拉尔斯·斯特劳布（Lars Straub）|安杰莉克·吕费纳赫特（Angélique Rüfenacht）|丹妮拉·格罗斯阿尔（Daniela Grossar）|卢卡斯·耶克尔（Lukas Jeker）
瑞士伯尔尼大学兽医科学学院蜜蜂健康研究所
**摘要**
随着对可持续作物保护需求的增加，昆虫病原线虫（Entomopathogenic Nematodes, EPNs）作为合成农用化学品的生物替代品受到了越来越多的关注。然而，这些线虫对传粉者的潜在非目标影响仍知之甚少，而且监管机构的批准往往基于有限的数据。本文首次证明了叶面施用的Steinernema carpocapsae（Nemastar®）对成年蜜蜂（Apis mellifera）的负面影响。通过修改后的监管协议（USEPA 850.3030），成年蜜蜂和大蜡蛾幼虫（Galleria mellonella；阳性对照）在干燥和湿润条件下分别暴露于实际田间剂量下的低剂量和高剂量EPN（0.25–2.5 × 10^6 感染性幼虫/m^2）中，持续96小时。每天记录成年蜜蜂和大蜡蛾幼虫的死亡率。结果显示，Steinernema carpocapsae显著降低了两种昆虫的存活率，尤其是在湿润和高剂量条件下死亡率更高。使用White陷阱和标准化计数方法确认了死亡个体中的线虫感染和繁殖情况，揭示了物种、剂量和施用方式之间的差异。我们的研究提供了新的证据，表明叶面施用S. carpocapsae可能对成年蜜蜂产生不利影响。我们建议将叶面施用限制在夜间（即黄昏后），以减少传粉者接触的风险。同时，我们强调迫切需要开展标准化监管研究，以确保EPN产品在获得批准和广泛使用前具有充分的环境安全性证据。
**1. 引言**
农用化学品在全球生物多样性下降中起着决定性作用（Brühl和Zaller, 2019），合成杀虫剂导致包括传粉者在内的昆虫种群大量减少（Dicks等, 2021）。由于传粉者提供关键的生态系统服务并支撑农业生产力，减少它们接触有害农用化学品已成为可持续食品生产的优先事项，这推动了有效且环境友好的害虫管理替代方案的发展。昆虫病原线虫（EPNs）因其天然来源、相对的宿主特异性以及与综合害虫管理（IPM）计划的兼容性而受到广泛推广（Gaugler, 2002）。
Steinernema和Heterorhabditis属的昆虫病原线虫是专性昆虫寄生虫。感染性幼虫（Infective Juveniles, IJs）通过自然开口进入宿主体内并释放共生细菌（Xenorhabdus spp.或Photorhabdus spp.），导致宿主因败血症死亡（Campos-Herrera, 2015; San-Blas等, 2024）。在宿主体内，IJs繁殖，其后代（即新的IJs）从原始宿主体内扩散寻找新的宿主。它们易于大规模生产、在土壤中持久存在，并对土壤中的昆虫害虫具有高效性，使其成为农业害虫管理的宝贵工具（Lacey和Georgis, 2012; Gümüş Askar等, 2022; Blanco-Pérez等, 2024）。虽然传统上EPNs是通过土壤灌施使用的（Shapiro-Ilan和Dolinski, 2015），但越来越多的产品被开发用于针对地上害虫的叶面喷洒，例如番茄潜叶虫（Tuta absoluta）和洋葱蓟马（Thrips tabaci）（Al-kazafy等, 2016; Metwally等, 2025）。叶面施用需要较高的湿度，这有助于提高IJs的存活率、移动性和附着能力，从而增加感染成功率（Grant和Villani, 2003; Radová和Trnková, 2010; Rohde等, 2010; Shapiro-Ilan等, 2006; Shapiro-Ilan和Lewis, 2024）。然而，这些条件也可能同时增加非目标昆虫（如处理过的植被上或施用过程中的传粉者）的暴露风险，但相关数据仍然不足。
