：
目标：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）患者的外周中性粒细胞水平与生存期呈负相关，提示中性粒细胞在疾病进展中扮演一定角色。本研究旨在表征几种中性粒细胞活化通路的标志物，并评估其与生存期的关联，以确定疾病的潜在机制。
方法：从密歇根大学ALS诊所的参与者或健康对照者获取血样。通过原代中性粒细胞的图像分析，定量评估离体中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular trap, NET）的形成。随后，通过酶联免疫吸附法检测血浆中一般活化标志物（钙卫蛋白，Calprotectin）、迁移标志物（基质金属蛋白酶9，Matrix-metalloproteinase 9 [MMP9]）和脱颗粒标志物（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，Neutrophil gelatinase-associated lipocalin [NGAL]）的水平；通过荧光法评估NET形成标志物（双链DNA，Double-stranded DNA [dsDNA]）。然后，使用Cox比例风险回归模型将这些标志物与ALS生存期进行关联分析，并按性别分层。
结果：ALS患者的自发性离体NET形成（对照组N=20，ALS组N=66）有所增加（对照组1.0% vs. ALS组9.7%；p=0.017）。在血浆中（对照组N=233，ALS组N=178），与对照组相比，ALS患者的钙卫蛋白（294 vs. 372 ng/mL；p< 0.001）、MMP9（106 vs. 152 ng/mL；p< 0.001）和NGAL（61 vs. 66 ng/mL；p=0.01）水平均升高。钙卫蛋白、MMP9和NGAL水平与ALS生存期无关联；然而，dsDNA与较差的ALS生存期相关，但仅在女性患者中存在（风险比Hazard Ratio, HR=1.77 [95% 置信区间1.20–2.61]；p=0.004）。
阐释：中性粒细胞功能在ALS中被改变，NET形成是中性粒细胞（尤其在女性患者中）参与ALS病理的潜在机制。
论文解读：肌萎缩侧索硬化中中性粒细胞的活化与胞外诱捕网形成研究
一、 研究背景、问题与目的
肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种无法治愈、快速致命的运动神经元疾病。越来越多的证据表明，免疫系统失调是其复杂病理生理学的一部分。在众多免疫细胞中，中性粒细胞作为一种丰富且功能多样的先天免疫细胞，与多种疾病的病理相关，包括其他神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和多发性硬化症。此前的研究，包括本团队的工作，已揭示中性粒细胞与ALS进展，尤其是在女性患者中，存在重要关联。具体而言，外周中性粒细胞水平与ALS患者的生存期呈负相关。然而，关于中性粒细胞在ALS中具体如何发挥作用，其活化、迁移、脱颗粒及形成中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular trap, NET）等功能状态如何，这些机制与疾病进展，特别是与性别差异的关系，尚不明确。鉴于中性粒细胞是免疫调节治疗的潜在靶点，明确其在ALS中的具体作用机制，对于开发更有效的治疗策略至关重要。因此，本研究旨在通过离体和血浆标志物分析，全面表征ALS患者的中性粒细胞功能状态，并探讨其与生存期的关联，特别关注性别差异，以期为理解ALS的免疫病理机制提供新见解。本研究成果发表于《Annals of Clinical and Translational Neurology》期刊。
二、 关键技术方法概述
研究人员采用了互补的两种方法来评估中性粒细胞功能。首先是离体NET形成分析 ：从参与者（对照组20人，ALS患者66人）新鲜采集的外周血中，通过负向分选法分离出原代中性粒细胞。在体外培养2或4小时后，用或不用佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）刺激，然后通过荧光染色和显微成像，利用DNA面积与NET形成分析（DNA Area and NETosis Analysis, DANA）软件，量化自发性与最大NET形成的比例。其次是血浆中性粒细胞功能标志物定量分析 ：使用从密歇根大学ALS生物样本库获得的、在参与者入组时采集并冷冻保存的血浆样本（对照组233人，ALS患者178人）。