约书亚·哈钦斯（Joshua Hutchings）| 丹尼尔·吉（Daniel Ji）| 肖恩·郑（Shawn Zheng）| 伊丽莎白·A·蒙塔巴纳（Elizabeth A. Montabana）| 乌茨·H·埃尔梅尔（Utz H. Ermel）| 阿里安娜·佩克（Ariana Peck）| 乔纳森·施瓦茨（Jonathan Schwartz）| 拉赫尔·沃尔德耶斯（Rahel Woldeyes）| 穆罕默德雷扎·帕兰（Mohammadreza Paraan）| 马拉克·阿里（Mallak Ali）| 诺伯特·S·希尔（Norbert S. Hill）| 汉娜·西姆斯（Hannah Siems）| 丹尼尔·塞尔瓦斯（Daniel Serwas）| 安奇·程（Anchi Cheng）| 达里·基马尼乌斯（Dari Kimanius）| 大卫·A·阿加德（David A. Agard）| 克林顿·S·波特（Clinton S. Potter）| 布里奇特·卡拉格（Bridget Carragher）| 余悦（Yue Yu）
BioHub 红木城，加利福尼亚州，美国
伏特相位板（VPP）可以增强冷冻电子显微镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中的低频相位对比度，但其对断层图对齐的影响尚未得到系统评估。通过使用亚2 Å单粒子分析（SPA）和分析对比度传递函数（CTF）建模，我们发现尽管高频信息有所损失且信号有所衰减，但VPP仍能增强对倾斜序列对齐至关重要的低频信号。结果显示，使用VPP的断层图对比度更高，并且在去噪后仍然保持较高对比度，无论是对于厚样本还是密集样本。定量比较使用VPP和不使用VPP获得的断层图，发现倾斜轴方向测量结果有所改善，且更多断层图适合进行局部倾斜序列对齐。尽管使用VPP的亚断层图平均（STA）分辨率较低，但这些结果表明，VPP在cryo-ET中的主要优势在于对比度增强和对齐稳定性的提高，这对于研究细胞超结构和蛋白质在密集环境中的组织结构非常重要，因为在这些情况下，中等分辨率的STA仍然具有价值。
1. 引言
冷冻电子显微镜（cryo-EM）和带有亚断层图平均（STA）的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）是研究生物分子结构的重要工具。在这些方法中，嵌入玻璃态冰中的生物分子表现为弱相位对象，并通过透射电子显微镜（TEM）进行成像。通过传统的宽束、明场成像，故意引入散焦以将相位对比度转换为可检测的强度对比度。利用这种方法，单粒子分析（SPA）现在已能达到接近原子级的分辨率，已有几例原子级分辨率的报道（Yip等人，2020年；Nakane等人，2020年；Küçükoğlu等人，2024年），而带有STA的cryo-ET也取得了适合原子模型拟合的分辨率，这在很大程度上得益于图像处理软件的进步（Tegunov等人，2021年；Xue等人，2022年）。
活跃的研究继续推动cryo-EM和cryo-ET的发展，其中一个主要方向是改进相位信息检测。一种计算方法是基于衍射术的相位恢复（Küçükoğlu等人，2024年），尽管这种方法在材料科学中取得了广泛成功（Jiang等人，2018年），但在cryo-EM中仍处于早期阶段。另一个长期进行的研究方向是相位板的开发。已经探索了几种相位板设计方法，包括基于薄膜的设计（Danev & Nagayama，2001年；Danev等人，2014年）、静电相位板（Schultheiss等人，2010年）和高功率密度激光相位板。其中，激光相位板（LPP）代表了一种最新进展，原理上已被证明可以产生稳定的π/2相位移动（Schwartz等人，2019年；Remis等人，2024年）。LPP的开发仍然是一个活跃且快速发展的研究领域，正在开发连续（Petrov等人，2024年；Olshin等人，2025年）和脉冲（Du & Fitzpatrick，2023年）配置，并显示出为cryo-EM提供理想相位对比度的强大潜力。
在现有的相位板设计中，薄膜相位板相对容易制造，其中伏特相位板（VPP）是最广泛使用和商业上可获得的例子。VPP利用电子束在薄膜上诱导静电势，从而在散射电子和未散射电子之间产生相位移动。VPP在2014年原理上得到了验证（Danev等人，2014年），随后被应用于cryo-EM单粒子分析，使用接近零散焦（Danev & Baumeister，2016年）和低散焦成像（Danev等人，2017年）。比较使用VPP和不使用VPP的成像结果包括对基准蛋白（Danev等人，2017年；Li等人，2019年）、膜蛋白（Danev等人，2021年）和小复合体（Fan等人，2019年）的应用。总体而言，这些研究表明VPP显著提高了图像对比度，在某些情况下还促进了粒子对齐，特别是对于小粒子（Fan等人，2019年）。然而，在大多数应用中，VPP数据集的最终分辨率并未超过基于散焦的成像。这一限制后来被归因于VPP引入的空间频率依赖性信号损失（Buijsse等人，2020年），以及之前已知的来自相位板材料中电子散射的恒定衰减（Danev等人，2017年）。
随着SPA样品制备和数据处理的持续进步，以及对VPP引起的信号损失的认识，特别是其对高分辨率信号的影响，基于VPP的SPA应用变得不那么常见。尽管如此，VPP在cryo-ET中的作用仍不够明确。与SPA不同，SPA通常以实现最高可能分辨率为主要目标，而cryo-ET有时关注细胞超结构和蛋白质复合体在密集环境中的空间组织，在这些情况下，对比度增强非常有价值，中等分辨率（约7 Å）的亚断层图平均仍然具有信息价值。此外，倾斜序列的准确对齐对于cryo-ET数据解释至关重要，也是断层图可实现分辨率的主要限制因素之一（Dickerson & Lucas，2025年）。在cryo-ET中，较厚样本的剂量限制和额外的信号损失导致每个倾斜图像的信噪比显著降低，使得2D运动校正和3D倾斜序列对齐变得具有挑战性。倾斜序列对齐不仅需要全局对齐倾斜几何结构，还需要局部校正非刚性运动和样品变形。由于VPP增强了低至中等频率的信号，因此它有潜力显著改善倾斜序列对齐。
迄今为止，关于VPP在cryo-ET中性能的系统基准研究很少。2017年，基于VPP的接近焦点的STA对核糖体的研究显示了无需CTF校正即可达到亚纳米级分辨率，而基于散焦的STA在CTF校正后也达到了类似的分辨率（Khoshouei等人，2017年）。2020年的后续研究比较了基于散焦的成像与接近焦点和离焦VPP成像，报告的分辨率范围约为4–7 Å，其中可以观察到二级结构元素（Turoňová，2020年）。在那项比较中，接近焦点的VPP产生的分辨率低于离焦VPP，而离焦VPP又略低于基于散焦的STA。虽然分辨率是STA的一个重要指标，但鉴于VPP引入的频率依赖性信号衰减，仅关注分辨率可能会忽略VPP在cryo-ET中的其他潜在优势，特别是与断层图对齐相关的优势。