监管机构通常将EPNs归类为低风险产品，允许快速批准，且对传粉者安全数据的要求有限或无需（Hokkanen等, 2003; Ramakuwela等, 2025）。然而，已有报道指出EPNs会感染非目标生物，包括有益昆虫（例如Bathon, 1996; Sandhi和Reddy, 2019; Erler等, 2022）。例如，使用Heterorhabditis spp.和Steinernema spp.的实验室研究表明，EPNs会导致成年蜜蜂及其幼虫的死亡率随剂量增加而增加（Hackett和Poinar, 1973; Shamseldean等, 2004）。此外，Dutka等（2015）发现通过受污染土壤接触EPNs的大黄蜂感染率和死亡率较高，这引发了对其安全性的质疑。尽管人们对叶面施用EPNs的兴趣和需求不断增长（例如Sáenz-Aponte等, 2020; Moisan等, 2024; Perier等, 2025），但它们对非目标物种（特别是传粉者）的潜在风险仍需进一步评估。
本研究在实验室条件下调查了Steinernema carpocapsae IJs叶面施用对成年蜜蜂（Apis mellifera）存活率的影响，比较了直接喷洒（湿润条件）和喷洒后（干燥条件）两种情况。我们评估了（i）S. carpocapsae IJs是否能在成年蜜蜂体内感染和繁殖，以及（ii）剂量和施用方式如何影响感染成功率和死亡率。基于以往的研究（例如Rohde等, 2010; Dutka等, 2015），我们假设在高湿度条件下（直接喷洒）接触S. carpocapsae会显著提高感染成功率，从而导致更高的繁殖率和宿主死亡率。我们的研究结果为政策制定者提供了实证数据，并强调了在EPN产品上市前进行标准化传粉者风险评估的必要性。
**2. 方法**
**2.1. 实验设置**
本研究于2022年4月至8月在瑞士伯尔尼的蜜蜂健康研究所和Agroscope瑞士蜜蜂研究中心进行。为了研究Steinernema carpocapsae IJs对成年雌性蜜蜂（工蜂，A. mellifera）的影响，我们采用了修改版的OCSPP 850.3030叶面协议（USEPA, 1996）。具体操作如下：从三个当地无关的、采用最佳管理实践（包括前一个夏季和冬季使用Formic酸70%和草酸2.7%处理Varroa destructor螨虫）的蜂群中获取工蜂（Dietemann等, 2013）。为了获得已知年龄段的工蜂，我们通过打开密封的育虫房并检查成虫的颜色来选择24小时内刚孵化的个体（Human等, 2013）。然后将育虫房转移到设定为34.5°C、60%相对湿度和完全黑暗的实验室培养箱中24小时（Williams等, 2013）。孵化后，检查工蜂是否有疾病症状、身体异常或寄生螨虫（V. destructor）感染（Dietemann等, 2013）。排除有异常（如翅膀畸形）或V. destructor感染的个体以避免混淆因素。此外，我们还从当地供应商（Fischereibedarf N. Wenger AG, 伯尔尼, 瑞士）购买了大蜡蛾（Galleria mellonella L.）的L4幼虫。选择G. mellonella作为阳性对照，因为它们常用于包括S. carpocapsae在内的EPNs的大规模生产（Metwally等, 2012）。所有三个蜂群的新生蜜蜂和大蜡蛾幼虫被随机分配到塑料饲养笼[750 cm^3]中，笼内放置一块预先切割的香蕉叶（Musa tropicana，尺寸10 × 15 cm）和盖子上的网状网格以利于通风（见补充材料SM图1A）。为保持叶片新鲜并在暴露期间不萎蔫，在叶片下方放置了湿润的滤纸。每个笼子包含十只工蜂（总笼数=54；总蜜蜂数=540）或十只大蜡蛾幼虫（其中一个笼子只有六只幼虫；总数量=506）。对于工蜂，每个笼子配备了一个5 mL的注射器（Codan Medical AG, 瑞士），提供随时可取的蔗糖溶液（50% [w/v]）和含有蜜蜂采集的花粉（90%）与蜂蜜（10%）的花粉喂食器。
**2.2. 处理和IJs悬浮液的制备**
实验设计包括三个组：（i）测试物质（EPN处理），（ii）阳性对照（即dimethoate），以及（iii）阴性对照（即自来水）。每个处理组评估两种施用情况（即直接喷洒在叶片上（湿润条件）和叶片上的干燥残留物（干燥条件）。尽管指南（OCSPP 850.3030）未要求，但包含dimethoate作为阳性对照是为了确认测试的可靠性和敏感性，这与其在监管毒性测试中的广泛应用一致（Gough等, 1994）。EPN处理包括两种实际田间施用剂量的S. carpocapsae IJs：低剂量（250,000 IJs/m^2）和高剂量（500,000 IJs/m^2）。