应婷关|庆月李|胜浩志|小婷倪|徐王
南京中医药大学第一临床医学院，中国江苏省南京市210023
**摘要**
背景：唐芝清汤（TZQD）是一种用于治疗糖尿病的专利中药配方，已被证明能够改善认知功能。然而，肠道-大脑轴与TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路之间的精确机制仍有待阐明。
目的：本研究探讨TZQD对2型糖尿病（T2DM）小鼠的神经保护作用，并探索其机制是否涉及调节肠道微生物群和抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎症通路。
方法：使用UPLC-Q-TOF-MS/MS和网络药理学方法确定TZQD的活性成分和治疗靶点。在T2DM小鼠中连续8周给予不同剂量的TZQD或二甲双胍后，进行行为测试、组织染色、免疫荧光、ELISA、16S rDNA测序、短链脂肪酸（SCFA）测定和Western blot分析。此外，还进行了粪便微生物群移植（FMT）研究，以验证TZQD在改善糖尿病认知功能障碍（DCD）中的作用。
结果：TZQD显著改善了学习和记忆能力，降低了空腹血糖，并恢复了肠道微生物群平衡和SCFA水平。此外，TZQD治疗还减轻了全身和神经炎症，并修复了肠/血脑屏障损伤。这些效应与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路有关。值得注意的是，来自TZQD处理小鼠的FMT复制了这些保护作用，证实了肠道微生物群的关键作用。
结论：TZQD通过调节肠道-大脑轴和抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路来缓解DCD，显示出作为糖尿病并发症治疗策略的潜力。
**1. 引言**
糖尿病（DM）是认知功能障碍的主要风险因素，两者之间存在密切关联和共同的病理机制。慢性高血糖会加速从轻度认知障碍发展为痴呆（Xue等人，2019年），一些研究人员将阿尔茨海默病（AD）称为“特定于大脑的糖尿病”或3型糖尿病（Chapple等人，2025年；Kandimalla等人，2017年；Michailidis等人，2022年）。T2DM患者比非糖尿病患者有更高的认知衰退和痴呆风险（Dove等人，2021年；Ortiz等人，2022年）。一项研究发现，T2DM患者的大脑灰质萎缩速度比健康人快约26%±14%（Antal等人，2022年）。1999年至2019年间，美国老年T2DM患者的AD相关死亡人数急剧增加（Waqas等人，2025年）。T2DM引起的认知功能障碍已成为影响患者生活质量并增加社会和医疗负担的关键问题（Li等人，2025年），这突显出有效干预措施的迫切需求。
T2DM引起的认知功能障碍的病理生理机制非常复杂，炎症起着关键作用。T2DM引起的代谢紊乱可激活NLRP3炎性小体，诱导NF-κB核转位，并促进促炎蛋白的转录，从而激活TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路。这种持续的炎症物质产生会加速神经退行性疾病的进展，包括白细胞介素-1β（IL-1β），导致神经炎症、神经元损伤、突触功能障碍和神经递质失衡（Li等人，2021年）。因此，调节TLR4/NF-κB/NLRP3通路对于维持神经系统稳态至关重要。
作为人体的一个大型“微生物器官”，肠道微生物群参与调节身体的许多生理功能（Howard等人，2022年；Liu等人，2021年）。研究表明，调节肠道微生物群及其代谢物（如SCFA）可以激活IRS1/Akt和ERK/CREB/BDNF神经营养信号通路，抑制NF-κB/JNK炎症通路，调节微生物群-肠道-大脑轴，改善胰岛素抵抗（IR）和海马体突触超微结构，促进海马体线粒体生成和能量代谢，并改善糖尿病小鼠的认知功能（Liu等人，2020年）。SCFA缺乏会损害迷走神经功能，降低海马体突触素表达，并在1型糖尿病小鼠中引起学习和记忆缺陷（Zheng等人，2021年）。调节肠道微生物群，特别是补充SCFA，可以改善大鼠的肠道蠕动和屏障功能，并减少神经炎症（Xiao等人，2022年）。因此，调节微生物群-肠道-大脑轴是一种有望提高认知表现和减少DCD的方法。