通过酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量分析钙卫蛋白（Calprotectin， 代表活化）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9, MMP9， 代表迁移）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL， 代表脱颗粒）的水平；通过Quant-iT高灵敏度双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）检测试剂盒检测dsDNA水平，作为NET形成的间接标志物。所有分析均采用标准化的操作流程和质量控制，并使用最佳样本分配工具来减少批次效应。统计上，研究人员比较了ALS组与对照组标志物的差异，并使用Cox比例风险回归模型分析各标志物与ALS患者生存期的关联，并进行性别分层分析，模型中纳入了年龄、诊断延迟、诊断至取样时间、El Escorial诊断标准、ALS功能评定量表修订版（Amyotrophic lateral sclerosis functional rating scale revised, ALSFRS-R）分数、起病部位等临床协变量。
三、 研究结果
3.1 离体NET形成定量分析
研究人员首先发现，与对照组相比，ALS患者的原代中性粒细胞在体外未经刺激的条件下（即自发性NET形成），2小时内的NET形成比例显著更高（对照组中位数1.0% vs. ALS组9.7%；p =0.017），4小时也呈相似趋势。然而，在PMA最大刺激下，两组的中性粒细胞形成NET的最大能力没有差异。这表明，ALS患者的中性粒细胞本身更容易被激活而形成NET，但其最大形成NET的潜能并未改变。
3.2 中性粒细胞功能标志物分析
在血浆分析中，研究人员发现ALS患者的关键中性粒细胞功能标志物水平普遍升高：
• 钙卫蛋白 、MMP9 和NGAL 水平在ALS患者中均显著高于健康对照。当按性别分层时，这些升高在女性ALS患者中表现尤为明显，例如钙卫蛋白在女性ALS患者中显著高于女性对照和男性ALS患者。
• dsDNA 水平在ALS患者中有升高趋势，但未达到统计显著性。
相关性分析显示，这些血浆标志物水平与外周血中性粒细胞计数存在正相关，表明它们主要来源于中性粒细胞。敏感性分析（包括年龄匹配和模型校正）表明，观察到的差异并非由年龄因素所致。这些结果共同表明，ALS患者，特别是女性患者，其外周循环中的中性粒细胞处于更高的活化、迁移和脱颗粒状态。
3.3 中性粒细胞功能标志物与疾病的关联
最关键的分析是评估这些标志物与ALS患者生存期的关联。Cox回归模型结果显示：
• 钙卫蛋白、MMP9和NGAL 的血浆水平与ALS患者的总生存期没有显著关联 。
• 然而，dsDNA 水平升高与更差的ALS生存期 显著相关（HR=1.26, p =0.045）。当按性别分层时，这一关联完全由女性患者驱动 （女性HR=1.77, p =0.004），在男性患者中则无显著关联。起病部位的亚组分析并未改变这一结果。这提示，NET形成（以血浆dsDNA为标志物）可能是影响ALS预后的一个因素，且该影响具有显著的性别特异性。
四、 讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员将本研究发现置于现有文献背景中，指出结果支持了先前关于ALS患者中性粒细胞高活化和NET形成相关基因表达上调的报道。研究强调了NET形成在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中的已知作用，为理解其在ALS中的潜在病理贡献提供了线索。尤其值得注意的是，研究人员深入探讨了本研究揭示的性别差异 。这与他们之前发现的女性ALS患者中中性粒细胞计数与生存期负相关、中性粒细胞计数与老年女性疾病进展相关等结果一致。性别差异在ALS的临床表现和免疫反应中普遍存在，可能涉及性激素的影响（例如，体外研究表明雌二醇可调节中性粒细胞的NET形成，且效应存在性别差异），这提示未来研究和治疗开发必须充分考虑性别因素。
研究人员也坦率指出了本研究的局限性，包括离体NET分析的样本量有限、血浆标志物并非完全中性粒细胞特异性、横断面研究设计、缺乏外部验证队列和神经退行性疾病对照等。但研究也强调了其优势，如通过离体实验验证了之前的转录组学发现，以及使用了较大样本量进行稳健的生存分析并按性别分层。
研究结论 ：中性粒细胞功能在ALS中被改变，并且中性粒细胞胞外诱捕网形成可能是中性粒细胞（尤其是在女性患者中）导致疾病进展的一种机制。这些发现支持了继续研究中性粒细胞和NET形成在ALS中作用的必要性，并表明它们可能作为潜在的治疗靶点。
打赏
