里卡多·弗洛雷斯-克鲁兹（Ricardo Flores-Cruz）|尼齐亚·鲁伊斯-罗布莱多（Nitzya Ruiz-Robledo）|阿德里亚娜·罗莫-佩雷斯（Adriana Romo-Pérez）|阿图罗·希门尼斯-桑切斯（Arturo Jiménez-Sánchez）
墨西哥国立自治大学化学研究所，科约阿坎大学城 04510，墨西哥城
邮箱：arturo.jimenez@iquimica.unam.mx
过氧化氢（H2O2）在氧化应激、信号传导和病理生理学中起着核心作用，然而其在活细胞中高度动态且分布不均的特性使得精确监测成为一项重大分析挑战。在这里，我们介绍了一种从萘酰亚胺衍生的荧光探针，专门用于检测和成像溶酶体中的H2O2。该探针利用胺基团与H2O2反应时选择性转化为羟胺基团的现象，从而显著增强荧光强度。这种分子设计结合了溶酶体靶向单元，确保了亚细胞特异性，能够实时可视化溶酶体微环境中的H2O2波动。共聚焦荧光显微镜实验表明，该探针能够在活细胞中以高灵敏度检测内源性和外源性H2O2，并且具有极低的细胞毒性。与传统基于硼酸盐的探针不同，该探针采用了一种新型的生物相容性化学转化机制，实现对溶酶体内H2O2的敏感和选择性监测。
**引言**
在多种活性氧（ROS）中，过氧化氢（H2O2）具有独特的多功能性：在健康细胞中作为重要的第二信使，而在病理状态下则引发氧化损伤。这种双重性质使H2O2参与从免疫防御到细胞增殖等多种生理过程，其失调是癌症、神经退行性疾病和糖尿病等疾病的关键因素。因此，要准确理解H2O2的生物学作用，就必须能够追踪其在活细胞复杂环境中的生成和流动情况，尤其是在亚细胞水平上。因此，开发出在复杂生物环境中实时检测H2O2的可靠且灵敏的方法至关重要。现有的H2O2检测方法虽然多样，但常常存在灵敏度不足、在复杂生物环境中选择性差以及无法实现实时原位监测等局限性。为了实现这一目标，人们开发了多种检测策略。虽然电化学和酶促测定技术可以提供定量结果，但它们通常缺乏用于细胞器特异性分析的空间分辨率，且仅适用于细胞外环境。色谱法虽然具有高特异性，但不适合实时、无创地观察活细胞中H2O2的动态变化。借助合成分子探针的荧光显微镜技术已成为首选方法，能够在原生生物环境中提供无与伦比的时空分辨率。
在H2O2的小分子荧光探针设计方面已取得显著进展，许多最新研究集中在提高探针对细胞器的选择性上。一些探针针对线粒体，利用其膜电位；还有一些探针通过引入pH敏感的靶向基团（如吗啉）来特异性识别溶酶体。尽管取得了这些进展，但大多数H2O2探针的化学机制仍然有限。绝大多数探针依赖于硼酸盐酯识别单元，该单元在H2O2作用下发生裂解以释放荧光团。此外，现有探针大多使用常见的硼酸盐酯结构，与H2O2反应会产生酚类（或在某些情况下产生硼酸二酯）等副产物，这些物质具有细胞毒性。相比之下，我们的工作引入了一种溶酶体靶向探针，这种探针首次实现了在同一荧光团骨架内直接将胺基转化为羟胺（唑醇）衍生物，且不产生有害副产物。详细的反应机理见图S10（补充信息）。这种新型反应不仅确保了生物相容性，还扩展了H2O2选择性监测的工具箱。
**实验**
所有化学试剂和溶剂均从商业供应商（如Aldrich）购买，并按原样使用，除非另有说明。四氢呋喃（THF）在惰性氩气氛围下通过蒸馏纯化。反应进程通过薄层色谱（TLC）进行监测，使用含有UV254指示剂的硅胶板，在254和365纳米波长下观察。1H和13C核磁共振（NMR）谱在Bruker（400 MHz）和Jeol Unity（300 MHz）光谱仪上室温下获得，化学位移（δ）以四甲基硅烷（TMS）为内标，单位为百万分之一（ppm）。高分辨率质谱（HRMS）分析使用Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS系统进行，配备电喷雾离子化（ESI）源。光物理特性（包括荧光发射和UV-Vis吸收光谱）使用Edinburgh Instruments FS500荧光光谱仪或Cary Eclipse荧光计及Thermo Scientific Evolution二极管阵列光谱仪进行。
