摘要
背景
视觉功能障碍是帕金森病（PD）常见的非运动症状表现，可能先于运动症状出现。本研究旨在表征PD的早期纤维化α-突触核蛋白（PFF）小鼠模型。
方法
雄性C57BL/6J小鼠接受脑内注射α-突触核蛋白（α-syn）PFFs或磷酸盐缓冲盐水。在注射后3个月和6个月，使用模式视觉诱发电位（PVEPs）和视觉悬崖测试评估视觉功能。通过苏木精-伊红染色、免疫荧光和Western blot分析评估视网膜形态和蛋白质表达，包括磷酸化α-突触核蛋白（pS129）、酪氨酸羟化酶（TH）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Iba1。使用荧光显微镜检查视觉通路和关联皮层中的病理α-突触核蛋白分布。
结果
在3个月时，注射PFF的小鼠表现出PVEP潜伏期延长和幅度降低，表明早期视觉通路功能障碍，这种状况在6个月时恶化。视网膜结构保持完整，但在神经节细胞中出现p-α-突触核蛋白积累，伴随TH表达减少和微胶质细胞及Müller胶质细胞的激活。在视觉皮层和视觉关联皮层（包括额叶、顶叶、颞叶和杏仁核区域）检测到pSer129免疫反应性结构。
结论
在α-突触核蛋白PFF注射的小鼠中，视觉系统的功能和病理改变先于运动缺陷出现。早期视网膜和皮层突触核蛋白病变可能是前驱性视觉功能障碍的基础，并可作为PD早期诊断的潜在生物标志物。
缩写
α-突触核蛋白（α-synuclein）
基底外侧杏仁核（BLA）
多巴胺（DA）
多巴胺能无长突触细胞（DACs）
多巴胺能神经元（DNs）
电视网膜图（ERG）
额叶运动皮层（FC）
神经节细胞层（GCL）
胶质纤维酸性蛋白（GFAP）
海马体（Hip）
内核层（INL）
内丛层（IPL）
外侧膝状核（LGN）
视交叉（OC）
光学相干断层扫描（OCT）
视神经（ON）
外核层（ONL）
外丛层（OPL）
视束（OT）
帕金森病（PD）
预形成的纤维（PFF）
视网膜神经节细胞（RGCs）
视网膜神经纤维层（RNFL）
黑质（SN）
纹状体（STR）
颞叶关联皮层（TeA）
酪氨酸羟化酶（TH）
视觉皮层（VC）
视觉诱发电位（VEPs）
1 引言
帕金森病（PD）是一种常见的与年龄相关的中枢神经系统神经退行性疾病，通常逐渐发展并不可逆地进展，最终导致患者日常生活功能和生活质量显著下降（Harrison和Luciano 2021）。其核心病理特征是黑质-纹状体回路中多巴胺能神经元（DNs）的选择性退化以及α-突触核蛋白（α-syn）的错误折叠和聚集（Sharma等人2025）。α-突触核蛋白的异常积累被认为是PD病理生理学的关键因素，涉及驱动多巴胺能神经毒性、破坏血脑屏障的完整性以及放大神经免疫反应（Shulman等人2011）。PD患者中经常观察到视觉障碍，这是主要的非运动症状之一。流行病学研究表明，近78%的PD患者存在不同程度的视觉功能障碍，包括视力下降、对比敏感度降低、颜色感知改变、运动检测受损和视觉幻觉——其中许多症状可能在经典运动体征出现之前就已存在（Weil等人2016；Ortuño-Lizarán等人2020；Vidailhet 2024）。最近使用视觉诱发电位（VEPs）和电视网膜图（ERG）的研究发现，早期PD患者的视网膜电活动减弱（Casciano等人2024；Sipos-Lascu等人2024）。通过光学相干断层扫描（OCT）的结构成像显示，视网膜神经纤维层（RNFL）厚度减少，这一指标通常与临床疾病严重程度相关（Poveda等人2024）。功能性神经成像显示，PD患者的后部皮层区域（如枕叶、顶叶和部分颞叶）的代谢活动降低（Armstrong 2017）。此外，还发现了视觉相关静息状态网络的异常连接（Baik等人2024）。尸检分析进一步证明了视网膜和视神经（ON）中的α-突触核蛋白病理变化，这些变化通常与相应脑结构中的突触核蛋白病变程度一致（Li等人2023；Hart de Ruyter等人2023）。这些研究表明，视觉通路（包括视网膜）的功能和结构变化在PD的早期诊断和疾病评估中具有潜力。然而，其潜在机制尚不清楚，这些视觉变化的作为PD生物标志物的特异性需要进一步验证。此外，病理α-突触核蛋白在视觉系统中的传播机制尚未完全阐明。尽管当前的研究试图描述PD患者的视觉通路形态和功能变化，但由于前瞻性临床研究的固有限制，仍难以在疾病前驱期研究视觉系统的变化。相比之下，PD的动物模型提供了一个强大的平台，可以克服这些挑战并详细检查早期病理生理变化。迄今为止，只有少数研究描述了PD动物模型中的视网膜病理变化。例如，MPTP神经毒素模型（Tran等人2022）和腺相关病毒（AAV）介导的人类野生型α-突触核蛋白过表达（Marrocco等人2020）显示视网膜电生理反应减弱、视觉障碍和视网膜多巴胺能无长突触细胞（DACs）丧失。同样，在α-突触核蛋白转基因小鼠（TgM83）中，观察到α-突触核蛋白积累加速（Mammadova等人2021）和光感受器细胞严重退化（Xu等人2024）。然而，大多数这些研究主要关注视网膜变化，对整个视觉通路的病理变化，特别是在疾病前驱期的变化关注较少。
α-突触核蛋白预形成的纤维（PFFs）可作为种子，在细胞内诱导内源性α-突触核蛋白的聚集，表现出类似朊病毒的传播特性。当通过立体定向注射到大脑中时，α-突触核蛋白PFFs可以再现PD中观察到的进行性α-突触核蛋白病变和运动症状，从而提供比基于毒素或转基因的模型更准确的疾病进展模型（Paumier等人2015；Patterson等人2019）。这使得α-突触核蛋白PFF模型成为研究PD发病机制和早期诊断的宝贵工具。在本研究中，我们采用纹状体立体定向注射α-突触核蛋白PFFs来建立PD小鼠模型。我们评估了视觉功能、视网膜形态、视觉通路中的电生理活动以及前驱期和症状期病理α-突触核蛋白的积累模式。我们的结果发现，视觉电生理异常、酪氨酸羟化酶（TH）表达下调和胶质细胞激活发生在运动症状出现之前。此外，在视网膜和视觉相关脑区检测到pSer129免疫反应性结构。这些发现表明，视觉系统的功能和病理改变可能作为PD的潜在早期生物标志物。值得注意的是，我们还在运动前阶段观察到高级视觉处理区域（包括视觉皮层（VC）、额叶、顶叶和颞叶关联皮层以及杏仁核）中的病理α-突触核蛋白积累。这可能是复杂视觉障碍出现的基础，并突显了早期PD中广泛视觉通路的参与。
2 材料与方法
2.1 重组α-突触核蛋白的生产和人类α-突触核蛋白PFF的制备