在这里，受到VPP提供的低至中等频率信号增强及其对断层图对齐相关性的启发，我们系统地比较了VPP和基于散焦（非VPP）的cryo-ET数据集。我们检查了两种类型的样本（均未研磨）：一种相对较薄且分布稀疏的幻影（Peck, Yu, Schwartz等人，2025年）和一种蛋白质密集堆积的厚细菌微细胞（Breuer等人，2019年）。VPP断层图是在低散焦（0.7–0.9 µm）下获得的，而非VPP断层图是在2 µm散焦下收集的。每个数据集包含约100–300张断层图，从而能够对断层图对齐质量进行统计分析，特别关注厚样本和密集样本。我们还展示了使用VPP和不使用VPP获得的脱铁铁蛋白（apoferritin）的亚2 Å SPA重建，以实证模型VPP引起的信号损失，并报告了来自断层图数据集的STA重建结果，以提供分辨率比较。总体而言，这项工作旨在评估VPP对断层图对齐的影响，并确定VPP成像在cryo-ET中的实际应用场景，特别是对于那些对对齐要求较高的样本。
2. 材料与方法
2.1. 脱铁铁蛋白SPA样品制备
小鼠脱铁铁蛋白重链（FTH1）在大肠杆菌Lemo21(DE3)（NEB）中通过pET24a载体表达。新鲜转化体在LB培养基中过夜培养，然后用于接种1升Super Broth（Teknova）。培养物在37°C下生长至OD600约为0.7，加入0.5 mM IPTG（Sigma-Aldrich）诱导，并在18°C下孵育16小时，之后收获并冷冻。从0.5升培养物中提取沉淀物，重新悬浮在Buffer A（30 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl，2 mM MgSO4）中，并加入溶菌酶和complete抑制剂（Roche），通过超声处理裂解，然后通过离心（13,000 r.p.m.，30分钟，4°C，Ti45转子）澄清。上清液加热至70°C 10分钟，再次离心。加入硫酸铵至33.25 g/100 ml；沉淀物重新悬浮在Buffer B（20 mM HEPES pH 7.5，300 mM NaCl）中，并过夜透析。
样品稀释1:5后加载到5 ml HiTrap Q柱（Cytiva）上，该柱已在Buffer C（20 mM HEPES pH 7.5，75 mM NaCl）中平衡。洗涤后，用线性梯度将FTH1洗脱至Buffer D（20 mM HEPES pH 7.5，1 mM NaCl）。峰部分通过SDS–PAGE分析，并使用100 kDa MWCO Amicon过滤器（MilliporeSigma）浓缩。使用Superdex 200 16/60柱（Cytiva）和SEC缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl）以0.35 ml min−1的流速进行尺寸排阻色谱。峰部分合并，浓缩至约19 mg ml−1（BCA测定；Thermo Fisher Scientific），然后在不加保护剂的情况下快速冷冻。
Quantifoil Cu 200网孔1.2/1.3网格使用PELCO easiGlow进行辉光放电。使用Thermo Fisher Scientific（TFS）Vitrobot在10°C和95%湿度下进行 plunge冷冻。
2.2. 两蛋白幻影的样品制备
两蛋白幻影是由细胞裂解液和纯化蛋白混合而成的，使用的方法与之前为真实cryo-ET幻影数据集描述的方法类似（Peck, Yu, Schwartz等人，2025年）。特别是，细胞裂解液来自San Francisco Biohub的M. Leonetti团队提供的带有C末端GFP敲入的HEK293T细胞系（Cho等人，2022年）。细胞在低渗匀浆缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5，50 mM sucrose，0.2 mM EGTA，0.5 mM MgCl2）中用23G注射器裂解以产生剪切力（Hein等人，2025年）。然后将裂解液与蔗糖缓冲液（2.5 mM sucrose，0.2 mM EGTA，0.5 mM MgCl2）混合。通过1000g离心10分钟去除核部分。随后，携带TMEM192-GFP融合体的溶酶体被捕获到用GFP纳米体功能化的电子显微镜网格上（Wang, Liu等人，2020年；Wang, Yu等人，2020年）。这项技术是与加州大学San Francisco分校的David Agard团队合作开发的，用于细胞器分离。
使用Leica GP2设备在4°C和95%湿度下进行 plunge冷冻。裂解液以10 µl体积上下吸取（20次）并重复十轮，总共将100 µl裂解液施加到网格表面。然后用PBS冲洗网格两次。在添加纯化蛋白之前，去除网格上剩余的多余缓冲液。然后依次加入PP7病毒样颗粒（2.1 mg ml−1），每次4–6 µl。网格背面 blotting 6秒后，用液体乙烷进行 plunge冷冻。
2.3. Mycoplasma mycoides JCVI-Syn3的样品制备
JCVI-Syn3A细胞来自J. Craig Venter研究所的John Glass实验室（Breuer等人，2019年）。细胞从-80°C解冻并轻轻混合，准备转移至培养基中。准备含有1 ml SP4培养基的培养管，向每个管中加入约10 µl解冻材料（或少量冷冻库存）。保留一个未接种的培养基管以监测pH变化，这通常在1–3天内发生。为了扩大规模，将培养物稀释1:100到预热的新鲜培养基中并过夜培养。Quantifoil Cu 200网孔2/1网格使用PELCO easiGlow进行辉光放电。使用Leica GP2设备在4°C和95%湿度下进行 plunge冷冻。将4 µl细胞沉淀物施加到每个网格上，blotting 6秒后，用液体乙烷进行 plunge冷冻。
2.4. 脱铁铁蛋白SPA数据收集
对于VPP和非VPP的两个数据集，使用了Titan Krios G4显微镜（Thermo Fisher Scientific，TFS），其Cs为2.7 mm，并配备了XFEG。图像在300 keV、10 eV狭缝下使用Selectris X能量过滤器和Falcon 4i探测器获取。总剂量为45 e Å−2，像素大小在超分辨率模式下为0.288 Å。对于非VPP数据集，目标散焦中心位于约1 µm。使用TFS EPU和‘Faster’设置获取无像差图像位移（AFIS）数据。对于VPP数据集，目标散焦中心位于约0.6 µm，AFIS获取使用‘Accurate’设置。每个VPP点获取三百次曝光，充电时间约为20分钟，使用Sherpa设置和0.35π的目标相位移动。
2.5. 脱铁铁蛋白SPA数据分析