**细胞培养、共聚焦显微镜和成像分析**
人类肺腺癌细胞（SK-Lu-1, ATCC HTB-57）在RPMI-1640培养基中培养，添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）、2 µM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素G和100 µg/mL硫酸链霉素，置于37°C、5% CO2的湿润培养箱中。对于活细胞成像实验，细胞以20,000个细胞/孔的密度接种到8孔µ-Slides（ibidi, Germany）中，并在含有10% FBS的MEM Alpha培养基中孵育24小时。处理前，将细胞培养基更换为无血清MEM Alpha。随后按指定浓度（1–5 µM）将探针加入细胞中，孵育不同时间。对于共定位研究，按照制造商的方案，先向细胞中加入LysoTracker™ Deep Red（Thermo Fisher, 50 nM）10分钟，再加入探针。为了监测细胞泡的形成，另一组细胞用1 µM AztecBlebTxR27染色30分钟。所有染色步骤完成后，细胞用预热的无血清MEM Alpha冲洗两次再进行成像。
共聚焦显微镜使用Zeiss LSM 880或Nikon A1R显微镜进行，两者均配备有环境调节装置，以在整个成像过程中保持37°C和5% CO2的条件。为减少激光诱导的伪影和自发荧光，激光功率降至0.05 mW，并记录未经处理的对照细胞的背景信号并从实验图像中扣除。对于时间进程实验，每隔5分钟对显微镜腔内的细胞进行成像，持续最多4小时。所有样本的荧光图像采用一致设置采集。共染色协议用于验证探针的亚细胞定位。定量分析时，使用Fiji/ImageJ软件中的手动选择工具在至少40个细胞中手动勾画出每个条件下的感兴趣区域（ROIs）。三个独立生物重复实验的数据汇总后，结果以平均值±标准误差（s.e.m.）表示。统计分析使用GraphPad Prism软件进行，以评估观察到的差异的显著性。
**化合物合成和化学表征**
目标探针6-(2-吗啉基乙基)-1H-苯[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮的合成步骤如下：将4-溴-1,8-萘酐（1 mmol, 0.278 g）和叠氮化钠（NaN3, 3 mmol, 0.195 g）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和水（20 mL, 10∶1 v/v）的混合物中，在80°C下搅拌4小时。反应完成后，将混合物倒入冰水中（10 mL）以诱导沉淀。收集沉淀物并溶解于无水DMF（20 mL）中。然后加入水合硫化钠（NaSH, 4 mmol, 0.224 g，溶于2 mL H2O），在90°C下搅拌1小时。混合物用冰水淬灭并酸化至弱酸性，通过过滤分离沉淀物。该中间体与4-(2-氨基乙基)吗啉（1.3 mmol, 0.75 mL）在DMF（10 mL）中混合，并在氩气氛围下加热至120°C并剧烈搅拌8小时。冷却至室温后，将粗产物溶于丙酮（约25 mL），通过硅胶柱层析纯化，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇（95∶5）。最终得到黄色固体，产率为67%（0.225 g）。1H NMR（300 MHz, CDCl3）δ：8.61 (dd, J = 26.60 Hz, 1H), 8.42 (dd, J = 12.87 Hz, 1H), 8.12 (dd, J = 21.45 Hz, 1H), 7.68 (m, J = 22.32 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 13.73 Hz, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.34 (t, J = 21.45 Hz, 2H), 3.71 (m, J = 21.45 Hz, 4H), 2.72 (t, J = 26.60 Hz, 2H), 2.63 (s, 4H)。13C NMR（75 MHz, CDCl3）δ：154.2, 147.1, 133.7, 129.3, 127.2, 124.8, 122.1, 119.5, 117.21, 109.4, 107.81, 67.25, 57.16, 55.18, 36.41。HRMS（ESI+）m/z：C18H20N3O3 [M + H]+的计算值为326.14；实测值为326.1498。