虽然本研究使用的产品目前在瑞士尚未获准用于叶面施用，但选定的施用浓度基于类似产品（Capsanem®，Koppert，无日期）的推荐剂量。因此共有八个实验处理组：1. 无IJs且干燥条件（=阴性对照干燥），2. 无IJs且湿润条件（=阴性对照湿润），3. Dimethoate且干燥条件（=阳性对照干燥），4. Dimethoate且湿润条件（=阳性对照湿润），5. IJs低剂量且干燥条件（= EPN低干燥），6. IJs低剂量且湿润条件（= EPN低湿润），7. IJs高剂量且干燥条件（= EPN高干燥），8. IJs高剂量且湿润条件（= EPN高湿润）。由于工蜂和大蜡蛾幼虫都接受了这八种处理，因此完全交叉的实验设计共有16个处理组。所有处理组的IJs悬浮液均按照标准化指南（OECD, 1998）使用自来水制备。EPN产品（Nemastar®）通过www.bioprotect.ch从Agroline Bioprotect（Aesch, 巴塞尔, 瑞士）在线购买。该产品含有约5000万S. carpocapsae IJs，与500 mL水混合制成浓度为100,000 IJs/mL的悬浮液。通过使用5 μL的IJs悬浮液样本并使用Neubauer计数室（Thermo Fischer Scientific, 美国）在光学显微镜（Olympus BX41, 瑞士）下进行三次计数来确认浓度。阳性对照dimethoate（Sigma-Aldrich, 美国，批号BCCF3993，CAS: 60–51-5；Stähler Suisse SA, Zofingen, 瑞士）是通过将30.1 mg dimethoate溶解在1 L自来水中制备的，得到活性成分浓度为0.031 μg/μL的测试溶液。选择的表面施用剂量为4550 μg/m^2，相当于实际田间剂量45.5 g/ha（Pistorius和Steeger, 2025）。对照溶液仅使用自来水。
为了模拟实际田间的2D施用情况（最大用水量为1250 L/ha），在指定区域内标记了一个1 m^2的正方形区域进行喷洒。为了验证喷洒和喷嘴通过（可调黄铜喷嘴（Super Star 1.25, Spray-Matic 1.25 P/N，Birchmeier Sprühtechnik AG, Stetten, 阿尔高, 瑞士）是否会影响EPN的活力或物理完整性，在喷嘴通过前后对IJs进行了显微镜检查。未观察到喷洒前后样本之间的可见损伤或活力损失。喷洒到叶片后也确认了IJs的完整性。补充信息（SM图2）中提供了代表性显微照片，表明在所使用的施用条件下，喷嘴对IJs活力的影响可以忽略不计。
手持喷雾器（Super Star 1.25 / 360°，Birchmeier Sprühtechnik AG, Stetten, 阿尔高, 瑞士）的出水量为每17秒125 mL。根据喷雾器的目标出水量（125 mL/m^2），为每个处理组准备了1 L的施用溶液。然后，将处理组的IJs悬浮液均匀喷洒在指定的1 m^2区域内，每个区域对应一种处理方式（例如阴性对照、阳性对照、EPN低剂量和EPN高剂量）。每次喷洒后测量剩余体积，以计算每平方米的最终处理剂量（见SM表1）。在随机分配到八个处理组之前，所有昆虫样本均用CO2麻醉10秒。对于湿润条件，将样本放入饲养笼中，然后直接将处理组的IJs悬浮液喷洒在叶片上。对于干燥条件，将饲养笼喷洒后置于室温下干燥60分钟，待叶片完全干燥后再加入样本。研究在三天内进行了三次独立实验，每次使用新准备的昆虫样本和处理组IJs悬浮液，以确保充分的生物学和技术重复性。每次实验中每个处理组包含三个饲养笼。所有储藏笼子都放置在温度为25°C、相对湿度为60%的培养箱中，并处于完全黑暗的环境中（Williams等人，2013年）。2.3. IJ在叶片上的存活情况作为初步的独立评估，我们评估了IJ在处理过的叶片上的存活情况，以确认在昆虫引入时（干燥条件下）线虫的存活能力。另外准备了三个没有昆虫的笼子，这些笼子也暴露于低剂量的IJ处理悬浮液中。这项评估是在室温下干燥60分钟后进行的，代表了上述描述中的保守（“最坏情况”），因为已知EPN在潮湿条件下的存活率更高（Ramakrishnan等人，2022年）。干燥后，使用立体显微镜（Olympus，SZX7，20倍放大）检查了笼子。每个笼子随机选择了八个视野进行评估，记录了总的IJ数量和不动（死亡）的个体以计算死亡率。