摘要：骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是一种高度侵袭性骨肿瘤，具有强烈的转移倾向。为建立一个可用于肿瘤侵袭研究和药物测试的、具有生理相关性的体外（in vitro）平台，研究人员利用基于水凝胶的多细胞球体微珠构建了一个模拟肿瘤微环境的三维（3D）OS模型。研究人员在一种通过整合素结合促进细胞粘附的水凝胶基质（VitroGel® RGD）中生成肿瘤球体（直径约125 μm），并与WS1成纤维细胞共培养。大小约为2-3 mm的水凝胶微珠能良好地支持MG63和高转移性143B细胞的生长。值得注意的是，143B球体表现出显著的基质侵袭，再现了其侵袭性表型。为评估治疗潜力，研究人员将抗肿瘤化合物甘草查尔酮A（Licochalcone A, Lic-A）以不同浓度作用于微珠。Lic-A以剂量依赖性方式降低了细胞代谢活性和膜完整性，而对基质成纤维细胞的细胞毒性作用最小。基因和蛋白质表达分析显示，Lic-A显著下调了细胞增殖标志物Ki67和基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9, MMP-9）的表达，同时上调了骨形态发生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein 2, BMP2）和血管内皮生长因子-C（Vascular Endothelial Growth Factor-C, VEGF-C）的表达。有趣的是，波形蛋白（Vimentin, VIM）的mRNA表达上调，但其丝状结构被破坏，表明发生了与应激或凋亡相关的细胞骨架重塑。活细胞成像和环境扫描电子显微镜（Environmental Scanning Electron Microscopy, ESEM）证实了143B细胞广泛的侵袭，以及细胞骨架变化和细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）降解。总之，本研究建立了一个可扩展的3D OS模型，该模型捕捉了肿瘤-基质界面的关键特征，并支持动态侵袭过程的研究。该模型展示了Lic-A的多方面抗癌作用，并为在仿生环境中研究OS生物学和测试抗转移疗法提供了一个有价值的平台。
论文解读：基于3D功能化水凝胶模型的骨肉瘤侵袭研究与药物评价
一、 研究背景与目的
骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，以局部侵袭性生长和高转移倾向（尤其是肺转移）为特征。尽管手术和化疗技术有所进步，但转移性或复发性OS患者的预后仍然较差，这凸显了对更有效治疗策略的迫切需求。传统的二维（2D）细胞培养系统虽然广泛应用于癌症研究，但无法模拟体内（in vivo）肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的复杂性。三维（3D）培养模型通过模拟肿瘤架构的关键方面，如3D细胞间及细胞-细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）相互作用、营养和氧气梯度以及缺氧条件，提供了一个更具生理相关性的平台。这些模型对于探索肿瘤生物学、耐药性和治疗反应已被证明是极有价值的。ECM是肿瘤微环境的关键组成部分，提供结构支持和调节细胞行为的生化信号，影响着肿瘤进展、转移潜力和治疗反应，对于治疗开发至关重要。在OS领域，3D培养系统因能模拟包含骨基质成分和各种基质细胞相互作用的复杂微环境而显得尤为重要，它能更好地模拟原生骨结构和机械刚度，从而影响增殖、侵袭和化疗药物耐药性等关键方面。为了满足对生理相关OS模型的需求，本研究旨在开发一个基于水凝胶封装的3D模型，通过将肿瘤球体与成纤维细胞共培养来模拟肿瘤微环境并评估侵袭性。同时，以天然查尔酮类化合物甘草查尔酮A（Lic-A）作为测试化合物，评估该模型的实用性，探索其在复杂三维肿瘤微环境中的活性。
二、 关键技术方法概述
本研究采用以下关键技术方法构建并分析了3D骨肉瘤侵袭模型：
- 1.
3D细胞模型构建：使用Corning® Elplasia™ 24孔微孔板生成大小形态均匀的MG63和143B OS细胞系肿瘤球体（直径约125 μm）。将收集的球体与WS1人真皮成纤维细胞或人骨髓间充质基质细胞（Bone Marrow–derived Mesenchymal Stromal Cells, BM-MSCs）混合，并包封于功能化的VitroGel® RGD水凝胶中形成直径约2-3 mm的微珠。该水凝胶含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）序列，可促进细胞通过整合素受体粘附。
- 2.
药物处理与活性评估：将构建的3D模型用不同浓度（20, 40, 80 μM）的Lic-A处理48小时。通过刃天青（resazurin）检测法评估细胞代谢活性，通过碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）/Hoechst 33342染色结合共聚焦显微镜观察评估细胞活力，并通过乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放实验评估细胞毒性。
- 3.