羟胺产物的1H NMR谱（图S5）显示两个特征性的可交换单峰：δ 10.15 ppm处的宽峰对应–OH质子，其线宽增加反映了羟基质子的快速交换动力学；加入D2O后该峰相对于δ 11.05处的–NH–共振峰减弱，进一步支持这一归属。δ 11.05 ppm处的窄峰对应–NH–质子，其异常的去屏蔽效应归因于萘酰亚胺骨架中N–H与侧链羰基氧之间的分子内氢键，这与相关芳基羟胺的文献值一致。该产物的稳定性强烈依赖于pH值：在模拟溶酶体环境的微酸性条件下（pH 4.22, 5 mM HTAB），羟胺信号随时间保持稳定（见图2A中的时间进程荧光曲线）。而在生理pH值（7.42）下，羟胺的自由碱形式逐渐被氧化为硝基衍生物，伴随荧光减弱，这与图2B中描述的酸稳定机制一致。
**结果与讨论**
探针的荧光滴定曲线提供了支持其激活机制及其对周围微环境依赖性的有力证据。图S11（补充信息）展示了pH 4.22和pH 7.42下探针的激发和发射光谱曲线，显示了溶酶体pH下的显著荧光增强以及中性pH下由于过度氧化导致的信号减弱。在pH 4.22的5 mM HTAB胶束介质中进行的定量光物理表征显示，探针的摩尔消光系数为ε = 6550 M−1 cm−1，荧光量子产率为Φ = 0.008；H2O2激活后羟胺产物的摩尔消光系数和荧光量子产率分别升至ε = 6890 M−1 cm−1和Φ = 0.21，相当于26.3倍的荧光增强（见表S1，补充信息）。最初，探针在550 nm处荧光较弱；然而，在H2O2作用下，该波长的荧光强度显著增强。这种激活是由于氨基向萘酰亚胺荧光团的光诱导电子转移（PeT）过程受到抑制所致。为了进一步支持基于PeT的激活机制，我们构建了一个前沿轨道能量对齐图，比较了在PBE/6-31G(d,p)理论水平下的探针及其羟胺产物（见图S12，补充信息）。NBO分析证实了完整探针的最高占据分子轨道（HOMO）中氮孤对电子的显著贡献（HOMO = −5.85 eV），这与一个活跃的供体到受体PeT过程一致，该过程会抑制荧光。当探针氧化为羟胺后，孤对电子对HOMO的贡献显著降低（HOMO = −5.92 eV），并且HOMO–LUMO间隙从2.25 eV扩大到2.41 eV（ΔΔE = +0.16 eV），这证实了氧化降低了供体轨道的能量，抑制了PeT过程，并恢复了荧光发射。这种基于PeT的机制在相关的萘酰亚胺系统中已有充分的文献记载，并解释了观察到的荧光“激活”行为（见图2）。值得注意的是，该探针仅对H2O2有选择性响应，而对其他生物相关的活性氧物种（ROS），包括HOCl、ONOO−、˙OH、1O2和O2˙−，则没有显著的荧光激活。相反，这些自由基物种仅引起荧光的部分抑制，这在化学上是预期的，因为自由基的添加会与探针发生相互作用。重要的是，这种抑制不会显著干扰所需的体外H2O2监测（见图3）。
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图3. (A) 在pH 4.22和5 mM HTAB胶束介质中，40 µM探针在5当量H2O2和各种ROS作用下的荧光时间曲线（λexc = 430 nm, λem = 550 nm）。(B) 相应的条形图显示了荧光强度的变化。
一旦通过形成羟胺中间体达到最大荧光发射，信号在模拟溶酶体环境的条件下保持稳定，特别是在pH 4.22的5 mM HTAB胶束介质中。这种稳定性是一个关键发现，因为它证实了在温和酸性条件下羟胺物种得以保存，从而防止了进一步的氧化并保持了稳定的荧光响应。相比之下，当探针在生理pH（7.42）的纯水中孵育时，会发生过度氧化，导致相应的硝基衍生物的形成和荧光的完全丧失。长时间过程实验比较了pH 4.22和pH 7.42下激活探针的荧光稳定性（见图S6，补充信息），显示出显著的差异：在溶酶体pH下，一个稳定的平台期持续约44分钟，随后是缓慢的伪一级衰减（kobs = 0.0076 min−1, t1/2 = 91 min, R2 = 0.996），90分钟后仍保留了70.2%的最大信号。在中性pH下，过度氧化遵循S形动力学，衰减速率常数高出4.4倍，导致在同一时间框架内几乎完全丧失信号。这些动力学数据定量确立了羟胺产物在溶酶体条件下的稳健稳定性以及酸保护机制的效率。这种明显的差异突显了酸性溶酶体环境在稳定荧光产物和维持信号强度方面的保护作用，强调了局部环境因素在调节探针光物理响应中的重要性。重要的是，羟胺衍生物的氧化产物通过ESI-HRMS和1H NMR光谱进行了化学表征，证实了–NH–OH官能团的存在（见图S7–S9，补充信息）。