脱铁铁蛋白SPA数据在cryoSPARC（Punjani等人，2017年）中处理。从EER帧中渲染出四十帧电影帧。使用EMDB-11668生成的模板进行粒子挑选。通过一轮2D分类清理粒子，并对VPP数据集应用30 Å高通滤镜以提高2D分类质量。对于两个数据集，共使用了300,702个粒子，包括从头算模型生成和随后的均匀细化。应用了具有八面体对称性的均匀细化处理。细化包括全局CTF（Contrast Transfer Function）细化和每个粒子的离焦细化。全局CTF细化考虑了球面像差、四叶形像差和各向异性放大效应。没有进行每个显微图或每个粒子的相位移动细化。最终重建结果和FSC（Fourier Space Correlation）曲线在cryoSPARC.2.6中得到了验证。
CTF建模和CTF密度计算将CTF建模为没有振幅对比的相位对比传递函数。像差包括离焦和球面像差（Cs = 2.7毫米），在300千电子伏特（kV）下。CTF在二维倒空间网格上进行评估，并与各向同性包络函数卷积。对于VPP（Voltage Phase Plate），应用了一个截止频率0.004埃^-1，在此频率以下相位移动为0度。截止频率kh通过公式kh = rh/fλ计算（Danev & Nagayama, 2001#），其中rh是有效的VPP相位移动斑块半径，f是有效焦距（3.5毫米），λ是电子波长（1.97皮米）。根据之前报告的相位移动斑块大小大约是束流大小的11倍（Danev等人，2014#），我们估计rh约为275纳米。没有包括截止频率。由于VPP引起的信号衰减是根据在无VPP和有VPP的脱铁蛋白数据集中测量的Rosenthal–Henderson B因子差异（无VPP时为67.6埃^2，有VPP时为100.8埃^2）以及独立测量的束流强度减少约12%来估计的。B因子代表了蛋白质结构、成像和处理的累积效应。由于在两种条件下使用了相同的样品制备和处理流程，B因子的差异主要反映了VPP的影响。最后，每个预定义的空间频率范围（R1–R4）内的CTF密度是通过对应频率区间内的|CTF|值总和并除以该区间内的bin数量来计算的。
2.7. 冷冻电镜（Cryo-ET）数据收集
对于微细胞和双蛋白幻影样本，使用Titan Krios G4显微镜（Thermo Fisher Scientific, TFS）和Cs为2.7毫米的XFEG在300千电子伏特下获取倾斜序列。使用了10电子伏特的能量过滤狭缝和Selectris X探测器以及Falcon 4i探测器。倾斜序列使用TFS Tomography 5在±45°的倾斜范围内以3°的步长收集，并采用剂量对称的收集方案。真空中的总剂量保持在大约120电子埃^-2，图像以1.51埃的像素大小记录（非超分辨率）。对于无VPP的数据集，名义离焦目标集中在2微米左右；每个阶段位置平均获取6-7张平移图像。对于有VPP的数据集，目标离焦为0.7-0.9微米，每个阶段位置获取一个倾斜序列。对于有VPP的微细胞，每个VPP斑点在采集前使用采集成像条件充电约23分钟，并在每个VPP位置获取30个倾斜序列。
2.8. 冷冻电镜预处理和对齐比较
使用AreTomo3 v2.2（Peck, Yu, Paraan等人，2025#）进行了束流诱导运动校正、倾斜序列对齐和断层图重建。每十个EER帧被叠加生成渲染帧，用于测量和校正全局和局部束流诱导运动，局部运动在5×5的斑块上测量。对于VPP断层图，开启了相位移动搜索选项，搜索范围为35–105°。对于双蛋白幻影数据集，首先对CTF校正后的倾斜序列进行对齐，然后进行4×4斑块基础的局部对齐。倾斜轴的方向是从对齐结果中自动确定的。对于双蛋白幻影和微细胞，无论是否有VPP，都使用DenoisET（Peck, Yu, Paraan等人，2025#）进行去噪，使用相同的去噪模型。为了确保VPP和无VPP数据集之间的样品后剂量范围可比，无VPP的断层图使用VPP数据集的最小和最大样品后剂量进行过滤，并除以0.88的阻尼因子（通过无样品时的束流强度下降测量得到）。只有当无VPP断层图的零倾斜样品后剂量落在这一最小和最大剂量范围内时，才保留这些断层图。
2.9. 粒子挑选
所有四种结构的粒子挑选都结合了手动注释、基于深度学习的自动检测和2D微片分类。每种结构的挑选过程如下所述。
对于非VPP双蛋白幻影数据集中的PP7病毒样颗粒（VLPs），在14张去噪断层图中使用ArtiaX（Ermel等人，2022#）和ChimeraX（Meng等人，2023#）手动识别颗粒，并以copick格式导出（Harrington等人，2024#）。总共使用22个手动挑选的颗粒来训练Octopi（见数据可用性），这是一个用于粒子挑选的模块化深度学习框架。然后将训练好的模型应用于所有197张断层图，自动检测出490个VLPs。这些颗粒进一步使用之前描述的微片2D分类方法进行筛选（Peck, Yu, Schwartz等人，2025#）（见数据可用性），其中3D子断层图被投影到2D微片中，并使用RELION（Burt等人，2024#）进行2D分类，最终保留了290个颗粒。对于有VPP的微细胞，每个VPP斑点在采集前使用采集成像条件充电约23分钟，并在每个VPP位置获取30个倾斜序列。
2.8. 冷冻电镜预处理和对齐比较
束流诱导运动校正、倾斜序列对齐和断层图重建是使用AreTomo3 v2.2（Peck, Yu, Paraan等人，2025#）进行的。每十个EER帧被叠加生成渲染帧，用于测量和校正全局和局部束流诱导运动，局部运动在5×5的斑块上测量。对于VPP断层图，开启了相位移动搜索选项，搜索范围为35–105°。对于双蛋白幻影数据集，首先对CTF校正后的倾斜序列进行对齐，然后进行全局对齐，接着进行4×4斑块基础的局部对齐。倾斜轴的方向是从对齐结果中自动确定的。对于双蛋白幻影和微细胞，无论是否有VPP，都使用DenoisET（Peck, Yu, Paraan等人，2025#）进行去噪，使用相同的去噪模型。为了确保VPP和无VPP数据集之间的样品后剂量范围可比，无VPP的断层图使用VPP数据集的最小和最大样品后剂量进行过滤，并除以0.88的阻尼因子（通过无样品时的束流强度下降测量得到）。只有当无VPP断层图的零倾斜样品后剂量落在这一最小和最大剂量范围内时，才保留这些断层图。
2.9. 粒子挑选
所有四种结构的粒子挑选都结合了手动注释、基于深度学习的自动检测和2D微片分类。每种结构的挑选过程如下所述。
对于非VPP双蛋白幻影数据集中的PP7病毒样颗粒（VLPs），在14张去噪断层图中使用ArtiaX（Ermel等人，2022#）和ChimeraX（Meng等人，2023#）手动识别颗粒，并以copick格式导出（Harrington等人，2024#）。总共使用22个手动挑选的颗粒来训练Octopi（见数据可用性），这是一个用于粒子挑选的模块化深度学习框架。然后将训练好的模型应用于所有197张断层图，自动检测出490个VLPs。这些颗粒进一步使用之前描述的微片2D分类方法进行筛选（Peck, Yu, Schwartz等人，2025#）（见数据可用性），其中3D子断层图被投影到2D微片中，并使用RELION（Burt等人，2024#）进行2D分类，最终保留了290个颗粒。对于有VPP的微细胞，从一张去噪断层图中手动挑选了25个颗粒来训练Octopi，然后将训练好的模型应用于115张断层图，自动检测出514个VLPs。经过微片2D分类后，保留了323个颗粒。
