Kelch样ECH关联蛋白1/核因子红细胞2-p45相关因子2（Keap1/Nrf2）复合体调控细胞对氧化、炎症及代谢应激的防御。Nrf2功能失调参与多种慢性疾病的发病机制。稳态条件下，Keap1持续靶向Nrf2进行泛素化降解。当Keap1失活时，Nrf2积累并易位至细胞核，激活编码细胞保护蛋白的基因转录。Keap1抑制剂主要分为两类：亲电试剂和Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用（PPI）抑制剂。本研究采用定量荧光细胞热漂移实验（CETSA），探究了一系列亲电Nrf2激活剂和PPI抑制剂在稳定表达Keap1-mCherry或对照游离mCherry的细胞裂解液及完整细胞中与Keap1结合的能力。所有测试的PPI抑制剂均能提高Keap1-mCherry的热稳定性；但令人惊讶的是，可逆性结合硫醇的亲电试剂（即便为共价结合）未能提高其热稳定性。此外，用双迈克尔受体（如双亚苄基丙酮及其羟基化衍生物）处理完整细胞反而会降低Keap1的热稳定性。因此，基于Keap1的荧光CETSA不仅可在细胞环境中确认PPI抑制剂的靶点结合，还能区分两类Nrf2激活剂的作用机制，并具备经济高效、高通量应用的潜力。
一、研究背景与问题
Keap1（Kelch样ECH关联蛋白1）是调控转录因子Nrf2（核因子红细胞2-p45相关因子2）稳定性的关键E3泛素连接酶适配蛋白。在氧化、炎症等应激条件下，Keap1失活会导致Nrf2积累并激活一系列细胞保护基因的表达。目前已知的Nrf2激活剂主要包括两类：一是通过共价修饰Keap1半胱氨酸传感器（如Cys151）发挥作用的亲电化合物；二是通过非共价结合Keap1的Kelch结构域、干扰Keap1-Nrf2相互作用的蛋白-蛋白相互作用（PPI）抑制剂。虽然已有多种体外实验方法可用于验证Keap1与抑制剂的结合，但这些方法大多脱离细胞环境，难以全面反映化合物在复杂生理条件下的作用机制。因此，开发一种能够在细胞环境中直接、快速评估Keap1靶点结合，并能区分不同类型抑制剂作用模式的方法，对于药物筛选与机制研究具有重要意义。
二、研究目的与技术方法概述
本研究旨在利用荧光标记的细胞热漂移实验（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA），在细胞裂解液及完整细胞中评估多种Keap1-Nrf2 PPI抑制剂和亲电Nrf2激活剂对Keap1热稳定性的影响，进而验证该方法在监测靶点结合及区分作用机制方面的适用性。
关键技术方法包括：
- 1.
构建可诱导表达Keap1-mCherry融合蛋白（及对照游离mCherry）的U2OS和HeLa稳定细胞系，通过免疫印迹与荧光显微镜验证蛋白表达与功能。
- 2.
采用荧光CETSA流程：细胞经裂解或直接处理后，在不同温度下加热，离心去除变性聚集蛋白，通过检测上清中mCherry荧光强度反映Keap1-mCherry在溶液中的热稳定性变化。
- 3.
使用多种已知的Keap1-Nrf2 PPI抑制剂（如NG-284、PRL-295、NG-316、KI-696）和亲电Nrf2激活剂（如萝卜硫素、TBE-31、RTA-408、HBB2、DBA等）处理细胞或裂解液，浓度均基于前期研究证实可激活Nrf2的剂量。
- 4.
对部分化合物进行等温剂量响应（ITDR）分析，评估浓度依赖性热稳定效应。
- 5.
利用Keap1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）模型（表达野生型或Cys151突变体Keap1），通过免疫印迹分析DBA处理引起的Keap1高分子量物种形成。
三、研究结果
1. 可诱导Keap1-mCherry表达U2OS和HeLa细胞系的建立
研究人员利用Flp-In™ T-REx™系统构建了可在多西环素诱导下稳定表达Keap1-mCherry融合蛋白或游离mCherry的U2OS和HeLa细胞系。免疫印迹和荧光显微镜证实了诱导表达的成功，且Keap1-mCherry能与过表达的sfGFP-Nrf2相互作用，通过Förster共振能量转移-荧光寿命成像（FRET-FLIM）验证了其功能完整性。
2. 靶向Keap1的PPI抑制剂可提高Keap1的热稳定性
在HeLa细胞裂解液中，所有测试的PPI抑制剂（NG-284、PRL-295、NG-316、KI-696）均能浓度依赖性地提高Keap1-mCherry的热稳定性，而对游离mCherry无影响。在U2OS细胞中也观察到类似结果，其中KI-696在裂解液中引起的热稳定化效应强于在完整细胞中，提示其直接作用不受细胞膜通透性限制。这些结果证实PPI抑制剂在细胞环境中能与Keap1 Kelch结构域结合，并导致蛋白构象稳定化。
3. 亲电Nrf2激活剂不提高Keap1-mCherry的热稳定性
与PPI抑制剂相反，多种靶向Cys151的亲电试剂（如萝卜硫素、TBE-31、RTA-408）在细胞裂解液处理中均未引起Keap1-mCherry热稳定性的显著升高。在完整细胞中延长处理时间后，这些化合物同样未产生热稳定效应。这表明尽管这些亲电试剂可共价修饰Keap1，但其形成的加合物可能在加热条件下可逆解离，或因其不结合Kelch结构域而无法引起可检测的热稳定性变化。
4. 双迈克尔受体双亚苄基丙酮及其羟基化衍生物在细胞中降低Keap1的热稳定性
在完整细胞中，双迈克尔受体化合物HBB2和DBA处理不仅未提高Keap1的热稳定性，反而导致其热稳定性降低。进一步实验发现，DBA处理能在野生型Keap1表达的MEF细胞中引起依赖于Cys151的高分子量Keap1物种形成，且该物种不被高浓度还原剂DTT消除，提示DBA可能通过其双亲电中心交联两个Keap1分子，形成共价二聚体，进而破坏蛋白稳定性。
四、讨论与结论
本研究表明，荧光CETSA是一种简便、经济且适用于中等通量的方法，可用于在细胞环境中监测Keap1-Nrf2 PPI抑制剂的靶点结合。更重要的是，该方法能够区分两类Nrf2激活剂的作用机制：PPI抑制剂通过非共价结合Kelch结构域提高Keap1热稳定性；而多数可逆性结合亲电试剂不改变其热稳定性；双迈克尔受体则可能通过形成分子桥导致Keap1热稳定性降低。
研究结论：靶向Keap1-Kelch结构域的PPI抑制剂可增加Keap1在细胞环境中的热稳定性，而可逆结合的亲电试剂则无此效应；双迈克尔受体甚至可降低Keap1稳定性。该荧光CETSA方法既能确认PPI抑制剂的靶点结合，又能区分不同Nrf2激活剂的作用机制，具备用于高通量筛选新型Keap1-Nrf2 PPI抑制剂的潜力。
（论文发表于《RSC Chemical Biology》）