TZQD是由教授（CN101829271A）开发的一种经验性配方，包含5种中药： Siberian Polygonatum（黄精）、Lycium barbarum（枸杞籽）、Euonymus alatus（鬼箭叶）、Lycopus lucidus（泽兰）和Beauveria bassiana（嫦娥菌）。Siberian Polygonatum具有抗炎作用，可降低肠道通透性，调节肠道微生物群组成并增加SCFA含量（LI等人，2022年）。Lycium barbarum多糖能够增强肠道屏障，改变肠道微生物群，提高血液中IL-10的水平并降低IL-1β等促炎因子的水平（Lai等人，2022年；Zhou等人，2022年）。E. alatus、L. lucidus和B. bassiana均具有抗炎作用（Hou等人，2023年；Hua等人，2023年；Xu等人，2019年），B. bassiana提取物对大肠杆菌具有显著的抗菌活性（Xiang等人，2010年）。早期研究表明，TZQD可以改善胰岛素抵抗，增加SOD水平，降低小鼠体内的MDA水平，控制AMPK/mTOR通路以触发自噬，并降低海马体神经元的凋亡，同时保护HT22神经细胞免受高血糖损伤（Shi等人，2024年；Yao等人，2024年）。
本研究旨在通过探讨TZQD对学习和记忆、肠道微生物群和SCFA水平、神经炎症和肠道炎症、血脑屏障（BBB）及肠道黏膜屏障完整性的影响，以及T2DM小鼠中的TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的作用，进一步了解TZQD缓解DCD的机制。这些发现有望为DCD提供基于证据的传统中医治疗方法。
**2. 材料与方法**
2.1. TZQD的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析
TZQD的五种成分草药（Siberian Polygonatum、Lycium barbarum、Euonymus alatus、Lycopus lucidus、B. bassiana）由江苏省中医院提供。单草药提取物（10克草药：8毫升纯水）经离心后，通过0.22 μm膜过滤并储存在4°C；TZQD提取物按6:6:5:5:4的比例配制，采用相同方法制备。色谱分析在Agilent 6530 UPLC-Q-TOF-MS/MS系统上进行（SB-C18柱，2.1 × 100 mm，1.8 μm），ESI源以正/负离子模式采集质谱（m/z 100∼1700）。通过CNKI和PubMed建立五种草药的化合物库；使用Agilent Mass Hunter Workstation Software（B.10.10）和Excel匹配单草药BPC数据与TZQD目标化合物数据库。根据保留时间、分子式和MS1/MS2数据确定TZQD的化学成分。
2.2. 网络药理学靶点预测
通过UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定出的TZQD活性成分，从TCMSP中筛选出OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18的成分。将这些成分的SMILES序列输入Swiss Target Prediction进行靶点预测；通过关键词搜索从GeneCards和OMIM中检索与DCD相关的靶点。使用Venny 2.1.0获取成分-疾病靶点交集，导入STRING构建PPI网络，并通过Cytoscape 3.10进行分析。
2.3. 根据度量、介数和接近度值筛选TZQD在DCD中的核心靶点；使用DAVID进行GO和KEGG富集分析。
2.4. 动物和实验设计
SPF雄性C57BL/6J小鼠（7–8周龄，20 ± 3克，上海Slack，批号：20220004044759）适应1周后饲养在XX大学，实验获得该校IACUC批准（伦理编号：202312A081）。72只小鼠随机分为NC组（n = 12，SPF维护饲料）和HFD组（n = 60，高糖/高脂饲料：59%基础饲料，20%蔗糖，18%猪油，3%蛋黄粉（Yao等人，2024））。6周后，所有小鼠禁食12小时；HFD组小鼠接受腹腔注射STZ（100 mg/kg，Sigma，S1030），NC组小鼠接受等量缓冲液。如果注射后3天FBG≥11.1 mmol/L，则表明T2DM模型成功建立（Chang等人，2022年；Han等人，2021年；Shen等人，2023年）。HFD组中的60只小鼠中有54只（90%）成功发展为T2DM；不符合标准的6只小鼠被排除并重新分配以保持组别大小。