黄曲霉毒素B1的分层三模式免疫传感技术：从视觉筛查到精准确认

李永军|刘晓兰|黄浩文

教育部理论有机化学与功能分子重点实验室，湖南省高校分子设计与绿色化学重点实验室，湖南科技大学，湘潭411201，中国

摘要

本研究建立了一种基于普鲁士蓝纳米粒子@碳点（PBNPs@CDs）多功能纳米复合体的分层三信号免疫测定方法，旨在解决多模式传感中的材料复杂性和系统集成问题。PBNPs@CDs具有类似过氧化酶的活性、高效的光热转换能力和强的荧光发射能力。这些固有特性使得在单一平台上实现信号生成和分层利用成为可能。选择黄曲霉毒素B1（AFB1）作为概念验证目标。将AFB1特异性适配体共价连接到PBNPs@CDs上形成检测探针。该探针通过AFB1和固定化的抗体锚定在96孔板上，产生比例色的、光热的和荧光的信号。这些信号被组织成一个连贯的工作流程，从现场筛查到实验室确认。具体来说，色度读数用于快速、无需仪器的定性筛查；光热读数用于现场半定量风险评估，并具有很强的抗光干扰能力；荧光读数用于实验室级别的超灵敏度定量。检测限分别为0.190 fg/mL（色度）、0.893 fg/mL（光热）和0.023 fg/mL（荧光）。该系统在复杂的食品基质中表现出高准确性、选择性和与商业ELISA方法的高度一致性。这项工作建立了一种基于功能匹配和分层协同作用的可推广传感范式，为构建集成检测系统提供了有效策略。

引言

黄曲霉毒素B1（AFB1）被国际癌症研究机构（IARC）列为I类致癌物，由于其对主食作物的污染，对食品安全和公共卫生构成了重大威胁[1]，[2]。为了应对对AFB1残留物的严格监管要求，开发快速、准确和多功能的检测技术至关重要[3]，[4]。传统方法，如色谱法和酶联免疫吸附测定（ELISA），严重依赖复杂的仪器和程序，不适合快速现场筛查[5]，[6]，[7]。

纳米材料的进步推动了AFB1传感技术的显著进展[8]，[9]。然而，主流传感器主要依赖于单信号输出，在复杂的食品基质中容易受到干扰，导致可靠性降低[10]，[11]。近年来，结合荧光、色度、电化学、表面增强拉曼光谱或光热信号的多模式传感策略应运而生，以克服这些限制。代表性研究探索了诸如Au@CeO₂纳米酶[12]、Fe₃O₄@AuNPs/ZIF-8纳米酶[13]、MIL@PDA-UiOL@AIEgens[14]、AuPt纳米花[15]、MIL-88@Pd/Pt纳米酶[16]和Ti₃C₂纳米酶[17]等功能材料，以及基于CRISPR/Cas12a的平台[18]。尽管这些方法具有潜力，但现有系统仍存在一些缺点。大多数平台仅提供并行信号输出，缺乏内部交叉验证，缺乏分层检测和逐步确认的科学范式。一些方法依赖于易受基质干扰的复杂酶促反应。许多方法还涉及基于DNA的识别元件，这些元件容易受到核酸酶降解的影响，并需要严格的温度控制。灵敏度通常保持在ng/mL水平（少数达到pg/mL），且纳米材料的制备通常涉及多步骤的“功能堆叠”，具有较差的可重复性、复杂性和高成本。因此，构建一种集分层检测、逐步确认、抗干扰能力和超痕量灵敏度于一体的新型传感系统具有科学意义和实际价值。这样的系统将能够实现超灵敏、高精度、现场和快速的危险物质（如AFB1）检测。

为了解决这些挑战，我们提出了一种基于集成多功能普鲁士蓝纳米粒子@碳点（PBNPs@CDs）的分层三模式免疫测定范式。与传统功能堆叠策略不同，PBNPs@CDs通过一步微波辅助合成在单一纳米结构中结合了类似过氧化酶的活性、光热转换和强荧光发射能力。使用AFB1作为模型分析物，我们构建了一个具有正交信号和分层功能的智能检测系统：色度信号实现现场定性筛查；光热信号由于其抗光干扰能力而便于现场半定量风险评估；荧光信号提供实验室级别的定量确认和验证。通过夹心免疫测定，目标分析物的浓度转化为三种信号的分层响应。荧光模式的检测限低至0.023 fg/mL，比大多数现有多模式方法低2-3个数量级。该平台通过多路径交叉验证显著提高了检测可靠性，并建立了从现场快速测试到权威实验室报告的完整工作流程。“功能匹配和场景驱动”的设计原则为开发下一代智能传感系统提供了新概念。

章节片段

材料与试剂

六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、三水合铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O）、一水合柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）、尿素和30%过氧化氢（H₂O₂）、3,3′,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）、AFB1特异性抗体和牛血清白蛋白（BSA）由上海源业生物技术有限公司（中国上海）提供。磷酸盐缓冲盐水（PBS；10 mM，pH = 7.4，代码编号P1020）购自美国Everbright公司（中国苏州）。96孔板由...

基于PBNPs@CDs的AFB1检测集成三信号免疫测定的工作原理如图1所示。简而言之，构建了一种内在多功能的PBNPs@CDs-Apt_AFB1探针，它将色度、光热和荧光信号转导集成到一个纳米复合系统中。AFB1特异性适配体通过酰胺键共价连接到PBNPs@CDs表面。PBNPs@CDs-Apt_AFB1探针通过夹心型...

结论

本研究提出了一种基于PBNPs@CDs的新型、场景适应的三信号生物传感策略，PBNPs@CDs是一种集成的多功能纳米探针。该平台能够从单一纳米复合材料生成三种正交信号（色度、光热和荧光），这些信号被合理地组织成一个从现场筛查到实验室确认的分层分析工作流程。具体来说，色度信号提供快速定性筛查；光热信号...

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

我们衷心感谢中国湖南省自然科学基金（项目编号2025JJ70086）、湖南省教育厅科学研究基金（项目编号22A0345）和国家大学生创新创业训练计划（编号202510534040）的财政支持。这些资金来源为这项研究提供了关键支持。