对于非VPP双蛋白幻影数据集中的80S核糖体，对所有197张断层图进行了粒子挑选。从四张去噪断层图中手动识别出225个颗粒，并用它们来训练Octopi，然后将训练好的模型应用于整个数据集，自动检测出15,643个颗粒。经过微片2D分类后，保留了11,479个颗粒。对于相应的有VPP数据集，对所有115张断层图进行了粒子挑选。从三张去噪断层图中手动识别出159个颗粒，并用它们来训练Octopi，自动检测出8,996个颗粒。经过微片2D分类后，保留了3,710个颗粒。表1#总结了VLP和80S核糖体结构的粒子挑选情况。
表1. 双蛋白幻影中带有和不带有VPPE（Voltage Phase Plate）的VLP和80S核糖体结构的粒子挑选情况
| 结构 | 无VPP | VPP | 总断层图数 | 手动挑选数 | Octopi挑选数 | 经过2D微片分类后的挑选数 | 保留率（%） |
|---------------|---------------|-----------------|--------------|--------------|-----------------|-----------------|
| 空细胞 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 514 | 59.1 |
| 带有手动挑选的断层图 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 899 | 62.8 |
| 经过2D微片分类后的挑选 | 197 | 115 | 223 | 114 | 371 | 371 | 34.4 |
对于来自微细胞的VPP 70S核糖体，从六张去噪断层图中手动识别出5840个颗粒[CryoET Data Portal (https://cryoetdataportal.czscience.com) DS-10452-RN-18181, 18182, 18187, 18188, 18194 和 18268]。手动挑选的核糖体用于训练Octopi，然后将训练好的模型应用于从全部107张断层图中手动选择的29张断层图。为了提高自动粒子检测的准确性，使用MemBrain-seg（Lamm等人，2024#）进行了膜分割，并用作掩模以排除膜上或微细胞外的假阳性颗粒，从而得到1,820个颗粒作为STA（Structure Alignment）的输入。对于没有VPP的微细胞中获得的70S核糖体，从三张去噪断层图中手动挑选出2,041个颗粒，并用它们来训练Octopi，然后将训练好的模型应用于39张手动选择的断层图。随后使用膜分割掩模进行清洗，得到3,823个颗粒用于STA。
2.10. 子断层图平均
对于每个物种，使用RELION-5（Burt等人，2024#）和py2rely（一个集成RELION CCP-EM Pipeliner作业执行工具的软件包）对非VPP和VPP数据集进行了子断层图平均（STA）。使用py2rely的实用程序将Octopi和2D微片分类的坐标导入RELION-5。以下是用于初始基于参考的细化的重采样低通滤波（LPF）参考和像素大小：VLPs – 40埃LPF，EMDB-41917，bin6，9.06埃/像素；80S核糖体 – 40埃LPF，EMDB-3883，bin6，9.06埃/像素；70S核糖体 – 50埃LPF，EMDB-10677，bin4，6.04埃/像素。为了公平比较非VPP和VPP的数据，根据较小数据集的大小为每个物种平衡了粒子计数，通过选择较大数据集的随机子集进行初始对齐。尽管如此，在每种情况下也处理了较大数据集，以展示细化流程的能力（表2#，补充图10）。对于70S核糖体，还在bin4（6.04埃/像素）进行了额外的一轮3D分类，不使用tau调整因子。在这两种情况下，都得到了一类高质量的颗粒，这为选择相同数量的输入颗粒进行高分辨率细化提供了基础。
表2. 双蛋白幻影中带有和不带有VPPE的VLP和80S核糖体结构的冷冻电镜STA的数据收集和处理情况。报告了完整数据集的粒子计数和分辨率，以及VPP与无VPP的平衡数据集。VLP对称性：I. 80S和70S核糖体对称性：C1。所有数据集：电压300千电子伏特；倾斜序列（最小/最大，增量）±45°，3°；总电子曝光120电子埃^-2；像素大小1.51埃/像素。
| 结构 | 无VPP | VPP | VPP（完整） | 无VPP | VPP（完整） |
|---------------|---------------|-----------------|--------------|--------------|-----------------|
| 空细胞 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 514 |
| 带有手动挑选的断层图 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 899 |
| 经过2D微片分类后的挑选 | 197 | 115 | 223 | 114 | 371 | 371 | 59.1 |
| 经过2D微片保留率（%） | 59.1 | 62.8 | 3.4 | 1.2 |
对于来自微细胞的VPP 70S核糖体，从六张去噪断层图中手动识别出5840个颗粒[CryoET Data Portal (https://cryoetdataportal.czscience.com) DS-10452-RN-18181, 18182, 18187, 18188, 18194 和 18268]。手动挑选的核糖体用于训练Octopi，然后将训练好的模型应用于从全部107张断层图中手动选择的29张断层图。为了提高自动粒子检测的准确性，使用MemBrain-seg（Lamm等人，2024#）进行了膜分割，并用作掩模以排除膜上或微细胞外的假阳性颗粒，从而得到1,820个颗粒作为STA的输入。对于没有VPP的微细胞中获得的70S核糖体，从三张去噪断层图中手动挑选出2,041个颗粒，并用它们来训练Octopi，然后将训练好的模型应用于39张手动选择的断层图。随后使用膜分割掩模进行清洗，得到3,823个颗粒用于STA。
2.10. 子断层图平均