在60分钟干燥期后（即时间点0）以及之后每5分钟重复计数，直到所有IJ都死亡。如果轻轻搅动后没有观察到运动，则将IJ分类为死亡。2.4. 成年蜜蜂和大蜡蛾幼虫的存活情况、IJ感染情况以及IJ的繁殖情况暴露后四天内每天记录存活情况，这与OCSPP 850.3030叶片协议的急性毒性框架一致（USEPA，1996年），尽管EPN引起的死亡率可能会超过这个时期（Dillman等人，2012年）。无论处理组如何，死亡的标本都被转移到White陷阱中（White，1927年），以便收集在受感染标本内繁殖的线虫。White陷阱是根据Orozco等人（2014年）的协议设计的。简而言之，每个陷阱由两个不同大小的培养皿组成（即直径30毫米和60毫米）。较小的培养皿放在较大的培养皿内，并在较小的培养皿中放置一张圆形滤纸[25平方厘米]，然后将死亡的标本放在上面。然后，在较大的培养皿中加入20毫升自来水，并用较大的培养皿盖覆盖较小的培养皿。如果昆虫标本被感染，IJ最终会从标本中出来，迁移到外部寻找新的宿主，并最终落入较大的培养皿中的水中（见图1B）。White陷阱被放置在培养箱中，保持24°C和60%的相对湿度下的完全黑暗环境。标本在白色陷阱中至少放置三周，以确保IJ有足够的时间繁殖并从标本中迁出。根据Dutka等人（2015年）的方法，对每个White陷阱中的50微升水样进行IJ计数，然后根据White陷阱中剩余的水量调整计数，以估计每只受感染蜜蜂产生的线虫总数。计算公式如下：总感染幼虫数 = 剩余液体体积（微升）× 每个样本中的平均线虫数。如果在White陷阱的水溶液中未检测到IJ，则在双筒显微镜（Olympus SZX7，Evident Europe GmbH，汉堡，德国）下解剖标本以确认没有IJ。此外，所有在四天暴露期间存活的个体都在双筒显微镜下解剖，以确认它们的感染状态（见图1C和D）。下载：下载高分辨率图像（589KB）下载：下载全尺寸图像图1. 使用Kaplan-Meier生存曲线可视化累积存活率。通过两种应用场景（即干燥和湿润），评估了不同剂量（即低剂量和高剂量）的昆虫病原线虫（EPN）对（A和C）大蜡蛾幼虫（Galleria mellonella）和（B和D）工蜂（Apis mellifera）存活的影响。除了G. mellonella的干燥暴露外，无论是哪种物种，湿润暴露以及低剂量和高剂量的EPN暴露都对存活率有显著的负面影响（所有P值<0.01）。虽然线条代表不同的处理组，但线条周围的阴影区域代表95%的置信区间。使用Bonferroni校正的事后成对比较方法识别出处理组之间的显著统计差异（P<0.05），并用小写字母表示（即a、b、c、d）。2.5. 统计分析统计分析使用STATA16（StataCorp. 2019。Stata统计软件：版本16。College Station，TX：StataCorp LLC）进行，而所有统计图表均使用NCSS23（NCSS版本23，统计分析软件，Kaysville，犹他州，美国）创建。所有结果变量（即死亡率[%]、感染率[%]、线虫计数[n]）都使用分位数-分位数图进行视觉检查，并使用Shapiro-Wilk检验（P<0.05）和Levene检验方差同质性进行正态性检验。根据需要，使用广义线性或逻辑混合效应模型分析解释变量和响应变量之间的关联。模型分别使用glm或ologit函数拟合。单个标本（即成年蜜蜂或大蜡蛾幼虫）被视为独立观察值，而“暴露”（即是否暴露于IJ）、“物种”（即A. mellifera和G. mellonella）、“暴露场景”（即干燥或湿润）和“剂量”（即低剂量或高剂量）作为所有模型中的固定解释因素。在相关情况下，将交互项（例如“暴露场景#剂量”）作为固定因素纳入。为了考虑嵌套效应，将“运行”（即重复次数）作为协变量纳入，并将“笼子”作为随机效应，以避免由于笼子内的个体嵌套而产生的伪重复。对于每个多元回归模型，应用逐步向后消除方法来确定最佳拟合模型（Wiegand，2010年）。通过使用lrtest函数和estat ic函数，分别使用似然比（LR）检验和赤池信息量准则（AIC）比较每个多水平模型与其单水平模型对应物来选择最佳拟合模型。使用bmct函数和bonferroni选项进行事后比较，以比较所有处理组之间的变量（必要时）。