中枢神经系统特定类型的神经元被包裹在细胞外基质蛋白复合物中，称为神经元周围网络（Perineuronal Nets, PNNs）。虽然已知PNNs通过调节突触可塑性来调控神经元活性，但其在精神疾病中的病理生理作用尚未充分阐明。本研究显示，在自闭症谱系障碍（Autism-Spectrum-Disorder, ASD）相关的小鼠模型中，包括注射丙戊酸（Valproic Acid, VPA）的小鼠和染色体结构域解旋酶DNA结合蛋白8（Chromodomain Helicase DNA-binding Protein 8, CHD8）基因单倍体不足（haploinsufficient）小鼠，小脑核神经元的PNNs表达减少。与假手术小鼠相比，向深部小脑核注射软骨素酶ABC（Chondroitinase ABC, ChABC）以药理学方式破坏PNNs，会导致社交互动受损。在大型谷氨酸能（glutamatergic）神经元中，通过细胞内钙动力学和cAMP反应元件结合蛋白1（cAMP Responsive Element-binding Protein 1, CREB1）的磷酸化（phosphorylation）揭示，在社交行为期间神经元活性增加。调节神经元活动的转录因子芳香烃受体核转运蛋白2（Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator 2, ARNT2），在没有任何神经元活性依赖性基因表达刺激的基础条件下，在注射ChABC的小鼠和ASD相关小鼠中增加。此外，通过评估远端区域包括红核（red nucleus）和腹内侧丘脑核（ventromedial thalamic nuclei）中c-Fos的增加来评估神经元活性，发现向深部小脑核注射ChABC在社交互动测试后对c-Fos的诱导产生了负面影响。与注射乱序（scrambled）shRNA的小鼠相比，向深部小脑核注射携带shRNA-ARNT2的腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）以减少ARNT2，与ChABC联合注射，挽救了社交互动障碍，并恢复了远端区域c-Fos表达的诱导。因此，本研究结果可能暗示PNNs在调节小脑神经环路中的神经元活性方面发挥功能作用，从而协调社交行为。
一、 研究背景、问题与研究目的
神经元周围网络（Perineuronal Nets, PNNs）是包裹在中枢神经系统特定神经元（最主要是抑制性中间神经元）胞体和近端树突的细胞外基质结构。它们由透明质酸（hyaluronan）骨架、硫酸软骨素蛋白聚糖（Chondroitin Sulfate Proteoglycans, CSPGs）、连接蛋白和相关糖蛋白组成。PNNs通过与受体和离子通道的相互作用，调节神经元兴奋性和突触信号，从而有助于稳定突触连接和经验依赖性可塑性。越来越多的证据表明，PNN异常与一系列精神疾病和神经发育障碍有关，包括精神分裂症、情绪障碍、成瘾和自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）。然而，PNNs在ASD病理生理学中的具体贡献，特别是所涉及的具体脑区和神经元群体，仍然不甚明了。
ASD是一种以社交沟通和互动障碍以及受限的重复性行为为特征的异质性神经发育障碍。其中，小脑不仅参与运动控制，还在高级认知和社交功能中扮演关键角色，其结构与功能异常在ASD个体中常见。为了探究PNN改变是否与ASD相关的神经元功能障碍有关，本研究选择两种不同的小鼠模型进行深入探究：产前暴露于丙戊酸（Valproic Acid, VPA）的环境模型和染色体结构域解旋酶DNA结合蛋白8（Chromodomain Helicase DNA-binding Protein 8, CHD8）单倍体不足（Chd8+/-）的遗传模型。这两者分别代表了ASD的环境和遗传风险因素，并能复现社交行为缺陷。本研究旨在阐明小脑环路中PNN破坏是否是ASD相关病理的共同特征，并解释这种改变如何影响环路功能和社交行为。
二、 主要技术方法概述
本研究在《Translational Psychiatry》上发表。研究人员使用了两种ASD小鼠模型：产前注射VPA的ICR小鼠和Chd8+/-小鼠（C57BL/6J背景）。通过立体定位注射技术，向6周龄雄性ICR小鼠的深部小脑核注射软骨素酶ABC（ChABC）以破坏PNNs，并伴随注射腺相关病毒（AAV）载体表达荧光报告蛋白（如tdTomato、GCaMP8s）或用于RNA干扰（shRNA-ARNT2）。对小鼠进行了一系列行为学测试，包括三室社交测试、恐惧压力后的社交互动测试、明暗箱测试、高架十字迷宫、旋转杆测试、Y迷宫和旷场测试，以评估社交行为、焦虑、运动协调、空间记忆和自发活动。在行为学测试后，通过免疫组织化学方法检测了神经元标记物（NeuN）、PNN标记物（WFA）、神经元活性标记物（c-Fos、pCREB1）、转录因子（ARNT2、NPAS4）以及谷氨酸能（vGluT2）和GABA能（GABA、GAD67）神经元标记物。此外，利用光纤光度测量法在体监测了小鼠小脑核神经元在社交互动期间的钙信号（GCaMP8s）动态变化。数据处理和统计分析使用了G*power软件估算样本量，并通过ImageJ、GraphPad Prism等软件进行。