对于每个物种，使用RELION-5（Burt等人，2024#）和py2rely（一个集成RELION CCP-EM Pipeliner作业执行工具的软件包）对非VPP和VPP数据集进行了子断层图平均（STA）。使用py2rely的实用程序将Octopi和2D微片分类的坐标导入RELION-5。以下是用于初始基于参考的细化的重采样低通滤波（LPF）参考和像素大小：VLPs – 40埃LPF，EMDB-41917，bin6，9.06埃/像素；80S核糖体 – 40埃LPF，EMDB-3883，bin6，9.06埃/像素；70S核糖体 – 50埃LPF，EMDB-10677，bin4，6.04埃/像素。为了公平比较非VPP和VPP的数据，根据较小数据集的大小为每个物种平衡了粒子计数，通过选择较大数据集的随机子集进行初始对齐。尽管如此，在每种情况下也处理了较大数据集，以展示细化流程的能力（表2#，补充图10）。对于70S核糖体，在bin4（6.04埃/像素）进行了额外的一轮3D分类，不使用tau调整因子。在这两种情况下，都得到了一类高质量的颗粒，这为选择相同数量的输入颗粒进行高分辨率细化提供了基础。
表2. 双蛋白幻影中带有和不带有VPPE的VLP和80S核糖体结构的冷冻电镜STA的数据收集和处理情况。报告了完整数据集的粒子计数和分辨率，以及VPP与无VPP的平衡数据集。VLP对称性：I. 80S和70S核糖体对称性：C1。所有数据集：电压300千电子伏特；倾斜序列（最小/最大，增量）±45°，3°；总电子曝光120电子埃^-2；像素大小1.51埃/像素。
| 结构 | 无VPP | VPP | VPP（完整） | 无VPP | VPP（完整） |
|---------------|---------------|-----------------|--------------|--------------|-----------------|
| 空细胞 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 514 |
| 带有手动挑选的断层图 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 899 |
| 经过2D微片分类后的挑选 | 197 | 115 | 223 | 114 | 371 | 371 | 59.1 |
| 经过2D微片保留率（%） | 59.1 | 62.8 | 3.4 | 1.2 |
对于来自微细胞的VPP 70S核糖体，从六张去噪断层图中手动识别出5840个颗粒[CryoET Data Portal (https://cryoetdataportal.czscience.com) DS-10452-RN-18181, 18182, 18187, 18188, 18194 和 18268]。手动挑选的核糖体用于训练Octopi，然后将训练好的模型应用于从全部107张断层图中手动选择的29张断层图。为了提高自动粒子检测的准确性，使用MemBrain-seg（Lamm等人，2024#）进行了膜分割，并用作掩模以排除膜上或微细胞外的假阳性颗粒，从而得到1,820个颗粒作为STA的输入。对于没有VPP的微细胞中获得的70S核糖体，从三张去噪断层图中手动挑选出2,041个颗粒，并用它们来训练Octopi，然后将训练好的模型应用于39张手动选择的断层图。随后使用膜分割掩模进行清洗，得到3,823个颗粒用于STA。
2.10. 子断层图平均
对于每个物种，使用RELION-5（Burt等人，2024#）和py2rely（一个集成RELION CCP-EM Pipeliner作业执行工具的软件包）对非VPP和VPP数据集进行了子断层图平均（STA）。使用py2rely的实用程序将Octopi和2D微片分类的坐标导入RELION-5。以下是用于初始基于参考的细化的重采样低通滤波（LPF）参考和像素大小：VLPs – 40埃LPF，EMDB-41917，bin6，9.06埃/像素；80S核糖体 – 40埃LPF，EMDB-3883，bin6，9.06埃/像素；70S核糖体 – 50埃LPF，EMDB-10677，bin4，6.04埃/像素。为了公平比较非VPP和VPP的数据，根据较小数据集的大小为每个物种平衡了粒子计数，通过选择较大数据集的随机子集进行初始对齐。尽管如此，在每种情况下也处理了较大数据集，以展示细化流程的能力（表2#，补充图10）。对于70S核糖体，在bin4（6.04埃/像素）进行了额外的一轮3D分类，不使用tau调整因子。在这两种情况下，都得到了一类高质量的颗粒，这为选择相同数量的输入颗粒进行高分辨率细化提供了基础。
表2. 双蛋白幻影中带有和不带有VPPE的VLP和80S核糖体结构的冷冻电镜STA的数据收集和处理情况。报告了完整数据集的粒子计数和分辨率，以及VPP与无VPP的平衡数据集。VLP对称性：I. 80S和70S核糖体对称性：C1。所有数据集：电压300千电子伏特；倾斜序列（最小/最大，增量）±45°，3°；总电子曝光120电子埃^-2；像素大小1.51埃/像素。
| 结构 | 无VPP | VPP | VPP（完整） | 无VPP | VPP（完整） |
|---------------|---------------|-----------------|--------------|--------------|-----------------|
| 空细胞 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 514 |
| 带有手动挑选的断层图 | 197 | 115 | 225 | 159 | 141 | 490 | 899 |
| 经过2D微片分类后的挑选 | 197 | 115 | 223 | 114 | 371 | 371 | 59.1 |
| 经过2D微片保留率（%） | 59.1 | 62.8 | 3.4 | 1.2 |
对于来自微细胞的VPP 70S核糖体，从六张去噪断层图中手动识别出5840个颗粒[CryoET Data Portal (https://cryoetdataportal.czscience.com) DS-10452-RN-18181, 18182, 18187, 18188, 18194 和 18268]。手动挑选的核糖体用于训练Octopi，然后将训练好的模型应用于从全部107张断层图中手动选择的29张断层图。为了提高自动粒子检测的准确性，使用MemBrain-seg（Lamm等人，2024#）进行了膜分割，并用作掩模以排除膜上或微细胞外的假阳性颗粒，从而得到1,820个颗粒作为STA的输入。对于没有VPP的微细胞中获得的70S核糖体，从三张去噪断层图中手动挑选出2,041个颗粒，并用它们来训练Octopi，然后将训练好的模型应用于39张手动选择的断层图。随后使用膜分割掩模进行清洗，得到3,823个颗粒用于STA。高通滤波器（HPF）可以减轻这种效应，在测试的值中，30 Å的截止频率在实证上表现最佳。在粒子数量相同（300,702个）的情况下，非VPP数据集的分辨率为1.66 Å，而VPP数据集的分辨率为1.90 Å [图1#(c)]。根据Rosenthal-Henderson（Rosenthal & Henderson, 2003#）图得出的B因子，非VPP重建的值为67.6 Ų，VPP重建的值为100.8 Ų [图1#(d)]，这反映了VPP对高分辨率相干信号的抑制作用。尽管如此，两种重建都显示出清晰的近原子特征 [图1#(e, f)]。表3#总结了采集和处理的统计数据。