有关每个模型的具体细节，包括Shapiro-Wilk结果、应用的分布、协变量、固定效应以及每个变量应用的STATA函数，可以在SM表2中找到。使用Kruskal-Wallis单因素方差分析（校正了平局）比较了0分钟、5分钟和10分钟时的IJ存活率，随后进行Bonferroni校正的所有成对多重比较测试。其余的生存分析使用mestreg函数进行多水平生存模型分析（Cleves，2002年），并使用stset函数设置生存时间，并使用if选项处理被审查的个体。使用streg函数为多水平生存模型拟合不同解释因素之间的生存差异（Leckie，2010年）。通过使用累积存活率[%]计算四天后的存活情况，并使用Kaplan Meier曲线和95%置信区间（CI）来可视化数据。使用逻辑回归评估感染率[%]，其中假设回归的条件分布为伯努利分布。IJ计数[n]使用高斯分布进行建模，模型中保留的固定解释变量是“物种”、“暴露场景”和“剂量”，并将“运行”作为随机效应。在文本中报告了适当的平均值±标准误差（SE），包括样本大小、平均值、标准误差以及95%置信区间的上下限。3. 结果3.1. 存活情况干燥后IJ的存活率显著下降（Kruskal-Wallis；χ2 = 61.73，df = 2，P < 0.001），从0分钟时的100%±0下降到5分钟时的8.2%±26.45，以及10分钟时的0%±0（中位数[%]±SD）。事后Bonferroni比较确认所有时间点之间存在显著差异（P值<0.001；见图3）。与对照组相比，敌百虫暴露显著增加了昆虫标本的死亡率（z = −17.04；P < 0.001）。相比之下，对照暴露场景（即干燥或湿润）没有显著影响（z = 1.25；P < 0.21）。四天后的总体对照组死亡率为45%，而敌百虫在一天内导致100%的死亡率（见图4）。在两个物种中，与EPN相关的解释变量（即暴露、暴露场景和剂量）显著影响了存活率（所有z值<11.0；所有P值<0.001；见SM表2）。此外，观察到G. mellonella和A. mellifera之间的存活率存在显著的物种特异性差异（z = −5.12；P < 0.001；见SM表2）。为了便于概述解释变量的影响，我们分别为这两个物种运行了单独的模型，以及评估暴露场景和剂量影响的独立模型。对于两个物种，对照组存活率不受暴露场景的影响（即干燥或湿润；两个z值>−2.39；两个P值>0.10），G. mellonella的累积存活率为78±5%，A. mellifera的累积存活率为54±1%（累积存活率[%]±S.E.；见图1A&B）。然而，湿润EPN暴露显著增加了两个物种的死亡率（两个z值>−2.12；两个P值<0.034；见图1A&B）。虽然G. mellonella的EPN干燥和湿润处理组与其各自的对照组有显著差异（所有P值<0.001；见图1A），但A. mellifera的情况则相反。在这里，只有EPN湿润处理组与对照组有显著差异（两个P值<0.001；见图1B）。对于A. mellifera，EPN干燥处理组与任何对照组都没有显著差异（两个P值>0.20）。最后，对于两个物种，EPN湿润处理组的死亡率显著最高（所有z值<−8.49；所有P值<0.001；见图1A&B），G. mellonella的存活率为0%，A. mellifera的存活率为11.2±2%。在两个物种中都检测到剂量依赖性的存活率下降（两个z值>2.22；两个P值<0.02），高剂量导致死亡率高于低剂量（见图1C&D）。总体而言，对于G. mellonella和A. mellifera，对照组存活率最高（78.6±4%；54.1±4%），其次是低EPN处理（6.1±2%；38.6±4%）和高EPN处理（1.2±1%；28.3±3%；见图1C&D）。3.2. IJ感染率所有对照组均未受到EPN感染。总体IJ感染率在物种之间存在显著差异（z = −5.74；P < 0.001），其中G. mellonella的感染率高于A. mellifera。当比较不同物种之间的相应处理组时，这种效应也是一致的（所有z值<−5.74；所有P值<0.001）。无论物种如何，暴露场景显著影响了感染率（z = 4.26；P < 0.001），湿润场景增加了感染率（见图2）。同样，IJ暴露剂量的增加显著影响了两个物种的感染率（z = 5.40；P < 0.001；见图3）。然而，观察到物种特定的感染率差异。