α-突触核蛋白PFF的制备方法如前所述（Volpicelli-Daley等人2014）。简而言之，使用含有全长人类α-突触核蛋白序列的pET-28b（+）载体的Escherichia coli BL21（DE3）细胞异源生产野生型人类α-突触核蛋白。转化后，培养物在Luria–Bertani（LB）培养基中扩增，并通过添加1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）触发蛋白质表达。细菌细胞以5000 rpm离心5分钟，然后重新悬浮在Tris缓冲液中（150 mM Tris，pH 8.0，添加10 mM EDTA和150 mM NaCl）。通过超声处理破坏细胞，然后以13,000 rpm离心15分钟澄清裂解物。上清液用10 mM Tris（pH 7.6）、50 mM NaCl和1 mM EDTA透析。含有可溶性α-突触核蛋白的上清液使用His标签纯化试剂盒（Beyotime，P2226，中国）进行镍柱纯化。具体来说，上清液与50% BeyoGold His标签树脂混合，在4°C下摇床中孵育1小时。随后用洗涤缓冲液洗涤六次，再用洗脱缓冲液洗脱六次，最后用ddH2O冲洗两次。树脂最终储存在20%乙醇溶液（在磷酸盐缓冲盐水[PBS]中）中，温度为4°C。纯化的蛋白质转移到3 kDa超滤管中，并在4°C下以7500 rpm离心30分钟浓缩。浓缩后的蛋白质在相同条件下再浓缩两轮，然后加入2 M NaCl，样品在室温下保存。使用内毒素去除试剂盒（ToxinEraserTM，GenScript，L00338，中国）去除内毒素。通过比色酸（BCA）蛋白定量后，将单体蛋白质稀释至最终浓度5 mg/mL。为了形成纤维，纯化的单体α-突触核蛋白在37°C下以1000 rpm的恒定搅拌速度在Eppendorf Thermomixer中孵育7天，以促进体外纤维组装的形成。在实验应用之前，将形成的纤维通过探针超声处理（10%振幅，30秒，交替脉冲（0.5秒开/关）稀释并破碎成短PFFs。使用透射电子显微镜（TEM）确认α-突触核蛋白PFF的结构完整性和纤维形态。
2.2 动物和纹状体（STR）的立体定向注射
所有实验程序均获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并按照机构指南进行。雄性野生型C57BL/6J小鼠（8周龄）饲养在无特定病原体的动物设施中，温度为22°C，食物和水自由供应，光照/黑暗周期为12小时。每个笼子最多饲养五只小鼠。小鼠随机分配到三个实验组：PBS注射对照组、注射后3个月组（3 MPI）和注射后6个月组（6 MPI）。最初，每个组注射12只小鼠。所有小鼠在用于组织和蛋白质分析之前都进行了行为测试和模式视觉诱发电位（PVEP）记录。在补充实验中，每个组增加了六只小鼠，用于分析大脑矢状p-α-突触核蛋白免疫荧光染色。小鼠在手术前30分钟皮下注射缓释布普瑞诺芬悬浮液（XR，3.25 µg/g），然后腹腔注射Avertin（250 µg/g）麻醉。麻醉成功诱导后，将小鼠放入立体定向框架中。用碘和酒精消毒后，切开头皮并暴露颅骨。用浸有30%过氧化氢的棉签清洁颅骨表面并确定bregma。以bregma为参考点，确定双侧纹状体坐标——前后（AP）：+0.2 mm；内外侧（ML）：±2.0 mm；背腹（DV）：+2.6 mm。在每个位置钻一个小孔，然后将微注射器缓慢插入目标区域。每个半球注射2 µL α-突触核蛋白PFF溶液（2.5 µg/µL），速率为0.2 µL/分钟。注射后，针头保持原位5分钟，然后缓慢拔出。手术部位用聚维酮碘消毒，缝合，并涂抹红霉素软膏以防感染。小鼠用耳标标记，放在加热垫上恢复，完全清醒后返回动物饲养室进行后续实验。
2.3 行为评估
2.3.1 开放场测试
为了评估自发性运动活动和一般探索行为，使用40 × 40 × 40 cm的立方围栏内的开放场范式评估小鼠。测试前，动物至少适应实验环境30分钟以减少压力相关变异。每次实验之间用70%乙醇消毒设备以消除残留的嗅觉痕迹，然后风干。每只小鼠轻轻引入场地的外边界角落，并使用头顶摄像机连续监测10分钟的行为活动。
2.3.2 旋转棒测试
为了评估运动协调性和平衡能力，小鼠接受旋转棒测试。训练在测试前连续三天每天进行一次，每次试验持续约3分钟，速度为20 rpm。在测试阶段，旋转棒被编程在5分钟内从4 rpm加速到40 rpm。跌落时的延迟时间和跌落时的旋转速度被自动记录下来。
2.3.3 攀杆测试
使用一根垂直的杆子来评估运动协调性和平衡能力，这根杆子高50厘米（直径1厘米），顶部装有一个直径2.5厘米的球体以便于放置。小鼠经过3天的适应期以减少新环境引起的变异。在每次试验中，小鼠被放置在杆子的顶部朝上，并被轻轻引导向下转动。完成转身并下降到平台底部所需的时间被记录下来。每只小鼠完成三次试验，平均下降时间被用于进一步分析。
2.3.4 握力测试
使用校准过的握力计来量化前肢肌肉的力量。小鼠被允许用前爪牢固地抓住仪器的网格，同时它们的尾巴被稳定地向后拉，直到它们松开握力。每次拉扯过程中产生的峰值力量被自动记录下来。每只动物重复测量三次，平均值用于统计比较。
2.3.5 视觉悬崖测试
视觉悬崖装置由一个透明的亚克力盒子（80 × 80 × 25厘米）组成，盒子的一半延伸出实验室工作台的边缘。盒子底部放置了一个棋盘图案，以在一边创造深度的错觉。每次试验前，装置都会用乙醇清洁和除臭。小鼠被放置在盒子的中线上，它们在“深”侧平台上停留的时间被记录下来，作为视觉感知的测量指标。
2.4 PVEP测量
PVEP是使用视觉电生理检查系统（GT-2000NV）完成的。在测试之前，小鼠被放置在黑暗的房间里1小时。然后通过腹腔注射250 µg/g的Avertin进行麻醉，并固定在带有加热垫的立体定位框架中，保持直肠温度在37.0°C ± 0.5°C。角膜用眼科凝胶（Viscotears）保护。在头皮消毒和暴露颅骨后，在视觉中心（VC）两侧钻出直径1.5毫米的小孔（位于bregma后方4毫米，中线外侧3毫米处），同时保持硬脑膜完整。金属电极被放置在VC上的硬脑膜上，并用胶带固定，不会损伤脑组织。参考电极被皮下插入，放置在皮肤和鼻骨之间。接地电极被皮下插入小鼠的尾部。记录了记录电极、参考电极和接地电极之间的电阻，阻抗小于10 kΩ。系统显示用于提供反转的棋盘刺激。屏幕被放置在眼睛前方约15厘米处。非测试眼被遮盖。给予黑白反转的棋盘刺激，空间频率为0.07周期/度，时间频率为1 Hz，亮度为100%，对比度为97%，通带为1–300 Hz，有80层叠加。PVEP响应信号在平均后观察300毫秒。测量了这个PVEP信号的P100波的幅度和延迟时间。每只小鼠测量三次，取平均值。每次测量之间有10分钟的间隔。所有三组实验小鼠在PVEP数据收集后立即通过心脏灌注被安乐死。组织被收集用于后续分析，动物不允许从麻醉中恢复。
2.5 组织收集
在注射后的指定时间点，小鼠通过腹腔注射Avertin（250 µg/g）被麻醉，并通过心脏灌注PBS。视网膜、ON和大脑在冰上迅速解剖。用于蛋白质分析的样本被快速冷冻在液氮中，并储存在-80°C。对于组织学分析，眼球和脑组织在4°C的4%多聚甲醛（PFA）中固定，以便后续的冷冻切片和免疫组化。
2.6 视网膜的苏木精和伊红（H&E）染色
