChE、BuChE和MAO-A活性显著恢复正常（p<0.05），与未经处理的受毒组相比。这些恢复效果表明，这种黄酮苷可以改善由KBrO3和咖啡因引起的神经递质失调。类似的结果也已在naringenin及其相关柑橘类黄酮中报告，这些化合物已被证明可以增强胆碱能功能、保护神经元免受氧化损伤，并调节不同脑区的单胺能途径[65]。有趣的是，naringenin-7-O-neohesperidoside逆转了MAO-A的升高，突显了其调节单胺代谢的能力，从而对抗神经递质耗竭并支持神经信号传导的完整性。尽管母体化合物naringin具有已知的治疗效果，但越来越多的证据表明，其代谢物naringenin由于其更强的血脑屏障穿透能力而发挥了主要的神经保护作用[65]。
嘌呤能信号传导在神经化学通信、突触调节和认知功能中起着关键作用。外核苷酸酶如ATP酶和AMP酶分别将ATP水解为ADP，将AMP水解为腺苷；而腺苷脱氨酶（ADA）进一步调节腺苷的周转和嘌呤能质量[35]。在本研究中，KBrO3和咖啡因的暴露导致ATP酶和AMP酶活性显著升高（p<0.05），从而减少了大鼠纹状体中的ATP和AMP含量。高能嘌呤核苷酸的减少表明神经元功能减弱和潜在的神经退行性变化，这与先前将ATP/AMP水平降低与认知和记忆障碍联系起来的报告一致[66,67]。ATP由神经元、胶质细胞和包括血脑屏障成分在内的内皮细胞释放，对神经传递、神经调节和能量稳态至关重要[68]。可溶性外核苷酸酶通过将其分解为腺苷来调节细胞外ATP浓度，从而调节神经元兴奋性和突触强度[68]。观察到的ATP酶和AMP酶活性升高表明嘌呤代谢过度，最终导致腺苷异常积累。此外，在KBrO3和咖啡因暴露后ADA活性显著下降。ADA活性降低限制了腺苷向肌苷的转化，导致细胞外腺苷水平升高。过量腺苷已被报道会损害胆碱能神经传递，并导致LNS相关的神经功能障碍，包括自伤行为、智力障碍和运动障碍[69,70]。因此，这些发现突显了嘌呤能失调在这些毒素引起的病理生理效应中的机制作用。重要的是，naringenin-7-O-neohesperidoside治疗后的治疗效果表明它具有显著的神经保护潜力，这体现在AChE、BuChE和MAO-A活性恢复正常（p<0.05），与未经处理的受毒组相比。这些恢复效果表明，这种黄酮苷可以改善由KBrO3和咖啡因引起的神经递质失调。类似的结果也已在naringenin及其相关柑橘类黄酮中报告，这些化合物已被证明可以增强胆碱能功能、保护神经元免受氧化损伤，并调节不同脑区的单胺能途径[65]。值得注意的是，naringenin-7-O-neohesperidoside逆转MAO-A升高的能力突显了其调节单胺代谢的能力，从而对抗神经递质耗竭并支持神经信号传导的完整性。尽管母体化合物naringin具有已知的治疗效果，但越来越多的证据表明，其代谢物naringenin由于其更强的血脑屏障穿透能力而发挥了主要的神经保护作用[65]。
嘌呤能信号传导级联在神经化学通信、突触调节和认知功能中起着关键作用。外核苷酸酶如ATP酶和AMP酶分别将ATP水解为ADP，将AMP水解为腺苷；而腺苷脱氨酶（ADA）进一步调节腺苷的周转和嘌呤能质量[35]。在本研究中，KBrO3和咖啡因的暴露导致ATP酶和AMP酶活性显著升高（p<0.05），从而减少了大鼠纹状体中的ATP和AMP含量。高能嘌呤核苷酸的减少表明神经元功能减弱和潜在的神经退行性变化，这与先前将ATP/AMP水平降低与认知和记忆障碍联系起来的报告一致[66,67]。ATP由神经元、胶质细胞和包括血脑屏障成分在内的内皮细胞释放，对神经传递、神经调节和能量稳态至关重要[68]。可溶性外核苷酸酶通过将其分解为腺苷来调节细胞外ATP浓度，从而调节神经元兴奋性和突触强度[68]。观察到的ATP酶和AMP酶活性升高表明嘌呤代谢过度，最终导致腺苷异常积累。此外，在KBrO3和咖啡因暴露后ADA活性显著下降。ADA活性降低限制了腺苷向肌苷的转化，导致细胞外腺苷水平升高。过量腺苷已被报道会损害胆碱能神经传递，并导致LNS相关的神经功能障碍，包括自伤行为、智力障碍和运动障碍[69,70]。因此，这些发现突显了嘌呤能失调在这些毒素引起的病理生理效应中的机制作用。重要的是，naringenin-7-O-neohesperidoside治疗后的ATP酶、AMP酶和ADA活性恢复正常，表明它能够恢复嘌呤能平衡并保持学习和记忆功能。