三、 研究结果
1. PNNs在小脑核神经元中的表达在ASD相关小鼠模型中减少
研究人员评估了VPA注射小鼠和Chd8+/-小鼠在6周龄时各脑区的PNNs表达。与对照组相比，两种模型小鼠的小脑核（包括内侧核、间位核和外侧核）神经元中，被WFA标记的PNNs比例显著减少。在其他脑区（如前额叶皮层、海马、杏仁核等），PNNs的表达没有明显改变。
2. 破坏小脑核的PNNs导致社交行为缺陷
向6周龄雄性ICR小鼠的右侧小脑核注射ChABC，成功破坏了被AAV-tdTomato标记的神经元上的PNNs。行为学测试显示，与假手术组相比，ChABC注射小鼠在三室测试的社交性（倾向与陌生小鼠而非无生命物体互动）和社交新颖性偏好（倾向与陌生小鼠而非熟悉小鼠互动）指数上均显著降低。此外，在恐惧压力后的社交互动测试中，ChABC注射的观察者对受过电击的演示者（cagemate）的互动时间也显著减少。其他行为学测试表明，ChABC注射还增加了焦虑样行为（在旷场中更少探索中心区，在明暗箱中更少停留在亮区），但未影响运动协调、空间工作记忆和整体活动能力。
3. PNNs主要影响谷氨酸能神经元，且不影响突触数量
免疫组化分析显示，在小脑核中，PNNs主要包裹在vGluT2阳性的谷氨酸能兴奋性神经元上，而较少出现在GABA阳性的抑制性神经元上。ChABC注射选择性地减少了谷氨酸能神经元上的PNNs，但并未改变小脑核中兴奋性或抑制性神经元的数量。同时，在PNN破坏后，小脑核投射的远端区域（如红核、腹内侧丘脑核）的兴奋性和抑制性突触前、后标记物的数量也未发生改变，表明PNN破坏不直接影响这些区域的突触结构。
4. 转录因子ARNT2在PNN破坏后基础水平升高，而神经元活性激活受损
尽管常用的神经元活性即刻早期基因c-Fos在小脑核神经元中未显示显著变化，但研究人员发现转录因子ARNT2的核内免疫反应性在ChABC注射小鼠的小脑核神经元中显著增加，且这种增加不依赖于行为学测试，是基础水平的升高。免疫组化证实ARNT2的增加主要发生在谷氨酸能神经元中。在体钙成像显示，在假手术组小鼠中，社交互动能诱发小脑核神经元的钙信号瞬时增加，而这种增加在ChABC注射小鼠中被削弱。同时，社交互动后谷氨酸能神经元中CREB1在Ser133位点的磷酸化（pCREB1）水平在假手术组中升高，而在ChABC注射组中未观察到升高。这些结果表明，PNN破坏损害了小脑核兴奋性神经元在社交互动期间的正常激活。
5. PNNs破坏影响了小脑神经环路远端区域的神经元活性
通过AAV-tdTomato标记小脑核的投射纤维，研究人员发现其支配的远端区域（如红核/腹侧被盖区、腹内侧丘脑核）的神经元活性（以c-Fos表达衡量）在社交行为后显著降低。此外，其他多个与小脑核不直接相连但可能受影响的广泛脑区（如上丘、视觉皮层、腹侧海马、前额叶皮层等）的神经元活性也受到抑制。而PNNs在这些远端区域本身的表达并未因小脑核注射ChABC而改变。
6. ASD相关小鼠模型表现出类似的功能失调
在VPA注射小鼠和Chd8+/-小鼠中，研究人员观察到了与ChABC实验一致的现象：小脑核神经元的ARNT2基础水平升高，而社交行为后其下游环路区域（红核、腹内侧丘脑核）的c-Fos诱导显著减弱。
7. 敲低ARNT2可挽救PNN破坏引起的社交行为缺陷和神经元活性抑制
为了验证ARNT2增加是否介导了PNN破坏的功能后果，研究人员向小脑核共注射ChABC和携带ARNT2 shRNA的AAV。结果显示，敲低ARNT2（但未恢复PNNs）可以部分挽救ChABC注射小鼠在三室测试中表现出的社交性及社交新颖性偏好缺陷。同时，ARNT2敲低也恢复了ChABC注射小鼠小脑核神经元在社交行为后pCREB1水平的升高，并逆转了下游环路区域（红核/腹侧被盖区、腹内侧丘脑核等）c-Fos表达的抑制。
四、 讨论与结论
本研究结果表明，在两种不同的ASD小鼠模型中，小脑核神经元的PNNs表达减少。通过药理学方法破坏小脑核的PNNs，足以在小鼠中诱导出与ASD模型类似的社交行为缺陷和焦虑样行为增加，同时伴随着小脑核谷氨酸能神经元在社交互动期间钙信号和CREB磷酸化激活的受损，以及下游广泛脑区神经元活性的抑制。值得注意的是，PNN破坏导致了一种独特的转录变化模式：神经元活性即刻早期基因c-Fos的诱导受损，而转录因子ARNT2的基础水平却升高。这种ARNT2的增加似乎发挥了功能性作用，因为敲低ARNT2可以在不修复PNN结构的情况下，挽救PNN破坏引起的社交行为缺陷和下游环路的神经元活性抑制。因此，研究人员得出结论：小脑核神经元中的PNNs在通过调节小脑神经环路的神经元活性以协调社交行为方面发挥功能作用。PNNs的破坏可能导致ARNT2信号失调，进而损害社交互动期间小脑核及其下游神经环路的正常功能激活。 这为理解ASD等神经发育障碍中细胞外基质异常如何贡献于环路功能失调和核心行为表型提供了新的机制见解。