对于G. mellonella，只有EPN湿润和高剂量处理组与其余处理组有显著差异（所有z值>4.35；所有P值<0.001），显示出最高的感染率（100%），而其余处理组的平均感染率为87%（见图2）。相比之下，对于A. mellifera，EPN湿润和高剂量处理组（94%）显示出最高的感染率，这与其余处理组有显著差异（z = 6.11；P < 0.001；见图2）。此外，A. mellifera的EPN湿润和高剂量（77%）处理组之间的感染率没有显著差异（z = −1.20；P = 1.0；见图3）。最后，A. mellifera的EPN干燥和低剂量（26%）处理组的感染率最低，并且与其他所有处理组有显著差异（所有z值>4.35；所有P值<0.001；见图2）。下载：下载高分辨率图像（375KB）下载：下载全尺寸图像图2. 在不同（即干燥或湿润）叶片暴露场景下，Steinernema carpocapsae的感染率。误差条图显示了暴露于低和高浓度昆虫病原线虫（EPN）的大蜡蛾幼虫（Galleria mellonella）和工蜂（Apis mellifera）的感染率，这些条件包括湿润（直接喷洒）或干燥（喷洒后）条件。对照处理没有感染，因此没有显示。浓度和暴露场景都显著影响了两个物种的感染率（两个P值<0.001）。使用Bonferroni校正的事后成对比较方法识别出处理组之间的显著差异，并用小写字母表示（即a、b、c、d）。下载：下载高分辨率图像（362KB）下载：下载全尺寸图像图3. 使用误差条图可视化昆虫病原线虫（EPN）的繁殖情况。EPN的增殖量是通过每只宿主体内的感染性幼虫（IJs）[IJs host−1]来测量的，在（A）大蜡蛾幼虫（Galleria mellonella）和（B）工蜂（Apis mellifera）中，这些宿主暴露于不同剂量（即低剂量和高剂量）下，并在不同的暴露情景（即湿润或干燥）中进行了研究。剂量和暴露情景都显著影响了两种物种的感染率（所有P值<0.02）。条形图显示了平均值（箱形图）和标准误差（水平黑色条和点），黄色和红色条分别代表在干燥和湿润暴露情景下的低剂量和高剂量IJ。使用Bonferroni校正的后续成对比较发现了处理之间的显著统计差异（P<0.05），并用小写字母表示（即a、b、c）。
3.3 IJ增殖
无论物种如何，应用情景和剂量都对IJ数量有显著的正面影响（所有z值>2.48；所有P值<0.013）。此外，独立于应用情景和剂量，G. mellonella的IJ数量显著高于A. mellifera（z=21.09；所有P值<0.001）。对于G. mellonella，湿润和高剂量处理组（1272±114）显示出最高的IJ数量，但与低剂量和湿润处理组（1082±100）相比没有显著差异（平均值[n]±标准误差；z=0.32；P=1.0；图3A）。同样，低剂量和湿润处理组与高剂量和干燥处理组（885±161）之间没有显著差异（z=1.65；P>0.59），但它与低剂量和干燥处理组（824±101）有显著差异（平均值[n]±标准误差；z=2.93；P<0.02；图3A）。G. mellonella的干燥和低剂量处理组与干燥和高剂量处理组之间没有显著差异（z=0.32；所有P值=1.0；图3A）。对于A. mellifera，干燥和低剂量处理组与所有处理组都有显著差异（z=5.27；P<0.001；图3B），显示出最低的IJ数量（9±4；每只蜜蜂的平均IJs[n]±标准误差）。干燥和高剂量（19±3）以及湿润和低剂量（25±3）处理组之间没有显著差异（每只蜜蜂的平均IJs[n]±标准误差；z=0.40；P=1.0；图3B）。A. mellifera的湿润和高剂量处理组与所有处理组都有显著差异（z<5.27；P<0.001；图3B），显示出最高的IJ数量（47±3；平均值[n]±标准误差）。
4. 讨论
数据提供了有力证据，表明在实验室条件下，叶片暴露于EPN Steinernema carpocapsae会显著降低成年蜜蜂（Apis mellifera）的存活率。在湿润（直接喷洒）和高剂量应用条件下，死亡率比对照组增加了近70%。这些发现与先前关于EPN接触后对成年蜜蜂致命影响的报告一致（Shamseldean等人，2004年；Dutka等人，2015年），并表明商业上使用的EPN制剂可能对非目标生物产生不利影响，包括传粉者（Bathon，1996年；Shapiro-Ilan等人，2006年；Erler等人，2022年）。总体而言，这些结果表明，当前的EPN产品监管评估可能无法充分捕捉到对传粉者的潜在风险。