这些特性使得该探针非常适合整合到具有增强选择性和成像深度的亚细胞靶向基团中。探针设计巧妙地利用了溶酶体的独特pH值来控制氧化反应，对H2O2产生选择性和稳定的响应，同时避免了在中性环境中因过度氧化而导致的信号损失。
在体外确立了探针的机制和稳定性后，我们接下来评估了其在活细胞中的功能。我们的主要目标是确认其对溶酶体的准确靶向性，验证其对H2O2的响应能力，并展示其在追踪自噬等生理过程中的氧化还原变化中的应用。通过MTT测定法评估细胞活力，确认该探针在SK-Lu-1细胞的工作浓度范围（1–5 µM）内表现出约80%的细胞活力（约20%的细胞毒性），证明了其在活细胞荧光成像应用中的生物相容性（见图S1，补充信息）。
共聚焦显微镜成像验证了该探针的成功溶酶体靶向性。虽然在标准设置下探针的绿色通道荧光较弱，但通过优化激光功率和探测器增益，我们在蓝色通道（DAPI，λexc = 440 nm, λem = 480–500 nm）中获得了稳健的信号检测。在这些条件下，该探针有效地进入SK-Lu-1细胞并在离散的细胞质结构中积累，产生了典型的溶酶体特征性的明亮、点状染色模式。
为了明确确认这种亚细胞定位，我们使用已建立的溶酶体标记物LysoTracker™ Deep Red进行了共染色实验。所得荧光图像显示了来自该探针的蓝色信号与LysoTracker的红色信号之间的显著重叠（见图4）。这种视觉相关性得到了定量分析的强烈支持，其皮尔逊相关系数为0.935。进一步的确认来自van Steensel的互相关函数（CCF），该函数在接近零处显示出一个明显的峰值，表明两个信号的空间注册非常紧密。这些数据共同提供了确凿的证据，证明吗啉单元有效地将探针引导至酸性的溶酶体环境中，满足了后续H2O2传感应用所需的亚细胞特异性。
接下来，我们用生理相关的H2O2刺激物对该探针进行了测试。用200 µM的外源性H2O2处理细胞后，探针迅速且显著地被激活，在绿色荧光通道（λexc = 488 nm, λem = 530–550 nm）中显示出最佳发射，证实了探针能够在细胞环境中响应升高的过氧化物水平，并且至少30分钟内保持稳定的荧光信号（见图5A）。H2O2刺激下从蓝色通道到绿色通道的转换直接反映了PeT的抑制：完整的探针在蓝色通道（λexc = 440 nm, λem = 480–500 nm）中仍有残余发射，而羟胺产物在绿色通道（λexc = 488 nm, λem = 510–550 nm）中显示出红移且显著增强的发射。
更重要的是，用佛波尔12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）刺激时，在溶酶体点状结构中也观察到了类似的荧光“激活”响应（见图5B）。有趣的是，PMA诱导的内源性ROS产生也在线粒体位置产生了微弱的绿色通道信号（见图5B，黄色箭头），而在直接添加外源性H2O2时则没有这种信号（见图5A）。这可能有几种解释：(i) NOX衍生的H2O2从其产生部位被动扩散到邻近的线粒体；(ii) 有一小部分探针位于线粒体中，使其对局部产生的ROS敏感；或(iii) NOX激活后的细胞器间ROS通信。区分这些可能性需要进一步的研究，例如使用线粒体特异性ROS清除剂或双细胞器共成像策略，这是未来工作的一个有吸引力的方向。
该探针性能的一个关键方面是其在溶酶体复杂氧化还原环境中对H2O2的特异性响应。虽然可能存在其他活性物种，如羟基自由基（˙OH），它们可能会淬灭形成的荧光团，但重要的是要注意这些物种不会引发荧光的激活。激活机制是由H2O2介导的羟胺氧化所特异性控制的，这种反应在其他ROS/RNS条件下不会发生。因此，观察到的荧光增强可以自信地归因于H2O2，从而确立了该探针在活细胞环境中的高操作特异性。
在外源性H2O2添加和内源性PMA刺激之间观察到的不同响应特别具有启示性。在内源性ROS产生期间出现线粒体信号表明细胞的天然信号网络被激活。PMA诱导的NOX活性可能产生一个局部的氧化还原信号，该信号传递到线粒体，可能是作为协调的细胞器间通信事件的一部分，如氧化还原传递或钙信号传导。这种现象在直接应用外源性H2O2时将被完全掩盖。该探针捕捉这种细微差异的能力突显了其独特价值；它不仅仅是一个被动报告H2O2浓度的工具，而是一个实时可视化特定细胞器ROS信号级联的主动工具。这使该探针能够研究关于氧化还原信号如何在细胞器之间生成、包含和传递的基本问题。