成功建模的小鼠随机分为5个亚组（每组n = 12）：MOD（生理盐水，0.01 ml/g/d）、TZQ-L（6 g/kg/d）、TZQ-M（12 g/kg/d）、TZQ-H（24 g/kg/d）和MET（250 mg/kg/d），连续8周通过胃饲给予（图2A）。为了验证FMT的效果，60只小鼠随机分为正常饮食组（n = 30）和HFD组（n = 30）。从第7周开始，每天收集新鲜粪便，与无菌生理盐水（100 mg:1 mL）混合并离心（4°C，3000 rpm，3分钟），上层液用于胃饲（Albouery等人，2020年；Chen等人，2023年）。受体小鼠未使用抗生素预处理以避免对代谢和炎症参数的干扰；因此，FMT结果代表供体微生物群对现有菌群的叠加/竞争效应，而非完全替代。正常饮食组再分为CON组、CON-(DM)FMT组和CON-(TZQ)FMT组（每组n = 10，SPF维护饲料），分别给予相应的生理盐水、DM粪便悬浮液（200 μL/d）或TZQD粪便悬浮液；T2DM小鼠再分为DM组、TZQ组和DM-(TZQ)FMT组（每组n = 10，高糖/高脂饲料），分别给予相应的生理盐水、TZQD（12 g/kg/d）或TZQD粪便悬浮液（图7A）。
对照组（CON和DM）通过胃饲给予相同体积的生理盐水（200 μL/d），以平衡各组间的程序效应。
2.5. 体重和FBG测定
在开始给药后的0、2、4、6和8周测量体重和FBG。每次FBG测量前，小鼠可自由饮水6小时，所有检测在同一时间进行。
2.6. 行为测试
行为测试顺序为：第一天进行开放场地测试（OFT），随后进行5天的Morris水迷宫（MWM）定位训练（第2-6天），第7天进行MWM探针测试。这种顺序可最小化MWM对OFT结果的潜在影响。
2.5.1. 开放场地测试（OFT）
OFT在一个40 × 40 × 30 cm的盒子（JLBehv-LAM-4）中进行，分成16个区域（4个中心区域，12个周边区域），以评估自发活动、探索行为和类似焦虑的行为。小鼠放置在中心区域，记录5分钟内的行为，分析总行驶距离、中心区域停留时间和行驶距离。
2.5.2. Morris水迷宫（MWM）
MWM（直径120 cm，高度50 cm，水深22 cm；安徽 Zhenghua，V2.0）分为4个象限，第Ⅳ象限有一个隐藏平台（10 × 20 cm）。小鼠从每个象限的同一起点开始在水中游泳5天；记录逃生潜伏期、总游泳距离和象限表现（如果未找到平台，则记录60秒内的逃生潜伏期）。第6天移除平台；将小鼠从每个象限放入水中，并记录60秒内的总游泳距离、平台穿越次数和第Ⅳ象限停留时间。
2.6. 样本制备
最后一次给药后24小时且在行为测试前，收集每只小鼠的3–5粒新鲜粪便，并在−80°C下储存。行为测试后，小鼠禁食12小时。每组选取3只小鼠麻醉（20 μL/g，JT0781），进行心脏灌注，固定脑/结肠组织。剩余小鼠在眶内取血后处死；分离血清（4°C，3000 rpm，15分钟），海马体、结肠和内容物快速冷冻并保存在−80°C。
2.7. 组织病理学染色
固定组织后进行石蜡包埋和切片。脑切片用HE（P0040）和Nissl（甲酚蓝，P0048，Pinfei Biology）染色；结肠切片用HE和AB-PAS（S191049，Pinfei Biology）染色。在光学显微镜下观察组织病理，使用ImageJ J量化海马体Nissl小体和结肠杯状细胞。对于Nissl小体的定量，每个区域（CA1、CA3、DG）每切片随机选取五个视野，从每只小鼠的三个切片中计数，计数过程中不考虑组别分配。
2.8. 免疫荧光
脱蜡后的脑切片在室温下用EDTA（pH 6.0）进行微波抗原回收和BSA封闭，然后与一级抗体（IBA-1，CY7217，1:100；GFAP，16825-1-AP，1:100）在4°C下孵育过夜。洗涤后，切片与TYR-488和TYR-555山羊抗兔IgG（1:1000，Pinfei Biology）在室温下孵育30分钟，用PBS洗涤，用DAPI（PN0015，Pinfei Biology）进行核染色，然后在荧光显微镜下观察。
2.9. 炎症因子检测
将20毫克海马体/结肠组织在10体积的PBS中匀浆。根据制造商说明，使用ELISA试剂盒（Aifang Biology，湖南）检测小鼠血清、海马体和结肠组织中的IL-6（AF2163-A）、IL-1β（AF2040-A）和IL-10（AF2176-A）水平。
2.10. Western blot分析