去核后，眼部组织在4°C的4% PFA中浸泡固定过夜。样本随后进行石蜡包埋，使用旋转切片机获得包含ON头的8 µm厚的矢状切片。切片安装在玻璃载玻片上后，进行标准的H&E染色。染色的样本被风干并用盖玻片密封保存。使用激光扫描共聚焦显微镜（LSM 900，Zeiss）捕获数字图像，并利用ImageJ软件（NIH，美国）进行定量形态学分析。在用于视网膜H&E染色的七只小鼠中，一些样本因组织损伤而被排除，最终每组有六个样本用于分析。在神经节细胞层（GCL）、内核层（INL）、外核层（ONL）以及整个视网膜厚度（后极、赤道区和周边区）中量化细胞密度（细胞/平方毫米）。对于每种染色，从每个区域的三个切片中分析三个切片，每个切片检查三个视野。
2.7 视网膜和ON的免疫荧光染色
灌注后的眼球和ON在4°C的4% PFA中过夜后固定，然后在分级蔗糖溶液（10%、20%和30%）中脱水24小时。脱水组织被包埋在最佳切割温度化合物中，转移到包埋模具中，并在-80°C下快速冷冻以进行冷冻保存。使用冷冻切片机制备视网膜和ON的矢状冷冻切片（12 µm厚），并安装在玻璃载玻片上。载玻片在37.5°C的培养箱中风干2小时，然后储存在-80°C直到使用。染色前，切片被带到室温，用1× PBS冲洗三次，并在室温下用含有5%胎牛血清（FBS）的PBST（PBS + 0.3% Triton X-100）渗透/封闭1小时。在PBS清洗后，切片在4°C下与以下一级抗体一起过夜孵育：抗-phospho-S129 α-syn（pS129 α-syn；1:500，Abcam，ab51253）、抗-α-syn（1:500，Cell Signaling Technology，4179）、抗-NeuN（1:500，Millipore，MAB377）、抗-TH（1:800，Oasis Biopharma，OB-PRB100）、抗-Iba1（1:800，Oasis Biopharma，OB-PGP049-01）和抗-GFAP（1:500，Santa Cruz Biotechnology，sc-65343）。一级抗体孵育后，切片用PBS冲洗三次（每次10分钟），然后在室温下在黑暗中与相应的荧光二级抗体一起孵育1小时（1:500）：Alexa Fluor 488（Molecular Probes，R37118）和Alexa Fluor 555（Molecular Probes，R37115）。切片再次用PBS冲洗三次（每次10分钟），风干，并用含有DAPI的封片介质封盖。使用激光扫描共聚焦显微镜（LSM 900，Zeiss）捕获荧光图像，并使用Zen Blue软件版本3.6进行图像处理。在用于视网膜H&E染色的七只小鼠中，一些样本因组织损伤而被排除，最终每组有六个样本用于分析。选择通过ON的矢状切片进行视网膜分析。对于每种染色，从每个区域的三个切片中分析三个切片，每个切片检查三个视野。
2.8 脑组织的免疫荧光染色
灌注后的眼球和ON在4°C的4% PFA中过夜后固定，然后在10%和20%的蔗糖溶液中脱水24小时，以及在30%的蔗糖溶液中脱水24小时。脱水组织被包埋在最佳切割温度化合物中，并在-80°C下快速冷冻以进行冷冻保存。使用冷冻切片机制备视网膜和ON的矢状冷冻切片（12 µm厚），并安装在玻璃载玻片上。载玻片在37.5°C的培养箱中风干2小时，然后储存在-80°C直到使用。染色前，切片被带到室温，用1× PBS冲洗三次，并在室温下用含有5%胎牛血清（FBS）的PBST渗透/封闭1小时。在PBS清洗后，切片在4°C下与以下一级抗体一起过夜孵育：抗-phospho-S129 α-syn（1:500，Abcam，ab51253）、抗-TH（1:800，Oasis Biopharma，OB-PRB100）和抗-多巴胺转运蛋白（DAT；1:800，Millipore，MAB369）。一级抗体孵育后，切片用PBS冲洗三次（每次10分钟），然后在室温下在黑暗中与相应的荧光二级抗体一起孵育1小时（1:500）：Alexa Fluor 488（Molecular Probes，R37118）和Alexa Fluor 555（Molecular Probes，R37115）。切片再次用PBS冲洗三次（每次10分钟），风干，并用含有DAPI的封片介质封盖。使用激光扫描共聚焦显微镜（LSM 900，Zeiss）捕获荧光图像，并使用Zen Blue软件版本3.6进行图像处理。在用于视网膜组织学的七只小鼠中，一些样本因组织损伤而被排除，最终每组有六个样本用于分析。选择通过ON的矢状切片进行视网膜分析。对于每种染色，从每个区域的三个切片中分析三个切片，每个切片检查三个视野。
2.9 视网膜裂解物的Western Blot分析
视网膜组织在冰上用缓冲液裂解，并用短暂脉冲超声处理（1–2秒）直至完全均匀。裂解物在4°C下以12,000 rpm离心30分钟，收集上清液用于后续的蛋白质分析。蛋白质浓度用BCA试剂盒测定。等量的蛋白质通过与2× SDS样品缓冲液混合并在95°C下加热10分钟来变性。根据目标蛋白质的分子量，使用10%或13.5%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分离。电泳在90 V下进行30分钟，然后在120 V下进行大约90分钟。分离后，蛋白质被转移到PVDF膜上，并用5%非脂干牛奶在PBST（PBS with 0.1% Tween-20）中封闭1小时。膜随后在4°C下与以下一级抗体一起孵育过夜：抗-phospho-S129 α-syn（1:500；Abcam，ab51253）、抗-TH（1:800；Oasis Biopharma，OB-PRB100）、抗-GAPDH（1:500,000；Proteintech，60004-1-Ig）和抗-β-actin（1:1000；Santa Cruze，SC-47778）。三次TBST清洗后，膜在室温下与HRP结合的二级抗体一起孵育1小时并轻轻搅拌。每组使用五只小鼠进行Western blot分析。蛋白质条带使用增强化学发光（ECL）试剂可视化，并使用化学发光成像系统记录。使用ImageJ软件（NIH，美国）进行密度分析，并对灰度值进行归一化并进行了统计评估。一些样本因转移质量差或曝光不足而影响密度测量，最终每组有四只小鼠用于Western blot分析。
2.10 统计分析
所有行为和组织学分析都是以盲法进行的。实验者在所有数据收集和量化之前不知道组别分配。除非另有说明，所有数据都以至少三个独立实验的平均值±标准误差（SEM）呈现。统计分析使用GraphPad Prism 9.2.0（GraphPad Software Inc.，La Jolla，California，USA）进行。使用Unpaired Student's t-test比较两组，而使用one-way ANOVA比较多个组。p值小于0.05被认为具有统计学意义。图表使用GraphPad Prism 9.2.0生成。
3 结果
3.1 在注射STRIAT PFF后3个月和6个月时，抑郁样行为和运动缺陷的逐渐出现