表3. 有无VPPE的脱铁蛋白SPA的数据收集和处理总结
| 项目 | 无VPPE | 有VPPE |
|---------------|------------|------------|
| 中位离焦（µm） | 0.95 | 0.63 |
| CTF拟合小于4 Å的显微图比例 | 74% | 82% |
| 目标相位移动约60°的显微图比例 | 54% | |
| 2D分类小于4 Å的粒子比例 | 73% | 38% |
| 使用HPF的2D分类小于4 Å的粒子比例 | 74% | 71% |
| 用于重建的粒子数量 | 300,702 | 300,702 |
| FSC图分辨率（Å） | 1.66 | 1.90 |
| Rosenthal-Henderson B因子（Ų） | 67.6 | 100.8 |
尽管信号有所衰减，但VPP数据集在相同的粒子数量和相似的显微图数量下仍能产生1.9 Å的重建结果，表明VPP成像与近原子分辨率的SPA兼容。由于两个数据集的制备和处理方法相同，并且测量的冰层厚度也相当（补充图3），它们拟合的B因子之间的差异提供了VPP引起的信号衰减的实证估计，这将在后续分析中发挥作用。
3.2. 分析CTF信号在离焦和相位移动条件下的变化
利用SPA结果作为VPP引起的相干信号抑制的实证测量，我们构建了一个近似的CTF模型。该模型考虑了由于VPP散射导致的束流强度下降、估计的相位移动截止频率以及从B因子差异推断出的高分辨率信号衰减 [图2#(a)]。我们使用这个模型来探讨VPP如何改变与冷冻电镜（cryo-ET）相关的空间频率范围内的信号。具体来说，我们分析了四个频率带 [R1–R4; 图2#(a)]，通过在一系列离焦和相位移动条件下积分|CTF|值来量化信号 [图2#(b)]。
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图2. 分析|CTF|密度（对比传递函数的积分绝对值），包括有无VPP引起的相位移动和信号衰减的情况。(a) |CTF|的径向平均值，比较了无VPP成像（虚线蓝色；Δf = 1.97 µm）和有VPP成像（实线红色；Δf = 0.78 µm，相位移动φ = 72°），包括VPP的截止频率（红色箭头）和VPP相关的信号衰减。Δf和φ是本研究中使用的微细胞冷冻电镜数据集的中位数值。彩色段表示用于积分的四个空间频率范围：R1（0.002–0.03 Å−1）、R2（0.005–0.05 Å−1）、R3（0.05–0.17 Å−1）和R4（0.17–0.33 Å−1）。(b) 在一系列离焦（0–2.5 µm）和相位移动（0–90°）条件下计算的积分|CTF|值的热图，对于每个空间频率范围（R1–R4）。顶部行显示了包含VPP引起的衰减的计算结果，而底部行则没有VPP衰减（且φ = 0°）。相位移动沿垂直轴绘制，离焦沿水平轴绘制。颜色刻度表示标准化的|CTF|密度。
最低频率带R1（0.002–0.03 Å−1）涵盖了对于局部运动校正和基于补丁的倾斜序列对齐最为关键的空间频率范围。下限0.002 Å−1反映了典型的对齐补丁大小，通常是视野的1/8到1/4，而上限0.03 Å−1是由频谱信噪比（Baxter等人，2009#）大于1的频率设定的。这个上限也与最近一项研究中使用大B因子（1500–3000 Ų）辅助运动校正的结果一致（Kong等人，2025#）。在这个范围内，|CTF|密度随着相位移动的增加而增加 [图2#(b)，R1顶部]，对于相位移动超过约45°和离焦低于约1.5–2 µm的情况，相对于无VPP成像有明显的增强，并在零离焦和90°相位移动时达到最大值。相比之下，没有VPP时，信号随离焦的增加而单调增加 [图2#(b)，R1底部]，这解释了在冷冻电镜中通常使用高离焦值的原因。VPP对R1的增强信号对于提高对齐性能特别重要。
下一个频率范围是R2（0.005–0.05 Å−1），其中下限反映了在冷冻电镜中可以可靠识别和对齐的大颗粒的大小，而上限由断层扫描体素大小和初始3D分类期间使用的最大分箱因子决定。在这个范围内，VPP条件下的|CTF|密度在低离焦（< ∼7500 Å）和高相位移动（> ∼60°）时得到增强。对于R1和R2，存在一个实际的离焦和相位移动组合范围，在这个范围内预期VPP会带来好处。本研究中用于冷冻电镜数据的实验条件落在这个有利区域内，中位离焦约为7800 Å，中位相位移动约为72°，尽管在数据采集过程中相位移动不可避免地会发生变化，因为VPP的电荷作用。
R3（0.05–0.17 Å−1）对应于中间对齐细化相关的频率，是基于本研究中用于亚断层扫描平均的中间分箱因子（第4和第2箱）定义的。在这个范围内，与无VPP相比，VPP条件下的|CTF|密度略有减弱 [图2(b)，R3顶部]，只有在非常低的离焦（< ∼1000 Å）和高相位移动（> ∼60°）时，信号才显示出可比性。虽然可以设置如此低的离焦，但成功率可能较低，CTF估计可能会变得越来越不可靠。因此，我们没有在这个离焦范围内获取数据。最后一个范围R4（0.17–0.33 Å−1）代表高频区域，在这个区域内，VPP条件下的整体|CTF|密度降低，反映了高频信号衰减的影响。
在R3和R4中，CTF密度在低离焦时表现出对离焦的振荡依赖性，表现为主要是垂直的“条纹”。这可能是由于在低离焦时连续的CTF零交叉点之间的宽信号带造成的。随着离焦的变化，零交叉点发生移动，导致带积分信号中出现可观察到的局部极值。随着离焦的增加，CTF随空间频率的振荡更加迅速，CTF密度中的局部极值变得不那么明显（补充图4）。
综合这些计算表明，VPP在冷冻电镜中的潜在好处是频率依赖的：它在实验可访问的离焦和相位移动范围内增强了对于倾斜序列对齐至关重要的低频带，而其对高频成分的衰减解释了使用VPP数据时观察到的较差的STA分辨率。实际上，只有R1和R2在操作和数据分析方面都表现出稳健且易于实现的信号增强。相比之下，提取R3中的相位板效益所需的条件非常具有挑战性，预计VPP不会增强R4中的信号。因此，倾斜序列是在有利范围内的离焦值下获取的，我们评估了VPP对倾斜序列对齐和亚断层扫描平均的影响。
3.3. VPP和非VPP断层扫描图的视觉比较