组织在裂解缓冲液（RIPA:PMSF:磷酸酶抑制剂 = 100:1:1）中匀浆。离心后，收集上清液，用NanoDrop One微光谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国）测定蛋白质浓度。蛋白质通过4–12% SDS-PAGE（ET15412LGel，ACE，常州）分离，转移至0.45 μm PVDF膜（IPVH00010，Millipore，St.）上。路易斯（美国），并用快速阻断溶液封闭30分钟。一抗在4°C下与膜孵育12小时：β-actin（GB15003，1:1000，兔来源，Servicebio，武汉），ZO-1（21773-1-AP，1:10000，兔来源，Proteintech，武汉），Occludin（27260-1-AP，1:10000，兔来源，Proteintech，武汉），TLR4（66350-1-Ig，1:1000，鼠来源，Proteintech，武汉），Caspase-1（81482-1-RR，1:8000，兔来源，Proteintech，武汉），NF-κB p65（A19653，1:1000，兔来源，ABclonal，武汉），ASC（A16672，1:1000，兔来源，ABclonal，武汉）和NLRP3（ET1610-93，1:1000，兔来源，HUABIO，杭州）。用TBST洗涤后，将膜与HRP标记的二抗（ZB-2301，ZB-2305；1:5000，Zsgb-Bio）在室温下孵育1小时并轻轻摇晃。再次洗涤膜，曝光后使用ImageJ软件分析蛋白质条带的密度。
2.11. 16S rDNA高通量测序
每组随机选取6个粪便样本（NC/MOD/TZQ-M；CON/DM/DM-(TZQ)FMT）进行肠道微生物群分析。使用索引引物（F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA；R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT）通过PCR扩增总基因组DNA。纯化并定量扩增子后构建文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序（AQuBiotech，上海）。进行了α/β多样性分析和物种差异分析。
2.12. 粪便SCFA水平的测定
SCFAs通过GC-MS（Shimadzu GC2030-QP2020 NX，Agilent HP-FFAP柱）检测，每10个样本插入一个质量控制标准品（AQuBiotech，上海）。浓度以粪便湿重（μmol/g湿粪便）为单位进行归一化。
2.13. 统计分析
数据和图像使用GraphPad Prism 8、ImageJ J和Adobe Illustrator 2021处理。数据表示为平均值±标准偏差（x ± s）。使用单因素ANOVA比较多个组；P < 0.05表示统计学上显著差异，P < 0.01表示高度统计学上显著差异。
3. 结果
3.1. TZQD化学成分的鉴定
UPLC-Q-TOF-MS/MS分别在P. sibiricum、L. barbarum、E. alatus、L. lucidus和B. bassiana提取物中鉴定出57、57、135、37和49种化合物（图1A）。去除重复化合物后，建立了一个包含309种独特化合物的TZQD目标数据库。UPLC-Q-TOF-MS/MS在正/负离子模式下检测到TZQD中的592个总离子（299个正离子，293个负离子）（图1B）。通过筛选获得462个符合条件的离子和123个最终化合物（宽度≥0.08，高度>10000，面积>100000，离子>3，质量误差≤±6 ppm），包括黄酮类、苯丙素类、生物碱、萜类、氨基酸、酚酸和甾体。活性成分如咖啡酸、山柰酚、丁香树脂酚、槲皮素和黄芩素在两个或多个草药成分中被检测到。
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图1. TZQD化学成分鉴定和网络药理学分析。（A）5种草药的TICs；（B）TZQD TIC；（C）维恩图；（D）核心目标网络；（E）GO分析；（F）KEGG通路富集分析。