为了评估运动表现，我们进行了一系列行为测试。使用尾部悬挂测试（Kim等人，2019年）来评估抑郁样行为。在注射α-syn PFF到STRIAT后3个月（3 MPI），与注射PBS的对照组相比，小鼠在开放场测试、攀杆测试、旋转棒表现或握力方面没有显著差异（图1A–F）。然而，在尾部悬吊测试期间，不动时间显著增加，这表明存在类似抑郁的行为（图1G）。注射后6个月（6 MPI），PFF注射的小鼠表现出明显的运动障碍：在开放场地测试中行进的总距离显著减少，下降杆测试的时间延长，旋转棒测试中的跌落潜伏期缩短，握力减弱（图1C,E–G）。值得注意的是，PFF注射的小鼠在开放场地的中心区域花费的时间显著减少，表明焦虑行为增加（图1D）（Çevik等人，2025年）。此外，行进总距离的减少可能与焦虑增加有关。尾部悬吊测试期间的不动时间进一步增加，表明类似抑郁的症状恶化（图1H）。根据运动缺陷的出现，我们将3 MPI定义为帕金森病（PD）模型的前症状阶段，6 MPI定义为症状阶段。值得注意的是，类似抑郁的行为在明显的运动症状出现之前就可以检测到，这与临床观察结果一致，即在一部分PD患者中，情绪障碍可能先于运动功能障碍（Assogna等人，2020年）。
图1：在图查看器中打开
α-突触核蛋白（PFF）脑内注射后，小鼠逐渐出现类似抑郁的行为和运动功能障碍。（A）三组小鼠的注射时间表。（B）开放场地测试中对照组、3 MPI和6 MPI小鼠的代表性运动轨迹。（C）行进总距离的量化。（D）在开放场地中心区域花费的时间。（E）下降杆测试所需的时间。（F）旋转棒测试中的跌落潜伏期。（G）前肢握力（标准化）。（H）尾部悬吊测试中的不动时间。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。组别规模：PBS（n = 12），PFF-3MPI（n = 12），PFF-6MPI（n = 12）。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）确定：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
3.2 脑纹状体PFF注射后多巴胺能神经元的进行性退化和α-突触核蛋白病理变化
为了评估多巴胺能神经元的退化以及病理性的α-突触核蛋白积累，我们在矢状脑切片中对脑纹状体（STR）中的多巴胺转运体（DAT）、黑质（SN）中的TH阳性神经元以及丝氨酸129位点磷酸化的α-突触核蛋白（pS129，病理性α-突触核蛋白的标志物）进行了免疫荧光染色。比较了PBS注射的对照组、注射后3个月（3 MPI）和6个月（6 MPI）的PFF注射小鼠。在3 MPI时，PFF注射小鼠的STR中的DAT表达量比对照组减少，而在6 MPI时这种减少更为明显（图2A,B）。同样，SN中的TH阳性神经元密度也随时间下降，在6个月的干预时间点变得更加明显（图2A,C）。这些发现与Western blot结果一致，后者显示在同一时间点，腹侧中脑的TH蛋白水平逐渐降低（图2E）。完整的Western blot图像见图S1A。在通过注射部位的矢状脑切片中，可以在3 MPI时检测到pS129 α-突触核蛋白的免疫反应性，在注射部位周围形成了一个明显的核心。到6 MPI时，p-α-突触核蛋白的强度和分布显著增加，表明病理性的α-突触核蛋白逐渐积累和扩散（图2A,D）。总体而言，脑纹状体PFF注射导致多巴胺能末梢和细胞体的进行性退化，并且在6个月的时间里病理性的α-突触核蛋白水平逐渐升高。
3.2 脑纹状体PFF注射后多巴胺能神经元的进行性退化和α-突触核蛋白病理变化
为了评估多巴胺能神经元的退化以及病理性的α-突触核蛋白积累，我们在矢状脑切片中对脑纹状体（STR）中的多巴胺转运体（DAT）、黑质（SN）中的TH阳性神经元以及丝氨酸129位点磷酸化的α-突触核蛋白（pS129，病理性α-突触核蛋白的标志物）进行了免疫荧光染色。比较了PBS注射的对照组、注射后3个月（3 MPI）和6个月（6 MPI）的PFF注射小鼠。在3 MPI时，PFF注射小鼠的STR中的DAT表达量比对照组减少，而在6 MPI时这种减少更为明显（图2A,B）。同样，SN中的TH阳性神经元密度也随时间下降，在6个月的干预时间点变得更加明显（图2A,C）。这些发现与Western blot结果一致，后者显示在同一时间点，腹侧中脑的TH蛋白水平逐渐降低（图2E）。完整的Western blot图像见图S1A。在通过注射部位的矢状脑切片中，可以在3 MPI时检测到pS129 α-突触核蛋白的免疫反应性，在注射部位周围形成了一个明显的核心。到6 MPI时，p-α-突触核蛋白的强度和分布显著增加，表明病理性的α-突触核蛋白逐渐积累和扩散（图2A,D）。总体而言，脑纹状体PFF注射导致多巴胺能末梢和细胞体的进行性退化，并且在6个月的时间里病理性的α-突触核蛋白水平逐渐升高。
3.2 脑纹状体PFF注射后多巴胺能神经元的进行性退化和α-突触核蛋白病理变化
为了评估多巴胺能神经元的退化以及病理性的α-突触核蛋白积累，我们在矢状脑切片中对脑纹状体（STR）中的多巴胺转运体（DAT）、黑质（SN）中的TH阳性神经元以及丝氨酸129位点磷酸化的α-突触核蛋白（pS129，病理性α-突触核蛋白的标志物）进行了免疫荧光染色。比较了PBS注射的对照组、注射后3个月（3 MPI）和6个月（6 MPI）的PFF注射小鼠。在3 MPI时，PFF注射小鼠的STR中的DAT表达量比对照组减少，而在6 MPI时这种减少更为明显（图2A,B）。同样，SN中的TH阳性神经元密度也随时间下降，在6个月的干预时间点变得更加明显（图2A,C）。这些发现与Western blot结果一致，后者显示在同一时间点，腹侧中脑的TH蛋白水平逐渐降低（图2E）。完整的Western blot图像见图S1A。在通过注射部位的矢状脑切片中，可以在3 MPI时检测到pS129 α-突触核蛋白的免疫反应性，在注射部位周围形成了一个明显的核心。到6 MPI时，p-α-突触核蛋白的强度和分布显著增加，表明病理性的α-突触核蛋白逐渐积累和扩散（图2A,D）。总体而言，脑纹状体PFF注射导致多巴胺能末梢和细胞体的进行性退化，并且在6个月的时间里病理性的α-突触核蛋白水平逐渐升高。
3.3 PFF注射后3个月视觉通路电生理功能障碍出现，并在6个月时伴随深度感知缺陷恶化
为了确定PFF小鼠模型中视觉缺陷是否以及何时出现，我们在注射后3个月和6个月（3 MPI和6 MPI）使用电生理和行为评估方法评估了视觉功能。记录了针对黑白棋盘图案刺激的模式反转视觉诱发电位（PVEPs），使用P100潜伏期和幅度来评估从视网膜神经节细胞（RGCs）到视觉皮层（VC）的信号传输完整性（Batum等人，2022年；Tran等人，2023年）。早在3 MPI时，PFF注射小鼠就表现出P100潜伏期的显著延迟和幅度的减少，表明视觉通路的功能受损。这些异常在6 MPI时进一步恶化（图3A,D,E）。使用视觉悬崖测试评估深度感知，其中棋盘图案位于透明平台下方以创建深度错觉（Wang等人，2023年；Ji等人，2022年）。在3 MPI时，PFF注射小鼠在平台上“深”侧停留的时间与对照组没有差异。然而，在6 MPI时，它们表现出深度偏好的显著减少，这与深度感知受损一致（图3B,C）。这些结果表明，尽管PFF注射小鼠在运动症状出现之前没有明显的视觉行为缺陷，但视觉通路中的电生理异常和功能损害已经存在。