我们的方法论改编自标准化的化学残留物测试协议（USEPA，1996年），但在应用于活的生物控制剂如EPN时显示出结构上的局限性。蜜蜂（约45%）和蜡蛾幼虫（约22%）的对照死亡率超过了推荐的20%的有效性阈值，表明为合成化学品开发的协议并不容易转移到具有不同暴露途径和环境要求的生物上（Candolfi等人，2000年；Erler等人，2022年）。在蜡蛾幼虫中，较高的死亡率可能反映了它们对高湿度和食物可用性的依赖性，而这在标准化的残留物测定中并未得到充分考虑（Lacey和Georgis，2012年）。在蜜蜂中，死亡率似乎与测试的早期生命阶段和笼子设计有关，而不是处理效果本身。新出现的工蜂具有较少的角质层脂质和较弱的防水性（Lockey，1988年；Kather等人，2011年），这增加了在封闭暴露环境中对湿度诱导压力的敏感性。此外，一些个体可能未能找到安装在笼子盖上的喂食器而挨饿，尽管食物是自由可获得的。总的来说，这些发现反映了将残留物测试框架应用于EPN时的系统性限制，而不仅仅是实验上的缺陷。重要的是，在最初的48小时内，对照组的存活率超过了95%——这是EPN感染建立的关键时期（Shapiro-Ilan和Dolinski，2015年）——支持了处理效果解释的稳健性。
据我们所知，这项研究提供了首个实验证据，表明叶片暴露于EPN可以显著降低成年蜜蜂的存活率。在类似于商业应用率（0.25–0.5×10^6 IJs m−2）的处理下，蜜蜂的死亡率在湿润应用条件下达到了60–70%。相比之下，在干燥应用条件下没有观察到显著效果，这突显了表面湿度对EPN感染成功的重要性。这一模式与EPN的活力和感染性随湿度增加而增加的证据一致（Kaya等人，1982年；Nguyen和Smart Jr，1991年）。例如，在RH>70%时，S. carpocapsae的IJ存活率保持在60%以上，并且在RH约为40%的情况下16小时后仍可检测到（Ramakrishnan等人，2022年）。在我们的研究中，一旦叶子完全干燥，IJ的存活时间没有超过10分钟，但这个短暂的时间窗口足以感染暴露的成年蜜蜂，而湿润应用条件可能延长了IJ的活力。在B. terrestris中也报告了类似的敏感性，其中暴露于受EPN污染的土壤导致大约80%的死亡率（Dutka等人，2015年）。
除了感染之外，S. carpocapsae的IJ还能成功感染并在成年A. mellifera工蜂体内增殖，尽管其速率显著低于G. mellonella。蜡蛾幼虫的感染率始终很高（87–100%），而在蜜蜂中只有在高剂量、湿润应用条件下才出现类似值（94%）。这些差异可能反映了宿主特征的差异。Galleria mellonella幼虫由于其薄角质层、减弱的免疫防御和可进入的入口点，成为IJ的高度易感宿主，导致IJ的高回收率（Poinar，1993年；Kaya和Gaugler，1993年）。相比之下，觅食的蜜蜂需要IJ附着在跗节上（图4）并找到气门，同时避免通过梳理行为被清除。一旦进入宿主体内，IJ的增殖在两种物种之间有显著差异，在高剂量、湿润条件下，平均每只蜡蛾幼虫回收1272个IJ，而每只蜜蜂只有47个IJ。这种差异可能反映了宿主大小、营养可用性、免疫防御和初始IJ穿透力的差异（Baur等人，1995年；Shapiro-Ilan和Lewis，2024年）。蜜蜂中的增殖率明显低于通过土壤暴露的大黄蜂（Dutka等人，2015年），这可能是由于暴露条件、线虫种类和应用后干燥的差异。这些发现强调了宿主体特征、线虫生物学和暴露条件共同塑造了感染和增殖结果（Blanco-Pérez等人，2017年；Blanco-Pérez等人，2019年；Fowler等人，2020年）。需要使用标准化的EPN物种和统一的暴露途径进行进一步的比较研究来阐明这些效应。此外，每只宿主产生的IJ数量相对较低，特别是在G. mellonella中（例如，Metwally等人，2012年；Campos-Herrera等人，2015年），这可能与实验设计有关，其中IJ的存活率降低——尤其是在干燥条件下——限制了感染成功和随后的线虫繁殖。