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图2. TZQD降低DCD小鼠的血糖，增加体重并改善认知功能。（A）实验设计；（B）FBG变化；（C）体重变化；（D）逃避潜伏期曲线；（E）MWM位置导航（D5）和空间探针测试；（F）总游泳距离（D6）；（G）目标象限停留时间（D6）；（H）平台穿越（D6）；（I-L）OFT（运动轨迹、总距离、中心停留时间、中心行驶距离）。数据表示为平均值±SEM（n = 10至12）。∗P< 0.05，∗∗P< 0.01，∗∗∗P< 0.001，∗∗∗∗P < 0.0001与NC组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001与MOD组相比。在HFD组的60只小鼠中，有54只（90%）在STZ注射后三天内发展为T2DM（FBG ≥11.1 mmol/L）；不符合标准的小鼠被排除在进一步实验之外，以保持组大小。
3.2. TZQD对DCDS的网络药理学分析
筛选出123种TZQD活性成分，发现其与DCD有539个共同靶点。将这些靶点添加到STRING中（Homo sapiens，置信度=0.7），并通过Cytoscape 3.10进行分析。筛选出程度、介数和亲密值高于平均值的78个核心靶点；排名前10的靶点是TP53、HSP90AA1、EGFR、CTNNB1、STAT3、AKT1、SRC、TNF、BCL2和HIF1A。GO和KEGG富集分析（DAVID）显示TZQD主要调节生物过程，如IκB激酶活性和G蛋白偶联的5-羟色胺受体复合体。TZQD的关键通路包括AGE-RAGE、胰岛素抵抗和TRP通道的炎症介质调节（图1C–F）。
3.3. TZQD对T2DM小鼠体重和FBG的影响
中等剂量的TZQD预防并逆转了糖尿病诱导的体重减轻。TZQD和二甲双胍都降低了FBG，在TZQ-M、TZQ-H和MET组中效果显著；中等剂量的TZQD在某些时间点表现出明显的降糖优势，显示出TZQD的显著降糖潜力（图2B和C）。
3.4. TZQD改善DCD小鼠的认知功能障碍
3.4.1. Moris水迷宫测试
第5天，NC组小鼠表现出明确的目标导向，而MOD组小鼠轨迹复杂且逃避潜伏期延长，证实了DCD模型的成功建立。第6天，NC组和所有药物处理组的总游泳距离、平台穿越次数和目标象限停留时间都比MOD组长（图2D–H），表明TZQD改善了DCD小鼠的空间学习和记忆。
3.4.2. 开场测试
MOD组小鼠在5分钟内总行驶距离、中心区域停留时间和中心区域行驶距离显著低于NC组（P < 0.01）。与MOD组相比，处理组轨迹更复杂，中心区域停留时间延长且行驶距离增加。值得注意的是，TZQ-M组表现出最显著的效果，表明TZQD促进了DCD小鼠的自发活动和探索行为（图2I–L）。
3.5. TZQD减轻DCD小鼠的海马神经元和血脑屏障损伤
HE和Nissl染色显示，与NC组相比，MOD组的海马神经元结构紊乱，细胞间空间增大，神经元层减少，形态不规则，核固缩和核碎裂。Nissl小体结构松散且数量显著减少（P < 0.01）。TZQD或二甲双胍改善了CA1和DG区域的神经元结构并增加了Nissl小体数量（P < 0.01）。TZQ-M组表现出更规则的神经元形态和更清晰的Nissl小体，效果与MET组相当或更优（图3A–E）。免疫荧光显示MOD组海马IBA-1和GFAP显著上调（P < 0.01），而TZQ-M、TZQ-H和MET组显著抑制了IBA-1和GFAP的过度表达（P < 0.01），表明TZQD防止了T2DM小鼠的海马小胶质细胞和星形胶质细胞的激活（图3F–H）。MOD组的海马ZO-1和Occludin表达显著低于NC组（P < 0.05），而TZQ-M处理显著上调了它们的水平（P < 0.05），表明TZQD减少了DCD小鼠的血脑屏障损伤（图3I–K）。
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图3. TZQD减轻DCD小鼠的海马神经元损伤和血脑屏障障碍。（A）海马HE染色（×400）；（B）海马Nissl染色（×400）；（C-E）海马CA1/CA3/DG区域的Nissl小体计数，在每只小鼠的三个切片的每个区域随机选取五个视野计数，计数过程中不考虑组别；（F-H）海马IBA-1/GFAP免疫荧光（×200）和相对表达；（I-K）海马ZO-1/OccludinWestern blot和定量。数据表示为平均值±SEM（n = 3）。∗∗∗P< 0.001，∗∗∗P < 0.0001与NC组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001与MOD组相比。
3.6. TZQD改善DCD小鼠的肠道微生物群失调