3.3 视觉通路功能障碍在PFF注射小鼠中先于视网膜结构损失出现
为了确定PFF小鼠模型中视觉缺陷是否以及何时出现，我们在注射后3个月和6个月（3 MPI和6 MPI）使用电生理和行为评估方法评估了视觉功能。记录了模式反转视觉诱发电位（PVEPs），以响应交替的黑白棋盘图案刺激，使用P100潜伏期和幅度来评估从视网膜神经节细胞（RGCs）到视觉皮层（VC）的信号传输完整性（Batum等人，2022年；Tran等人，2023年）。早在3 MPI时，PFF注射小鼠就表现出P100潜伏期的显著延迟和幅度的减少，表明视觉通路的功能受损。这些异常在6 MPI时进一步恶化（图3A,D,E）。使用视觉悬崖测试评估深度感知，其中棋盘图案位于透明平台下方以创建深度错觉（Wang等人，2023年；Ji等人，2022年）。在3 MPI时，PFF注射小鼠在平台上“深”侧停留的时间与对照组没有差异。然而，在6 MPI时，它们表现出深度偏好的显著减少，这与深度感知受损一致（图3B,C）。这些结果表明，尽管PFF注射小鼠在运动症状出现之前没有明显的视觉行为缺陷，但视觉通路中的电生理异常和功能损害已经存在。
3.4 PFF注射小鼠的视网膜中病理性α-突触核蛋白的积累，并随着疾病严重程度的增加而逐渐增加
为了表征PD小鼠模型中视网膜的α-突触核蛋白病理变化，我们在注射后3个月和6个月（3 MPI和6 MPI）进行了Western blot和免疫荧光染色，以评估p-α-突触核蛋白的水平，并与PBS注射的对照组进行比较。Western blot分析显示，在3 MPI时，视网膜裂解物中可以检测到p-α-突触核蛋白的表达，在6 MPI时表达量显著增加（图4B,C）。完整的Western blot图像见图S1B。免疫荧光染色显示，在3 MPI时，GCL中存在p-α-突触核蛋白阳性包涵体，在INL和内丛状层（IPL）中也观察到p-α-突触核蛋白阳性点。这些特征在6 MPI时变得更加明显，荧光强度增加，分布范围更广（图4A,E）。在RGC层中，pSer129阳性信号与NeuN标记的神经元核共定位，表明可能存在核内或核周的p-α-突触核蛋白病理积累（图4A）。
3.4 PFF注射小鼠的视网膜中病理性α-突触核蛋白的积累，并随着疾病严重程度的增加而逐渐增加
为了表征PD小鼠模型中视网膜的α-突触核蛋白病理变化，我们在注射后3个月和6个月（3 MPI和6 MPI）进行了Western blot和免疫荧光染色，以评估p-α-突触核蛋白的水平，并与PBS注射的对照组进行比较。Western blot分析显示，在3 MPI时，视网膜裂解物中可以检测到p-α-突触核蛋白的表达，在6 MPI时表达量显著增加（图4B,C）。完整的Western blot图像见图S1B。免疫荧光染色显示，在3 MPI时，GCL中存在p-α-突触核蛋白阳性包涵体，在INL和内丛状层（IPL）中也观察到p-α-突触核蛋白阳性点。这些特征在6 MPI时变得更加明显，荧光强度增加，分布范围更广（图4A,E）。在RGC层中，pSer129阳性信号与NeuN标记的神经元核共定位，表明可能存在核内或核周的p-α-突触核蛋白病理积累（图4A）。
3.5 PFF注射小鼠的视网膜中TH的表达减少
为了研究α-突触核蛋白PFF模型中视网膜TH的表达和TH阳性无长突触细胞是否受到影响，我们在注射后3个月和6个月对视网膜进行了Western blot和免疫荧光分析。Western blot结果显示，PFF注射小鼠的视网膜中TH蛋白表达逐渐减少（图5A,C）。完整的Western blot图像见图S1C。免疫荧光染色显示，在3 MPI时，TH阳性无长突触细胞的树突分支延伸到INL和IPL之间的边界。在3 MPI时，TH免疫反应性减少，而在6 MPI时这种减少更为明显（图5B,D），这与Western blot数据一致。
3.5 PFF注射小鼠的视网膜中TH表达减少
为了研究α-突触核蛋白PFF模型中视网膜TH的表达和TH阳性无长突触细胞是否受到影响，我们在注射后3个月和6个月对视网膜进行了Western blot和免疫荧光分析。Western blot结果显示，PFF注射小鼠的视网膜中TH蛋白表达逐渐减少（图5A,C）。完整的Western blot图像见图S1C。免疫荧光染色显示，TH阳性无长突触细胞的树突分支延伸到INL和IPL之间的边界。在3 MPI时，TH免疫反应性减少，而在6 MPI时这种减少更为明显（图5B,D），这与Western blot数据一致。
3.6 PFF注射小鼠的视网膜中小胶质细胞激活和短暂的小胶质细胞反应性
为了研究PD模型小鼠视网膜中的小胶质细胞变化，我们进行了Iba1免疫荧光染色。小胶质细胞主要分布在GCL、IPL和外丛状层（OPL）中。注射后3个月（3 MPI），小胶质细胞表现出明显的激活迹象，包括细胞体增大和视网膜各层中的细胞数量增加。这种反应性特征在注射后6个月（6 MPI）仍然存在，并伴随着Iba1荧光强度的逐渐增加（图6A–C），表明小胶质细胞的增殖和激活可能参与了PFF模型中的视网膜病理变化。图6：在图查看器或PowerPoint中打开
α-突触核蛋白（α-syn）颗粒注射小鼠视网膜中的小胶质细胞激活和短暂性Müller胶质细胞反应性。(A) 代表性的Iba1免疫荧光图像显示不同视网膜层中的小胶质细胞分布。(B) 各组Iba1荧光强度的量化。(C) 每组中小胶质细胞计数的量化。(D) 代表性的GFAP免疫荧光图像显示不同视网膜区域中的Müller细胞反应性。(E) 各组中小胶质细胞胞体直径的量化。(F) 视网膜中GFAP荧光强度的量化。数据以平均值±标准误（SEM）表示。组别规模：PBS组，n = 6；PFF-3MPI组，n = 6；PFF-6MPI组，n = 6。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；单因素方差分析。GCL：神经节细胞层；INL：内核层；IPL：内丛层；ONL：外核层；OPL：外丛层。Müller细胞是一种特化的视网膜胶质细胞，为神经元提供代谢和结构支持，在病理条件下发挥保护和再生作用（Thiel等人，2022年）。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是大脑星形胶质细胞的典型标志物，在视网膜星形胶质细胞以及受刺激或损伤的Müller细胞中也有表达——尤其是在其末端足部。在生理条件下，GFAP在Müller细胞中的表达量很低，但病理刺激会使其上调，使GFAP成为Müller细胞胶质增生的可靠指标。GFAP免疫荧光染色显示PFF注射小鼠视网膜中的Müller细胞出现短暂性激活。在3个月时，GCL中的GFAP表达显著增加，延伸至IPL和INL的染色也增强（图6D,F）。然而，到6个月时，GFAP水平恢复到接近对照水平，表明在PFF模型中Müller细胞对视网膜压力的反应是早期且短暂的。