这些结果与先前的研究一致，这些研究表明调节外核苷酸酶活性可以支持各种神经药理学模型中的认知处理和记忆巩固[71,72,73]。值得注意的是，使用东莨菪碱诱导的痴呆模型进行的研究也报告了皮质和海马区ATP和AMP的类似减少，强调了嘌呤耗竭与认知缺陷之间的联系[74,75]。我们的发现进一步支持了这一证据，并将理解扩展到KBrO3和咖啡因引起的神经毒性。除了嘌呤能调节外，磷酸二酯酶-5（PDE51）的抑制也被广泛报道可以通过增强神经发生[76]、减少神经缺陷[77]和改善缺血损伤后的恢复[78]来改善记忆和认知表现。在本研究中，KBrO3和咖啡因中毒显著增加了精氨酸酶和PDE51的活性（p<0.05），这两种酶都会对一氧化氮（NO）的产生、cAMP信号传导和突触可塑性产生负面影响。naringenin-7-O-neohesperidoside治疗后精氨酸酶和PDE51活性的减弱表明一氧化氮-cAMP-PKA信号传导得到有效恢复，从而有助于改善认知和空间学习[79]。从机制上看，naringenin-7-O-neohesperidoside似乎通过促进CREB磷酸化和上调BDNF来增强突触功能，这两者对长期增强、学习和记忆至关重要[80]。此外，治疗后纹状体中的一氧化氮（NO）增加可能有助于改善运动能力和减少神经缺陷，这与中风恢复模型中的早期观察结果一致[78]。NO/cAMP途径在这些改善中的作用尤其值得注意。cAMP信号传导在很大程度上依赖于PKA活性和通过PDEs对cAMP水平的调节[81,82]。升高的NO可以刺激可溶性腺苷酸环化酶（AC），增加cAMP的合成[81,83]。因此，naringenin-7-O-neohesperidoside通过减少过度水解而不是直接调节PKA活性来维持cAMP水平[85,86]。尽管本研究中没有测量cAMP水平，但在未经处理的KBrO3和咖啡因暴露的大鼠中观察到的NO减少和伴随的精氨酸酶活性增加强烈表明cAMP信号传导受损。这种信号传导缺陷最近已被关联到多种神经退行性和神经精神障碍的发病机制中，包括重度抑郁症（MDD）[88,89]、多发性硬化症[90]、帕金森病（PD）和亨廷顿病（HD）[47,89]。这些关联支持了我们发现的相关性，并表明naringenin-7-O-neohesperidoside可能通过稳定NO/cAMP/PKA信号传导途径发挥广泛的神经保护作用。
本研究证明，长期暴露于KBrO3和咖啡因21天会通过显著下调HGPRT1基因来严重破坏嘌呤回收途径。这一发现非常相关，因为HGPRT1缺乏是Lesch-Nyhan综合征（LNS）的标志性遗传缺陷。处理过的大鼠中观察到的HGPRT1表达减少表明嘌呤回收的病理破坏，这与先前报告一致，这些报告将X染色体上的HGPRT1突变确定为LNS患者神经行为表现的因果遗传基础[1,11]。这些受毒大鼠中观察到的运动功能障碍、认知障碍、高尿酸血症和自伤表型进一步证实了KBrO3和咖啡因是能够模拟LNS样病理的重要神经毒性应激源。值得注意的是，naringenin-7-O-neohesperidoside治疗后，这种富含羟基功能基团的双黄酮显著上调了HGPRT1表达，从而逆转了其耗竭的分子和行为后果。先前的研究已经强调，含有酚羟基的黄酮在涉及嘌呤失调和LNS神经行为表型的疾病中具有神经保护和神经代谢益处[22]。当前数据验证了这些早期发现，并进一步表明naringenin-7-O-neohesperidoside发挥了其神经治疗作用，这与嘌呤能和神经可塑性相关机制一致。脑源性神经营养因子（BDNF）在调节神经元存活、学习和高级认知处理中起着核心作用[91]。它主要在纹状体、海马体、皮质和基底前脑等脑区活跃[91]。Bcl11b是一种转录调节因子，调节BDNF信号传导级联中的多个基因表达[92]。在本研究中，暴露于KBrO3和咖啡因的大鼠表现出Bcl11b的显著减少，伴随BDNF表达的显著下降。这种联合下调表明神经可塑性异常、突触通信受损以及学习和记忆受损[93]。这些观察结果与先前的研究一致，这些研究表明BDNF信号传导的紊乱是阿尔茨海默病[93]、亨廷顿病[94]和帕金森病[18]等神经退行性疾病的关键病理特征。值得注意的是，naringenin-7-O-neohesperidoside治疗后Bcl11b和BDNF表达均得到恢复，表明其具有强大的神经营养调节能力。Bcl11b的下调与BDNF的同时上调表明这种双黄酮重新建立了BDNF途径的适当转录控制。