最后，为了展示该探针在细胞生物学中的实际应用，我们使用它来监测SK-Lu-1细胞自噬过程中的H2O2动态。自噬是通过饥饿（HBSS缓冲液）和化学试剂雷帕霉素诱导的。时间延迟共聚焦显微镜显示，自噬诱导导致新形成的荧光点状结构中的H2O2特异性荧光明显增加，这与自噬体和自噬溶酶体等自噬囊泡一致（见图6）。我们注意到，这些结构的分子身份尚未通过共标记自噬体特异性标记物（例如LC3）来确认；它们被归类为自噬囊泡是基于它们的形态、动态的溶酶体融合和分裂行为，以及饥饿诱导的自噬与溶酶体ROS生成之间的已知关联。计划在未来工作中使用LC3报告器进行共免疫荧光确认。然后，使用该探针可视化了自噬过程中的溶酶体动态相互作用。如图6所示，培养在无血清介质中的细胞的共聚焦时间延迟成像揭示了4分钟内的一系列溶酶体融合和分裂事件。在图6a中，观察到两个溶酶体经历了一个特征性的“接触并转移”事件，它们逐渐接近、短暂相互作用以交换内容物，然后分离。在图6b中，捕捉到一个部分融合事件，其中溶酶体建立了稳定的接触区但未完全合并。图6c描绘了一个完全融合事件，两个溶酶体完全合并成一个细胞器，同时保持相对于周围结构的独立运动性。最后，在图6d中，我们记录了一个罕见的解离事件，其中一个融合的溶酶体对逐渐分离，直到完全分离和空间分离。这一结果成功捕捉到了溶酶体H2O2通量的动态、生理相关的增加，突显了该探针的灵敏度及其揭示细胞内活性氧物种作用的潜力。然而，当前的研究没有包括使用自噬抑制剂（例如bafilomycin A1或3-甲基腺嘌呤）的药理学阴性对照，这将正式排除观察到的荧光增强是由一般应激反应引起的。这一重要的对照是未来使用该探针进行自噬相关研究时的优先事项。
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图6. 该探针检测到SK-Lu-1细胞中饥饿诱导的自噬过程中溶酶体H2O2通量的动态增加。上图：用HBSS缓冲液处理的SK-Lu-1细胞的全场共聚焦显微镜图像，以诱导自噬（明场和绿色通道，GFP：λexc = 488 nm, λem = 510–550 nm）。白色框表示下面时间延迟系列（a–d）中显示的区域。下图：（a–d）中框选区域的更高放大倍数的时间延迟系列（4分钟间隔），显示单个溶酶体中的荧光。这些图像展示了溶酶体的动态过程，包括“亲吻与转移”（kiss-and-transfer）、部分融合、完全融合以及解离等。为了减少光漂白现象，在每次记录之间都会对共聚焦激光器进行完全屏蔽。箭头指示了溶酶体的移动方向。比例尺 = 20 µm。
**结论**
本研究介绍了一种基于萘酰亚胺的荧光探针，该探针专为选择性检测溶酶体内的过氧化氢而设计。该探针的核心创新在于其独特的传感机制：过氧化氢能够触发胺类物质转化为羟胺，而这种转化过程受到溶酶体天然酸性环境的稳定作用，从而防止过度氧化，并确保荧光信号的可靠性和响应性。在活细胞中的共聚焦显微镜实验验证了该探针对溶酶体的高度特异性，以及其追踪来自外部刺激和内部细胞过程（如自噬）的过氧化氢流动的能力。更广泛地说，这一发现填补了氧化还原生物学领域的一个重要方法学空白——将研究重点从已被广泛研究的线粒体转移到同样重要但研究较少 的溶酶体上。这一工具为挑战以线粒体为中心的细胞氧化信号传导观点提供了新的化学手段。我们预期该探针将成为未来研究的基础工具，支持同时监测不同细胞器中活性氧（ROS）的多重检测方法。这类方法对于解析细胞器间的氧化还原通信机制及其对细胞生理和疾病机制的深远影响至关重要。
**作者贡献**
Ricardo Flores-Cruz：方法学设计、成像显微镜技术；
Nitzya Ruiz-Robledo：合成与化学表征；
Adriana Romo-Pérez：细胞培养、成像实验；
Arturo Jiménez-Sánchez：数据分析、原始稿撰写、资金申请。
**利益冲突**
作者声明不存在任何利益冲突。
**数据可用性**
支持本研究结果的所有数据均包含在文章及其补充信息（SI）中。本研究过程中未生成新的代码或软件。原始数据文件可应合理要求向通讯作者索取。补充信息包括原始光谱数据（核磁共振、高分辨率质谱、紫外-可见光谱及荧光光谱）及其他实验细节。详见DOI：https://doi.org/10.1039/d6ra00730a。
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