3.7 在PFF注射后3个月，在视觉皮质（VC）中检测到α-突触核蛋白病理变化
为了确定在我们的PFF诱导的帕金森病（PD）小鼠模型中，突触核蛋白病变是否超出视网膜范围，我们通过免疫荧光染色检查了视觉通路多个组成部分中的p-α-syn积累情况，包括外核（ON）、视交叉（OC）、外膝状体（OT）、外侧膝状体（LGN）、上丘（superior colliculus）和视觉皮质（VC）。令人惊讶的是，p-α-syn免疫反应性仅在PFF注射小鼠的VC中检测到。注射后3个月，p-α-syn阳性信号已在VC中显现，并在6个月时更加明显（图7A,B）。与神经元标志物MAP2的共免疫染色显示p-α-syn与神经元胞体的明确共定位（图7C）。
3.8 在PFF注射小鼠的视觉联合皮质（visual association cortices）中积累病理性的p-α-突触核蛋白
为了评估突触核蛋白病变是否扩展到前额皮质（PC）、顶叶皮质（frontal cortex）、海马体（hippocampus）、颞叶联合皮质（TeA）和杏仁核（amygdala），我们使用了p-α-突触核蛋白的免疫荧光染色。注射后3个月（3 MPI），p-α-突触核蛋白免疫反应性已在前额、顶叶和颞叶联合皮质以及杏仁核中检测到。这些信号在注射后6个月（6 MPI）显著增强，荧光强度的定量分析证实了这一点（图8A,B）。
4. 讨论
在这项研究中，我们通过向纹状体内部注射α-突触核蛋白颗粒（α-syn PFFs）在野生型C57BL/6J小鼠中建立了一个散发性PD模型，该模型模拟了非毒素诱导的特发性PD。我们全面评估了视觉功能、视觉电生理学、视网膜病理学以及视觉通路中的病理α-突触核蛋白沉积情况，包括在无症状期（注射后3个月）和症状期（注射后6个月）。我们的发现表明，视觉系统的功能障碍在运动缺陷出现之前就已经显现，例如模式反转视觉诱发电位（VEPs）的改变，其特征是P100潜伏期延长和幅度降低。这些电生理异常伴随着视网膜的早期病理变化，包括p-α-突触核蛋白积累、总α-突触核蛋白水平升高、TH表达减少和小胶质细胞激活。值得注意的是，这些变化在注射后6个月变得更加明显，而在此时间点之前任何视网膜层均未观察到显著的神经元丢失。在主要视觉通路中，除了视网膜外，早在注射后3个月就在VC中检测到了p-α-突触核蛋白免疫反应性。有趣的是，在ON、OC、OT、LGN或上丘中未观察到病理性的α-突触核蛋白积累。此外，在3个月时，在参与高级视觉处理的视觉联合区域，包括前额、顶叶和颞叶联合皮质以及杏仁核中也观察到了α-突触核蛋白沉积。视觉障碍是PD的一种常见非运动表现，对日常活动产生负面影响，并导致自我效能感和整体生活质量下降（Weil等人，2016年；Hamedani等人，2020年）。近年来，人们对PD中视觉通路的结构和功能改变给予了越来越多的关注。Hasanov等人（2019年）的一项前瞻性纵向研究表明，早期PD患者的P100波潜伏期显著延长且幅度降低。Sipos-Lascu等人（2024年）对59名PD患者进行的横断面研究验证了VEP P100潜伏期与运动症状严重程度之间的相关性。Aras等人（2014年）在MPTP诱导的PD小鼠模型中观察到P100潜伏期延长。虽然该模型显示SN中的DNs显著丢失、caspase-3活性增加、亚硝酸盐/硝酸盐水平升高以及4-羟基壬烯醛（4-HNE）积累，但这些病理变化在视网膜中未检测到。7-硝基吲唑（7-NI）和S-甲基异硫脲（SMT）的治疗部分逆转了这些效应，表明VEP异常可能反映了上游多巴胺能神经元的退化和氧化应激引起的脂质过氧化。同样，Østergaard等人（2020年）报告在单侧纹状体内注射α-突触核蛋白后的大鼠疾病晚期观察到VEP潜伏期延迟。值得注意的是，在人类中，α-突触核蛋白在同侧STR和上丘中被检测到，而VEP变化发生在蛋白质沉积之后。这种延迟可能归因于下游效应，如α-突触核蛋白的翻译后修饰（例如磷酸化或聚集）。由于实际和伦理限制，在临床人群中评估PD前驱期的VEP变化仍然具有挑战性，VEP在早期诊断中的实用性仍不清楚。动物模型为研究视觉系统的早期电生理和病理变化提供了一个有价值的平台。α-突触核蛋白颗粒模型忠实地再现了PD的关键病理特征，并在模拟慢性、类似特发性的进展和α-突触核蛋白的朊病毒样传播方面具有独特优势。在当前研究中，我们应用了纹状体内注射α-突触核蛋白颗粒模型来探索视觉系统的电生理和病理变化。通过使用注射后3个月和6个月的时间点，我们分别代表了PD的前驱期和症状期，从而为研究早期视觉功能障碍提供了最佳框架。我们的发现表明，视觉通路中的亚临床变化早在前驱期就已经出现，VEPs作为检测这些早期异常的敏感工具。此外，VEP变化在症状期更为明显，这与先前的临床研究一致，表明VEP参数与疾病进展相关。总体而言，我们的发现强调VEPs可能作为识别与PD相关的早期视觉缺陷的敏感工具。尽管如此，仍需要进一步的研究来验证其诊断特异性并探索其在临床环境中的适用性。α-突触核蛋白的异常积累是PD的一个定义性病理特征，导致SNc中DNs的进行性退化。除了中枢神经系统外，PD患者的视网膜中也发现了α-突触核蛋白病理变化。Bodis-Wollner等人（2014年）首次报告了视网膜中的α-突触核蛋白改变，包括INL中的细胞内Lewy小体（LB）样聚集物、IPL中的弥漫性α-突触核蛋白沉积以及GCL中的细胞质α-突触核蛋白阳性包含物（Armstrong 2017年）。随后，Beach等人（2014年）使用免疫组化染色在RNFL、GCL和内IPL中检测到p-α-突触核蛋白。当前的研究一致表明，RGCs和DACs在PD中特别容易受到突触核蛋白病变的影响（Beach等人，2014年；Ortuño-Lizarán等人，2018年；Bodis-Wollner等人，2014年；Ho等人，2014年）。在经典的神经毒素诱导的PD模型中，只有Normando等人（2016年）报告的罗腾酮（rotenone）诱导的小鼠模型显示视网膜中的弥漫性α-突触核蛋白免疫反应性。在转基因模型中，Veys等人（2019年）在（Thy-1）h[A30P] α-突触核蛋白转基因小鼠的GCL和INL细胞体以及IPL内的树突中显示了p-α-突触核蛋白免疫阳性。然而，不同模型中视网膜p-α-突触核蛋白表达的空间模式存在差异。例如，Mammadova等人（2019年）通过将老年TgM83小鼠的脑匀浆注射到年轻的（2个月大的）TgM83受体中加速了视网膜α-突触核蛋白病理变化。他们发现在8个月时视网膜α-突触核蛋白显著增加，pSer129阳性免疫反应性出现在光感受器外段、ONL、OPL和INL（Beach等人，2014年）。同样，Tran等人（2023年）在A53T纯合α-突触核蛋白转基因小鼠的ONL、OPL和光感受器层中报告了pSer129表达，与野生型对照组相比。在我们的模型中，PD前驱期就已经在视网膜中检测到p-α-突触核蛋白免疫反应性。pSer129阳性信号与视网膜GCL中的NeuN标记神经元共定位（图4A）。