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图4. 工蜂（Apis mellifera）暴露于EPN后的昆虫病原线虫（EPN）检测。光学显微镜（10倍放大）显示，在通过叶片应用EPN后，一个感染性幼虫（IJ）Steinernema carpocapsae附着在工蜂的跗节上。黑色箭头指示了IJ。
EPN通常被归类为低风险产品，因为它们的天然来源、与土壤相关的生态学特性以及被认为的宿主特异性（Kaya和Gaugler，1993年；Blanco-Pérez等人，2024年；Campos-Herrera等人，2025年），因此通常免于进行传粉者安全性测试。我们的结果挑战了这一假设，证明了商业上使用的S. carpocapsae制剂在现实的叶片暴露条件下可以导致大量的蜜蜂死亡。虽然合成农药的监管框架已经建立（USEPA，2012年；EFSA，2023年），但EPN和其他生物控制剂的标准化传粉者风险评估仍然有限。尽管它们在综合害虫管理中继续具有价值，特别是针对土壤栖息的害虫（Kaya和Gaugler，1993年；Blanco-Pérez等人，2024年），但我们的发现表明，叶片应用涉及生态权衡，需要仔细考虑。在干燥应用条件下，感染率和死亡率降低可能反映了叶子干燥后IJ的快速死亡，而不是固有的较低敏感性。在野外环境中，树冠结构、遮荫的叶子以及夜间或清晨的高相对湿度可以延长IJ的存活时间（Ramakrishnan等人，2022年），可能增加非目标生物的暴露风险。
5. 结论
我们的结果强调了进一步研究EPN和其他生物害虫控制剂对非目标生物潜在不良影响的必要性（Erler等人，2022年）。尽管在自然环境中的感染水平可能要低得多，但这些发现表明，不应在没有专门的非目标评估的情况下将EPN视为固有的低风险（Hokkanen等人，2003年；Ramakuwela等人，2025年）。这对于土壤栖息的蜜蜂物种尤为重要——它们代表了蜜蜂多样性的大部分（Engel等人，2021年）——因为成年蜜蜂和幼虫可能在处理过的土壤中或在采集开花作物时遇到IJ。然而，虽然实验室和半野外研究表明蜜蜂可以在定义的暴露情景下被感染（Shamseldean等人，2004年；Dutka等人，2015年），但关于自然感染率和暴露频率的野外数据仍然很少（Erler等人，2022年；Katlav等人，2025年），限制了直接推断到现实世界风险的可能性。
尽管EPN越来越被认为是化学农药的有希望的、环保的替代品，但其更广泛的采用仍受到与应用、风险评估和监管相关的关键知识缺口的限制（Campos-Herrera等人，2025年）。我们的实验室结果强调，尽管EPN具有生物起源，但不应假设它们本质上是安全的，必须考虑潜在的非目标效应，并在必要时进行仔细评估。解决这些挑战需要学术界、工业界和监管机构之间的更强合作，以生成可靠的数据，改进测试框架，并确保基于EPN的产品既有效又环保（Londoño和Frettinger，2024年）。为了支持它们的安全使用，我们提倡为生物控制剂开发标准化的监管研究协议，包括针对传粉者的测试和现实的暴露情景进行风险评估，这与微生物农药的建议一致（Borges等人，2021年）。
在使用叶片应用的情况下，应考虑将应用限制在夜间（即黄昏后）——此时传粉者活动通常减少——作为一种预防性风险缓解措施，以限制湿润条件下的非目标暴露。这种方法与现有的植物保护产品缓解措施一致（USEPA，2012年；欧洲共同体委员会，2003年），并且可能在潮湿、低紫外线条件下同时提高EPN的效果，同时降低传粉者的风险。这些措施对于平衡有效的害虫管理和传粉者保护以及保持生物控制的生态效益至关重要（Campos-Herrera等人，2025年）。
CRedI作者贡献声明
Lars Straub：写作——审阅与编辑，写作——原始草稿，可视化，验证，监督，资源，方法论，调查，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。
Angélique Rüfenacht：写作——审阅与编辑，调查，数据管理。
Daniela Grossar：写作——审阅与编辑，验证，监督，方法论，调查，概念化。
Lukas Jeker：写作——审阅与编辑，验证，监督，资源，项目管理，方法论，调查，概念化。