本研究的另一个重要发现是，KBrO3和咖啡因暴露诱导了DARPP-32的下调，DARPP-32是多巴胺能神经元中的关键信号分子。DARPP-32整合了多巴胺能、谷氨酸能和cAMP/PKA信号传导，对认知灵活性、运动功能、奖励处理和突触可塑性至关重要。其耗竭与LNS特征的神经异常和纹状体功能障碍密切相关[17]。naringenin-7-O-neohesperidoside治疗后DARPP-32的显著上调表明多巴胺能和cAMP依赖性信号传导得到了有效恢复。由于DARPP-32是PKA的主要底物，其增强也支持了naringenin-7-O-neohesperidoside在调节cAMP/PKA/DARPP-32信号传导方面的有效性，这对神经保护、突触重塑和适当的神经传递至关重要。此外，naringenin-7-O-neohesperidoside显著上调了BDNF的高亲和力受体TrkB的表达。BDNF与TrkB的结合会引发配体依赖性的二聚化以及细胞内酪氨酸残基的自磷酸化，激活对神经元存活和长期增强（long-term potentiation）至关重要的细胞内级联反应[95]、[96]、[97]。TrkB表达的恢复强烈表明，naringenin-7-O-neohesperidoside能够修复BDNF/TrkB信号通路，这对神经保护和高级认知功能至关重要。组织病理学检查进一步证实了这些生化和分子发现。暴露于KBrO3和咖啡因的大鼠表现出血管充血、黑质纹状体通路损伤以及广泛的神经元退化，这些病理特征与LNS（Lesch–Nyhan Syndrome）类似的神经病理学变化相符。然而，接受naringenin-7-O-neohesperidoside治疗的大鼠则显示出纹状体细胞结构的恢复、轻微的血管异常以及完整的神经网络。因此，naringenin-7-O-neohesperidoside被认为是一种有前景的化疗药物，能够调节与LNS发病机制相关的多种神经保护途径。
5. 结论
本研究证明，naringenin-7-O-neohesperidoside（NAR）对由咖啡因和溴酸钾（KBrO3）共同作用引起的大鼠的Lesch–Nyhan综合征（LNS）样神经行为和代谢障碍具有显著的神经保护作用和化疗效果。治疗后，NAR显著改善了LNS的典型症状（运动缺陷、运动协调障碍、类似焦虑的行为、认知功能障碍和高尿酸血症），显示出其对抗嘌呤代谢紊乱和神经毒性的能力。从机制上讲，数据表明NAR通过双重调节细胞内信号通路来恢复神经行为功能：首先，NAR使一氧化氮合酶（NOS）活性恢复正常，并重新激活cAMP/PKA通路，从而恢复被咖啡因/KBrO3毒性抑制的神经元兴奋性和突触可塑性；其次，NAR通过增强DARPP-32的磷酸化并激活BDNF/TrkB信号通路来恢复纹状体内的嘌呤稳态，这两者对突触整合、学习和记忆过程至关重要。重要的是，该研究提供了证据，表明由纹状体损伤引起的学习和记忆障碍与HGPRTI表达不足密切相关，而NAR能够在这种毒性挑战下缓解这种缺陷。总体而言，这些发现表明naringenin-7-O-neohesperidoside是一种有前景的治疗候选物，能够纠正LNS样病理中的神经行为症状和嘌呤代谢缺陷。该化合物调节NOS/cAMP/PKA及BDNF/TrkB信号通路的能力凸显了其在针对认知和运动异常背后的相互关联的代谢和神经通路方面的潜力。尽管在大鼠模型中的结果令人信服，但仍需要进一步的研究来增强其转化应用的价值。特别是，评估NAR在LNS患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经元中的效果，对于验证其上调HGPRTI表达的能力以及在人类细胞环境中确认其治疗机制至关重要。这样的研究将有助于更深入地了解其作为治疗Lesh–Nyhan综合征相关嘌呤代谢障碍和神经发育缺陷的潜在干预措施的适用性。
未引用的参考文献：[46]、[87]
CRediT作者贡献声明：
J.K. Akintunde：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、监督、项目管理、方法学、研究设计、概念化。
S.O. Salami：研究、资金获取、正式分析。
E.O. Eteng：监督。
O.O. Adeleye：监督。
A.D. Folayan：撰写——审稿与编辑。
D.A. Fadare：撰写——审稿与编辑。
T.E. Oladele：正式分析、数据管理。