NeuN是成熟的神经元的公认标志物，主要表达在细胞核中，并在核周细胞质中也有分布。因此，pSer129与NeuN的共定位表明这些信号与RGC的核或核周区室相关，尽管仅通过常规共聚焦显微镜无法确定其精确的亚细胞定位。α-突触核蛋白的核定位已在PD动物模型和PD患者的尸检脑组织中报告（Mason等人，2016年；Mason等人，2019年；Horan-Portelance等人，2026年；Ermini等人，2024年）。核周pSer129的积累被认为反映了错误折叠蛋白质向微管组织中心附近的聚集体的动态运输。这种核周定位的功能意义尚不清楚，但它可能代表了包含体形成的早期阶段或细胞对蛋白质稳态压力的反应（Dinter等人，2020年；Mansuri等人，2024年）。尽管在某些实验设置中报告了pSer129的核定位（Koss等人，2022年；Millett等人，2025年），但我们对这一发现持谨慎态度。直接证明核内pSer129的存在需要使用高分辨率成像和正交视图或与核标记物（如DAPI或Hoechst）的共染色，而这在特定图像中不可用。因此，我们将我们的观察描述为核周或核周相关性的pSer129积累，并指出未来使用更高分辨率的共聚焦显微镜和适当的核染色将有助于澄清视网膜神经元中pSer129的精确亚细胞分布。此外，在某些INL细胞的细胞质和整个IPL中观察到点状p-α-突触核蛋白染色，这些变化在运动症状出现后变得更加明显。此外，与对照组相比，PFF注射小鼠的GCL、INL和IPL层中的总α-突触核蛋白水平显著增加，表明外源性PFFs的“播种”活动可能诱导了内源性α-突触核蛋白的病理积累。这些发现突显了RGCs对α-突触核蛋白病变的高度脆弱性。由于RGCs的轴突汇聚形成ON，它们的完整性对于视觉信号的传递至关重要。视网膜内层（INL）由双相细胞（DACs）、水平细胞（horizontal cells）和穆勒胶质细胞（Müller glia）的细胞体组成，而视网膜外层（IPL）则由这些神经元以及视网膜神经节细胞（RGCs）的突触末端和树突过程构成。这些层参与了视觉信号的整合、神经再生和免疫调节（Østergaard等人，2020年）。p-α-突触核蛋白（p-α-syn）的积累可能导致细胞毒性效应，如路易小体的形成、蛋白酶体和自噬途径的损伤、细胞内运输的紊乱以及线粒体功能障碍，最终导致神经元功能障碍或死亡（Beach等人，2014年；Ho等人，2014年）。我们PFF模型中p-α-突触核蛋白的视网膜分布与帕金森病（PD）患者视网膜中的几项关键病理研究结果一致（Volpicelli-Daley等人，2014年；Beach等人，2014年），这支持了其作为视网膜突触核蛋白病代表性模型的有效性。不同动物模型中p-α-突触核蛋白定位的差异可能反映了与遗传背景相关的不同病理机制，因为上述许多模型涉及突变α-突触核蛋白的转基因表达。Ortuno-Lizaràn等人（2018年）报告称，PD患者视网膜和大脑中p-α-突触核蛋白的密度呈正相关，这与运动严重程度和疾病阶段相关，表明视网膜可能作为PD的潜在生物标志物（Beach等人，2014年）。在我们的研究中，我们不仅观察到随着疾病进展视网膜p-α-突触核蛋白表达的增加，还在前运动阶段就检测到了它的存在。这些发现表明，视网膜中病理性的α-突触核蛋白沉积不仅可能是追踪疾病进展的宝贵标志物，也可能用于早期诊断。因此，未来探索非侵入性体内可视化视网膜病理α-突触核蛋白的研究具有重要的临床意义。例如，使用荧光标记的p-α-突触核蛋白抗体结合对比剂进行视网膜成像可能是一种有前景的策略，尽管其可行性仍需通过进一步研究来验证。除了α-突触核蛋白病理变化外，我们还检测到了其他类似PD典型脑部病理的变化，如多巴胺（TH）表达减少和小胶质细胞激活。值得注意的是，这些变化在运动缺陷出现之前就已经存在，并且随着疾病进展而变得更加明显。这些观察结果强调了视网膜作为早期PD检测和纵向监测的非侵入性和易于获取的部位的潜力。由于视网膜起源于神经外胚层，它通常被称为“通往大脑的窗口”。与这一观点一致，在PD、阿尔茨海默病（AD）和其他神经退行性疾病中已经记录了特定的视网膜异常（Guo等人，2018年）。在我们的模型中，在GCL（内层颗粒层）、IPL（内层色素层）和INL（内层）中观察到了显著的pSer129阳性信号。已知pSer129病理变化会激活小胶质细胞并引发慢性炎症反应，这可能导致神经元功能障碍和死亡。持续的炎症还可能损害小胶质细胞的自噬和吞噬功能，进一步加剧α-突触核蛋白病理（Scheiblich等人，2021年；Lv等人，2023年；Wang等人，2021年）。在MPTP诱导的PD模型中，视网膜中的双相细胞减少，伴随视网膜多巴胺水平下降和多巴胺依赖性反馈回路减慢（Tran等人，2022年；Huang和Yin，2011年），但没有报告突触核蛋白病理变化。尽管一些转基因模型，如Plp-α-突触核蛋白小鼠（Kaehler等人，2020年）、Thy1-h[A30P] α-突触核蛋白小鼠（Veys等人，2021年）和TgM83接种模型（Mammadova等人，2019年）显示了α-突触核蛋白的积累和色素视网膜神经节细胞的退化，但p-α-突触核蛋白的定位往往与PD患者的不同。这限制了它们在没有基因突变的情况下复制散发性PD的能力。最近，Pérez-Acuña等人（2023年）显示，在玻璃体内注射小鼠来源的α-突触核蛋白PFFs后2个月，视网膜中的TH表达减少。他们还观察到视网膜p-α-突触核蛋白聚集、神经纤维丢失和视网膜变薄；然而，他们没有评估该模型中的视觉功能。总的来说，我们的模型不仅再现了PD视网膜中关键的病理特征，还能够在前驱阶段进行功能和病理监测。重要的是，在最初的6个月内我们没有观察到显著的视网膜神经元丢失。仅在由神经节细胞和光感受器细胞体组成的后GCL（内层颗粒层）和ONL（外层色素层）中注意到细胞数量略微减少的趋势。这表明，在该模型中，明显的视网膜细胞丢失可能发生在疾病的中间到晚期阶段。此外，在PFF注射后3个月，视网膜中的穆勒胶质细胞出现了短暂激活。穆勒细胞是视网膜中的主要巨噬细胞类型，与几乎所有类型的视网膜神经元相互作用，发挥着重要的代谢和支持作用。它们通过吸收和回收神经递质以及释放神经活性物质来调节神经元兴奋性。在各种光感受器或视网膜神经节细胞损伤模型中，移植的穆勒胶质细胞已被证明可以分泌神经保护因子，促进受损神经元的修复和存活，从而部分恢复视觉功能（Eastlake等人，2021年）。在适当的刺激下，穆勒细胞可能发生去分化，并表现出向其他神经元表型转分化的能力，包括多巴胺能细胞（da Silva等人，2019年）。这些细胞能够合成多巴胺并将其释放到细胞外基质中。在一个涉及移植纹状体穆勒细胞的小鼠模型中，观察到这些细胞补充了多巴胺，表明它们有可能改善多巴胺能缺陷（Stutz等人，2014年）。尽管PD背景下穆勒细胞激活和增殖的特异性仍有待完全阐明，但它们的神经再生潜力为替代治疗策略提供了有希望的途径（Zhou等人，2020年）。除了视网膜，视觉通路的其他组成部分和视觉关联皮层也参与了视觉信息的感知、传输和处理。