侵袭与模型表征：使用IncuCyte®活细胞成像系统对荧光标记的143B细胞进行长时间动态成像，定量分析球体侵袭面积。通过动态力学分析（Dynamic Mechanical Analysis, DMA）测量水凝胶的杨氏模量以评估其机械性能随时间的变化。利用环境扫描电子显微镜（ESEM）观察细胞形态、细胞-基质相互作用及基质结构。通过鬼笔环肽（phalloidin）染色标记F-肌动蛋白（F-actin），利用共聚焦显微镜观察细胞骨架结构。
- 4.
分子生物学分析：通过实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）检测Ki67、MMP-2、MMP-9、VIM、BMP2、I型胶原α1链（Collagen Type I Alpha 1 Chain, COL1A1）、VEGFA和VEGFC等基因的mRNA表达水平。通过免疫荧光染色在蛋白水平验证MMP-2、MMP-9、BMP2、VIM和COL1A1的表达与定位。
三、 研究结果
3.1. 水凝胶微珠的制备与表征
成功制备了包封OS球体和成纤维细胞的水凝胶微珠。两种OS细胞系在微珠中均表现出良好的生长。其中，高转移性的143B球体表现出明显的侵袭行为，细胞逐渐占据周围的基质；而MG63球体则保持相对紧凑的形态，侵袭性较低。这验证了该模型区分不同侵袭潜力细胞系的能力。
3.2. Lic-A对水凝胶微珠代谢和活力的影响
Lic-A处理显著降低了MG63和143B微珠的代谢活性和细胞膜完整性，并诱导细胞死亡，且对共培养的WS1成纤维细胞或BM-MSCs毒性较小，显示出一定的选择性细胞毒性。在包含BM-MSCs的改进模型中，Lic-A对143B肿瘤细胞的毒性也高于对健康BM-MSCs的毒性。
3.3. 143B水凝胶微珠模型的表征
活细胞成像显示，143B细胞在封装后36小时内即发生显著扩散，占据面积增加了三倍。动态力学分析表明，随着培养时间延长，水凝胶刚度下降，且细胞的存在加速了这一过程，提示细胞可能参与了基质重塑。ESEM图像显示143B细胞伸出丝状伪足和板状伪足，积极与基质相互作用并可能降解基质。F-肌动蛋白染色显示，Lic-A处理破坏了细胞骨架的完整性，并诱导了细胞核固缩等凋亡特征。
3.4. Lic-A以浓度依赖性方式降低细胞代谢和活力
代谢活性实验和LDH释放实验均证实，Lic-A对143B细胞的抑制和杀伤作用呈剂量依赖性，40 μM Lic-A即可使代谢活性降低约50%。
3.5. Lic-A对肿瘤发生相关标志物表达的影响
基因表达分析显示，20 μM Lic-A处理48小时后，显著下调了增殖标志物Ki67和侵袭相关蛋白酶MMP-9的表达，而上调了VIM、BMP2和VEGFC的表达，对MMP-2、COL1A1和VEGFA的表达影响不显著。免疫荧光染色结果在蛋白水平验证了MMP-9下调和BMP2上调的趋势。值得注意的是，尽管VIM的mRNA表达上调，但其蛋白的丝状结构在Lic-A处理后变得混乱和碎裂，表明存在转录后修饰或凋亡相关的细胞骨架分解。
四、 讨论与结论
讨论：本研究建立的3D模型比2D单层培养更能生理性地模拟OS的侵袭行为。较小的球体尺寸和侵袭导致的球体结构瓦解可能增强了Lic-A的渗透和疗效。Lic-A通过下调Ki67和MMP-9、破坏细胞骨架、诱导凋亡等多重机制发挥抗肿瘤作用。VIM表达上调但结构破坏的现象，可能与应激反应或凋亡过程中的细胞骨架重塑有关。虽然本研究未深入探讨Lic-A作用的具体信号通路，但其结果与已知Lic-A调控PI3K/Akt、MAPK、NF-κB等通路的报道相符。该模型未来可通过引入免疫细胞等进一步复杂化，以更全面地研究肿瘤微环境与治疗反应。
结论：本研究建立了一个基于水凝胶微珠的体外OS模型，该模型通过整合肿瘤和基质成分更好地模拟了肿瘤微环境。选择VitroGel® RGD作为包封基质，实现了有效的细胞-基质相互作用，特别是支持了成纤维细胞的活力和肿瘤细胞的侵袭。该模型有效区分了侵袭潜力不同的OS细胞系（143B vs. MG63）。用Lic-A处理在3D系统中显示出显著的抗肿瘤活性，包括活力、代谢活性和细胞骨架完整性的降低。分子分析进一步证实Lic-A下调了MMP-9和Ki67等关键促转移标志物，并改变了上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）相关蛋白的表达。总之，该OS模型是研究OS生物学（侵袭、肿瘤-基质相互作用和药物反应性）的相关平台，并可作为临床前筛选抗转移化合物的有前景的工具，以替代传统的2D培养。