为了评估VPP引入的效果对冷冻电镜的影响，我们从两种样本类型中获取了配对的VPP和非VPP数据集：一种双蛋白幻影样本（Peck, Yu, Schwartz等人，2025#）和接近最小型的Mycoplasma mycoides JCVI-Syn3A（Breuer等人，2019#）（微细胞）。在两种样本中，VPP断层扫描图都显示出图像对比度的明显增强。这种效果在微细胞断层扫描图中尤为明显，其平均厚度约为262 nm，对比度在去噪后仍然优于非VPP。报告的样本厚度是由AreTomo3（Peck, Yu, Paraan等人，2025#）根据分箱重建中识别的样本边界测量的。对于相对较薄且分布稀疏的双蛋白幻影，我们比较了无VPP获取的断层扫描图 [图3#(a)；离焦：1.85 µm；厚度：195 nm] 和有VPP获取的断层扫描图 [图3#(b)；离焦：0.87 µm；厚度：165 nm；相位移动：81°]。VPP断层扫描图显示出明显的更高对比度，包括更清晰的80S核糖体（绿色箭头）和PP7病毒样颗粒（VLPs）（粉色箭头）的描绘，这种差异在加权反投影重建中也很明显 [图3#(a)i, (b)i]。去噪后 [图3#(a)ii, (b)ii]，非VPP断层扫描图显示出与VPP断层扫描图相似的结构细节。补充图5展示了一个更薄且离焦更大的非VPP示例。对比度随离焦和厚度变化，但VPP断层扫描图在去噪前具有更高对比度的观察趋势仍然存在。对于更厚且更密集的样本，如完整的细菌微细胞，VPP成像的对比度优势更加明显。非VPP微细胞断层扫描图 [图3#(c)；1.96 µm离焦，322 nm厚度] 在去噪前显示出有限的可识别结构，使得70S核糖体的视觉识别变得困难。相比之下，相应的VPP断层扫描图 [图3#(d)；0.86 µm离焦，320 nm厚度] 在去噪前后都揭示了更多的细节。所有四个数据集都使用相同的通用去噪ET模型（Peck, Yu, Paraan等人，2025#）进行了去噪。
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图3. 有无Volta相位板（VPP）获取的断层扫描图可视化：双蛋白幻影和接近最小型的Mycoplasma mycoides JCVI-Syn3A微细胞。(a, b) 无VPP [(a)，195 nm厚度（由AreTomo3测量）和有VPP [(b)，165 nm厚度] 的双蛋白幻影的2 nm切片。放大的插图突出显示了使用加权反投影重建（a1, b1）和去噪后（a2,b2）的选定区域。绿色箭头指示80S核糖体的示例，粉色箭头标记PP7病毒样颗粒。(c, d) 无VPP [(c)，322 nm厚度] 和有VPP [(d)，320 nm厚度] 的细菌微细胞断层扫描图。放大的插图显示了去噪前后的70S核糖体区域。
3.4. VPP微细胞断层扫描图的对齐改进
为了评估分析CTF计算预测的低频优势是否转化为改进的断层扫描图对齐，我们检查了AreTomo3（Peck, Yu, Paraan等人，2025#）生成的VPP和非VPP数据集的对齐指标。AreTomo3执行无基准的倾斜序列对齐，在此过程中确定倾斜轴的方向，并通过基于补丁的局部校正对倾斜序列进行3D对齐，以考虑非刚性运动和畸变。倾斜轴估计的准确性作为全局对齐质量的衡量标准，图4#(a) 中展示了代表性示例；与仪器校准的方向[图4#(a)，右侧] 的较大偏差总是表明全局对齐较差。另一个对齐指标来自局部对齐；当测量值偏离倾斜序列的连续空间分布时，AreTomo3会标记出问题局部对齐。图4#(b) 中展示了两个使用4×4补丁的示例，其中一个显示出问题局部对齐（红色框，左侧），另一个显示出相邻补丁之间连续变化的局部对齐（右侧）。
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图4. 使用AreTomo3评估的Mycoplasma mycoides JCVI-Syn3A微细胞断层扫描图的对齐质量，有无Volta相位板（VPP）。(a) 例证AreTomo3测量的倾斜轴方向的断层切片。在左侧示例中，测量的倾斜轴（红色）与校准的仪器倾斜轴（黄色，−96.06°）非常吻合。在右侧示例中，测量的轴与校准值有显著偏差，表明全局对齐较差。(b) 无VPP（左侧）和有VPP（右侧）的倾斜序列图像，标注了AreTomo3测量的局部位移。非VPP示例包含AreTomo3标记的问题局部位移（红色框），而VPP示例则没有此类问题。(c) VPP和非VPP断层扫描图的测量倾斜轴方向分布。VPP数据集的标准差较小，表明倾斜轴的确定更加一致。(d) VPP和非VPP数据集的问题局部对齐比例分布。VPP断层扫描图中有更大比例（61%）显示零问题局部位移，而非VPP断层扫描图为42%。(e) VPP和非VPP数据集的AreTomo3测量厚度的比较，表明两个数据集之间的样本厚度分布相当。
如前一节所讨论的，本研究中的VPP断层扫描图是在尽可能低的离焦值下获取的，同时仍允许稳健的CTF估计。因此，VPP微细胞断层扫描图的中位离焦为0.78 µm，而非VPP数据集为1.97 µm [补充图6(a)]。尽管存在这种差异，估计的CTF拟合质量略有不同，VPP数据集的中位CTF分辨率略差[8.48 Å 对 7.7 Å；补充图6(b)]。相位移动测量显示了采集过程中的预期变化，中位相位移动为73° [补充图7]。未应用基于相位移动的滤波处理，以确保对齐比较能够反映常规VPP冷冻电镜（cryo-ET）数据收集中的代表性条件。通过比较含有两种蛋白质的幻影样本和微细胞数据集的VPP断层扫描图像（tomograms）的对齐结果，发现微细胞样本中更密集、更厚的断层扫描图像的对齐效果有所改善。在VPP数据集中，测量的倾斜轴方向围绕校准后的仪器轴更加集中，标准差降低了约2.5倍（9.18°对比23.07°），中位数也更接近校准后的方向（VPP为-95.98°，非VPP为-96.39°，而参考值为-96.06°）[图4#(c)]。局部对齐质量也有所提高：61%的VPP断层扫描图像没有出现问题性的局部位移，而非VPP数据集这一比例为42%[图4#(d)]。表4#总结了微细胞断层扫描图像对齐比较的统计结果。对于较薄且较不密集的含有两种蛋白质的幻影样本数据集，VPP和非VPP断层扫描图像的对齐质量相似（见补充图8），这表明VPP主要对那些更难对齐的数据集有益。
对于较厚且更密集的样本，VPP和非VPP断层扫描图像的对齐质量相似（见补充图8），这表明VPP主要对那些更难对齐的数据集有益。然而，对于较薄且较不密集的含有两种蛋白质的幻影样本数据集，VPP和非VPP断层扫描图像的对齐质量相似，这表明VPP主要对那些更难对齐的数据集有益。
断层扫描图像的对齐质量随着样本厚度的增加而变得更具挑战性。除了从同一批样本制备中获取数据外，我们还对数据集进行了过滤，以匹配不同条件下的最小和最大样本后剂量范围（见第2.8节）。过滤后，我们使用AreTomo3独立测量了样本厚度（见图4#(e)）。测量的厚度分布显示出相似的平均值和中位数。非VPP数据集中的较大标准差可能是由于厚度估计的不确定性增加所致，因为厚度测量依赖于对齐质量。这些控制措施共同表明，观察到的对齐质量改善并非由样本厚度的系统差异引起的。我们还注意到，尽管非VPP断层扫描图像是使用并行采集技术（在每个阶段位置进行多次倾斜测量）获得的，而VPP断层扫描图像则没有使用该技术，但排除图像位移的非VPP断层扫描图像并未改变这些结论（见补充图9）。