视觉通路是视觉信息传输的基本神经基础。在视网膜进行初步处理后，视觉信号通过ON（外层神经纤维）传输。鼻侧视网膜纤维在OC（中央凹）交叉，与未交叉的颞侧纤维合并形成OT（外层视束）。这些纤维中的大多数投射到LGN（外侧膝状体），然后投射到VC（视觉皮质），完成初级视觉传输。一小部分纤维投射到上丘和前顶盖区，这些区域参与瞳孔光反射（Heermann，2017年）。在初级VC中处理的视觉信息进一步沿着两个平行流进行整合和分配：腹侧流和背侧流。腹侧流主要参与物体识别和空间感知，包括Hip（下丘）和杏仁核等区域。背侧流处理运动和空间定位，包括颞顶叶联合皮层、顶叶和额叶等区域（Li等人，2023年）。这些皮层区域的病变或它们网络连接的紊乱与高级视觉障碍有关，如视觉空间缺陷和视觉幻觉（Volpicelli-Daley等人，2014年；Nishio等人，2018年）。最近使用功能性MRI和18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）对PD患者进行的神经影像学研究揭示了不仅在初级视觉通路（包括VC、视辐射、LGN和OC）中，而且在更广泛的视觉关联皮层中也存在结构和功能改变（Li等人，2023年；Haug等人，1994年；Arrigo等人，2017年）。此外，关键视觉关联网络之间的功能连接异常也有记录（Baik等人，2024年；Nishio等人，2018年；Yao等人，2014年；Liu等人，2023年；Marques等人，2022年；Erramuzpe等人，2025年），表明PD相关的视觉障碍是多因素的。在我们的研究中，我们在PFF注射后3个月就在VC、顶叶、额叶和杏仁核中检测到了p-α-突触核蛋白的免疫反应性。这种免疫反应性在6个月时显著增加，与VEP（视觉诱发电位）变化的趋势一致。值得注意的是，视觉深度感知异常和运动缺陷仅在6个月时观察到。这些发现表明，视觉通路的功能和病理变化先于明显的视觉症状和运动功能障碍的出现。总体而言，我们的结果支持视网膜和中枢视觉结构可能共同促进PD中视觉缺陷发展的假设。在我们的研究中，纹状体注射α-突触核蛋白PFFs成功地在STR（纹状体）、大脑皮层和杏仁核中诱导了p-α-突触核蛋白的积累。值得注意的是，视网膜中也观察到了早期病理变化，包括p-α-突触核蛋白表达增加和总α-突触核蛋白水平升高，这表明病理性的α-突触核蛋白可能从大脑传播到视网膜。已知α-突触核蛋白聚集体可以通过多种机制传播，包括类似朊病毒的传播（Beach等人，2014年；Irwin等人，2013年；Song和Li，2025年）、隧道纳米管介导的运输（Chakraborty等人，2023年；Duan等人，2023年）和外泌体介导的转移（Xia等人，2019年；Guo等人，2020年）。STR与额叶/顶叶皮层之间的解剖学接近性以及它们与皮层和边缘结构（如杏仁核）的广泛神经连接可能促进了α-突触核蛋白通过神经投射或类似朊病毒的机制进行传播。然而，当前的研究没有直接探讨α-突触核蛋白病理从大脑传播到视网膜的机制途径，这需要进一步研究。Cao等人（2024年）最近使用免疫荧光3D成像和基于cisterna magna的立体定向示踪剂传递技术，探索了AD患者和5×FAD小鼠中β-淀粉样蛋白（Aβ）从大脑到眼睛的传输。他们确定了三条主要的从大脑到眼睛的Aβ传输途径：ON鞘-淋巴途径、轴突间空间途径和沿动脉的血管周围空间途径。此外，他们证明水通道蛋白-4（AQP4）调节从大脑到眼睛的传输和视网膜淋巴清除Aβ，从而调节眼部Aβ沉积和相关病理（Cao等人，2024年）。在我们的PFF诱导的PD小鼠模型中，视网膜α-突触核蛋白病理在注射后3个月就已经明显。到6个月时，虽然VC中观察到病理性的α-突触核蛋白积累，但在视觉通路的其他主要组成部分（如ON、OC、OT、LGN或上丘）中没有检测到p-α-突触核蛋白的免疫阳性信号。这限制了沿视觉通路逆向传播α-突触核蛋白的证据。体液传输是否有助于病理向视网膜的传播仍不确定，值得未来探索。了解α-突触核蛋白从大脑到视网膜的传播途径可能为PD的非运动症状的发病机制提供新的见解，并揭示潜在的治疗靶点。应承认这项研究的几个局限性。首先，如开放场和深度感知任务等行为测试对焦虑状态敏感，观察到的中心区域探索和总距离减少可能部分反映了焦虑的增加，而不仅仅是纯粹的运动或感觉缺陷。尽管如此，这项研究的主要发现仍然成立：在注射后3个月，已经明显出现了显著的PVEP异常和视网膜病理变化，而此时没有检测到其他行为缺陷，除了类似抑郁的行为。这种时间上的分离表明，视觉电生理和病理损伤先于明显的行为表现，无论6个月时观察到的行为结果中运动缺陷、感觉损伤或焦虑的相对贡献如何。其次，pSer129免疫反应性本身并不能明确指示淀粉样蛋白聚集体的存在；需要额外的标志物（例如Thioflavin S、泛素、p62）来确认α-突触核蛋白包含物的聚集性质。然而，在我们的实验中，在相同条件下，PBS注射的对照组中没有观察到特定的染色，这支持了信号的特殊性。第三，TH表达的下调可能反映了实际的神经纤维丢失或存活神经元中TH表达的下调。在当前的研究中，我们没有区分这两种可能性。未来使用泛神经元标记物（例如NeuN）或Nissl染色将是必要的，以确定观察到的TH+信号减少是否对应于不可逆的神经元退化或可逆的表型下调。在α-突触核蛋白PFF诱导的纹状体注射小鼠模型中，我们观察到了显著的视觉电生理异常、视网膜中TH表达的下调以及在小运动缺陷出现之前的小胶质细胞和穆勒胶质细胞的激活。此外，在视网膜、VC和视觉关联皮层中也检测到了病理性的p-α-突触核蛋白积累。这些发现表明，在PD的前驱阶段，视觉通路的功能和病理变化已经存在，这表明评估视觉通路功能障碍和α-突触核蛋白病理可能对早期辅助诊断具有潜在价值。此外，视网膜和中枢结构在视觉功能障碍中的共同作用突显了眼睛和大脑在帕金森病（PD）发病机制中的相互作用。该模型不仅成功再现了帕金森病的运动症状，还包含了其典型的病理特征，如进行性的α-突触核蛋白病和神经元丢失，因此成为研究慢性、散发性帕金森病相关视觉通路改变的宝贵工具。
作者贡献：
秦 张：概念构思
钱 新怡：概念构思
彭 塔奥：概念构思
侯 小欧：概念构思
马 真媛：概念构思
黄 江：概念构思
胡 立芳：概念构思
罗 威锋：概念构思
致谢：
作者无需要报告的内容。
资金支持：
本研究得到了苏州大学第二附属医院神经疾病临床研究中心基金项目（ND2022B06）、苏州市科技发展计划项目（SKY2022157）、苏州市健康信息与医疗大数据协会项目（MIA202401）以及苏州大学第二附属医院学科建设支持项目（XKTJ-XK202412）的资助。
伦理声明：
所有实验程序均遵循ARVO关于眼科和视觉研究中动物使用的声明，并获得了苏州大学机构动物护理和使用委员会的批准。
利益冲突：
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明：
所有支持本研究结果的数据均可根据合理请求向通讯作者获取。
打赏