为了评估VPP对亚层扫描平均（Subtomogram averaging, STA）的影响，我们首先比较了使用VPP和不使用VPP从含有两种蛋白质的幻影样本断层扫描图像中获得的80S核糖体体积[图5#(a)–(c)]。采用了相同的STA处理流程，并使用了相同数量的粒子（见表2#）。根据FSC = 0.143的标准，非VPP处理的核糖体平均尺寸为4.8 Å，而VPP处理的核糖体平均尺寸为6.8 Å，相应的B因子分别为153 Ų和360 Ų[图5#(j)]。尽管存在这种差异，两种重建方法都能解析出二级结构元素，表明VPP数据集仍然能够确定大型大分子组装体的结构。
对于使用相同工作流程和处理相同数量粒子的PP7病毒样颗粒（VLPs），非VPP处理的重建结果同样达到了4.8 Å的分辨率，而VPP处理的重建结果达到了7.0 Å的分辨率[图5#(k)]。这与核糖体的情况类似，两种方法都揭示了可识别的二级结构特征。对于来自微细胞的70S核糖体，非VPP处理的重建结果具有更高的分辨率，但程度较小，分别为6.6 Å和7.0 Å[图5#(g)–(i)]。这反映在B因子分别为263 Ų和316 Ų上[图5#(l)]，其潜在原因将在下文讨论。
为了评估VPP对STA（Subtomogram averaging）的每个优化步骤的好处，我们在STA流程中省略了CTF（Contrast Transfer Function）优化或贝叶斯（Bayesian）抛光步骤进行了消融测试（见补充图11）。所有非VPP数据集都显示了CTF优化和贝叶斯抛光的综合效果[见补充图11(a, c, e)]，这与先前使用类似流程的研究结果一致（Zivanov等人，2022年；Zivanov等人，2020年）。然而，对于VPP数据集，完整的STA流程与省略CTF优化的STA流程在分辨率和图像质量上没有显著差异[见补充图11(b, d, f)]。这表明，在我们的实验条件下，当前的VPP数据CTF优化能力还需要进一步测试，例如，是否包含相位移动优化会有所帮助。不过，VPP数据集的低离焦值和VPP引入的信号损失也可能是限制因素。我们注意到，在CTF优化和贝叶斯抛光之前，对于来自微细胞的70S核糖体，VPP数据集获得了比非VPP数据集更好的分辨率，分别为8.2 Å和9.5 Å。这可能表明VPP在处理较密集样本时具有优势。
通过结合单粒子基准测试、分析对比传递函数（CTF）建模和定量对齐指标，我们证明了尽管高频信息有所衰减，VPP仍能增强低至中等频率的信号。这种增强的中低频信号转化为更好的倾斜序列对齐，尤其是在对齐通常具有挑战性的较厚和较密集样本中。我们对脱铁蛋白（apoferritin）进行的亚2 Å单粒子分析提供了VPP在高空间频率下引起的衰减的实证测量。当这种测量到的衰减被纳入分析对比传递函数（CTF）计算时，模型预测在运动校正和倾斜序列对齐最相关的频率范围内信号得到增强。进一步研究表明，在接近零离焦的情况下结合90°的相位移动可以获得最大的信号增益。然而，在实际操作中，接近零离焦时的稳健CTF估计和校正仍然具有挑战性，并且使用VPP实现稳定的约90°相位移动在操作上很困难，且效率较低。随着下一代相位板技术（如激光相位板（Schwartz等人，2019年）的发展，开发适用于接近零离焦数据的先进CTF估计和校正方法将变得越来越重要。
实验上，我们观察到使用VPP对齐的倾斜序列显示出更紧密的倾斜轴方向聚类和更少的问题性局部对齐，而非VPP数据则没有这种效果。相比之下，对于相对较薄且分布稀疏的含有两种蛋白质的幻影样本，我们没有观察到VPP带来的明显对齐改进，这表明VPP的优势在处理困难样本时最为明显。在这项工作中，我们主要使用AreTomo3的指标来评估对齐质量；下一步重要的是评估这些对齐改进如何转化为解释和后续处理。例如，未来的研究可以通过评估单层扫描图像的分辨率或模板匹配性能来量化对齐增益。我们的STA比较还表明，VPP处理的亚层扫描平均图像的分辨率低于非VPP处理的结果，这与先前的报告一致（Khoshouei等人，2017年；Turoňová，2020年），但仍能解析出80S核糖体和病毒样颗粒的约7 Å分辨率。VPP处理的STA性能较差部分是由于VPP对高频信号的抑制，以及我们的STA工作流程中缺乏相位移动感知的优化。我们预计，其他流程中可用的相位移动感知优化（Tegunov等人，2021年）可能有助于提高VPP数据集的分辨率。然而，仅关注STA分辨率可能会忽略VPP在处理流程早期带来的实际优势，如对比度的提高和倾斜序列对齐的改善。
在大多数显微镜光学设计中，大的图像位移可能会使未散射的光束偏离VPP相位移动区域；因此，本研究中没有使用基于图像位移的并行采集方法，导致数据收集效率降低了近一个数量级。此外，VPP需要在显微镜后焦平面上进行精确的对齐，而静电充电（特别是在聚焦离子束（FIB）铣削的薄片中普遍存在）可能会干扰这种对齐并降低相位板的性能。未来改进显微镜柱设计以实现在不改变相位板对齐的情况下进行图像位移，以及制定减轻样本充电的策略，对于扩大基于相位板的冷冻电镜（cryo-ET）的吞吐量至关重要。解决这些限制将大大提高相位板断层扫描的效率，并扩展其应用范围，包括激光相位板。
综上所述，我们的发现表明，尽管高频信号有所衰减，VPP仍能通过改善倾斜序列对齐来提升冷冻电镜（cryo-ET）的效果。预计这种增强的对齐稳健性将转化为更可靠和可解释的断层扫描重建。通过提高相位板成像的效率和数据处理能力，未来的研究可以利用VPP和下一代相位板来推动冷冻电镜结构分析的极限。
VPP微细胞断层扫描图像可通过CryoET数据门户（https://cryoetdataportal.czscience.com）获取，访问号为DS-10452。未使用VPP获取的微细胞数据集的访问号为DS-10442。使用VPP和未使用VPP获取的含有两种蛋白质的幻影样本的断层扫描图像及注释的访问号分别为DS-10469和DS-10468。所有图像已存入EMDB数据库，访问代码见表2#和3#。我们使用了Octopi（https://github.com/chanzuckerberg/octopi）进行粒子挑选。Slabpick（https://github.com/apeck12/slabpick）和py2rely（https://github.com/chanzuckerberg/py2rely/tree/kaggle）用于基于微片的2D分类和整理，py2rely还用于冷冻电镜亚层扫描图像的平均处理。
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