收集NC、MOD和TZQ-M组的粪便样本（n = 6）进行16S rDNA测序，生成7044个OTU（分别为3051、2052和3381个）（图4A）。MOD组的ACE和Chao1指数（肠道微生物丰富度的标志物）显著低于NC和MOD组（P < 0.01），表明T2DM小鼠存在肠道微生物群失调，并且TZQD改善了这种情况（图4B和C）。基于加权UniFrac距离的PCoA图显示NC和MOD组之间存在明显的分群，而TZQ-M组远离MOD组，表明TZQD显著改变了DCD小鼠的肠道微生物群结构（图4D）。
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图4. TZQD改善DCD小鼠的肠道微生物群失调。（A）维恩图；（B-C）ACE/Chao1指数；（D）加权UniFrac PCoA；（E-F）门水平相对丰度（前10）和差异分析；（G-H）属水平相对丰度（前10）和差异分析；（I）LEfSe分析（LDA>4）。数据表示为平均值±SEM（n = 6）。
在门水平上，超过90%的肠道微生物群由Bacteroidota、Firmicutes和Campylobacterota组成。与NC组相比，MOD组的Bacteroidota（P < 0.05）和Actinobacteriota（P < 0.01）丰度较高，但Firmicutes丰度较低（P < 0.05）。TZQD干预显著恢复了Bacteroidota和Firmicutes的丰度（P < 0.01）。在属水平上，TZQD reversing了Paucibacter、[Eubacterium]_oxidoreducens_group和其他分类单元的丰度（P < 0.05）。未培养_Bacteroidales_bacterium、Escherichia_Shigella、Alistipes和Rikenella的相对丰度下调（P < 0.05），而Prevotellaceae_Ga6A1_group和Fournierella的相对丰度上调（P < 0.05）。此外，与NC组相比，TZQ-M组有12个属的增加（例如Dubosiella）和6个属的减少（例如Alloprevotella）（P < 0.05）。这些变化表明TZQD丰富了肠道微生物群并对肠道微生态产生了显著的调控作用，与OTU和α多样性分析结果一致（图4E–H）。LEfSe分析（LDA分数>4）确定了关键的差异分类单元：未培养_Bacteroidales_bacterium（NC）、Rikenellaceae和Alistipes（MOD）、Bacteroidota、未分类_Dubosiella、uncultured_bacterium_34R1、Prevotellaceae_Ga6Al_group、Oscillospirales和Lactobacillus_acidophilus（TZQ-M）（图4I）。
3.7. TZQD提高DCD小鼠的粪便SCFA水平
粪便SCFA的定量（μmol/g湿粪便）显示MOD组的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸浓度显著低于NC组（P < 0.01）。TZQD处理上调了乙酸、丙酸、异丁酸和戊酸的浓度（P < 0.05）（图5A–K）。
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图5. TZQD上调SCFAs，减轻DCD小鼠的肠道黏膜屏障损伤。（A-K）粪便SCFA浓度；（L）结肠HE染色（×200）；（M-N）结肠AB-PAS染色（×200）和杯状细胞计数；（O-Q）结肠ZO-1/Occludin Western blot和定量。数据表示为平均值±SEM（n = 3至6）。∗∗P< 0.01，∗∗∗P< 0.001，∗∗∗P < 0.0001与NC组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001与MOD组相比。
3.8. TZQD减轻DCD小鼠的肠道黏膜屏障损伤
HE和AB-PAS染色显示，与NC组相比，T2DM小鼠的结肠结构紊乱，腺体萎缩，杯状细胞减少，隐窝变浅，黏膜下水肿和炎症细胞浸润。TZQD和二甲双胍治疗在不同程度上改善了结肠结构（图5L–N）。MOD组的结肠ZO-1和Occludin表达显著低于NC组（P < 0.01），而TZQ-L、TZQ-M和MET治疗显著上调了它们的水平（P < 0.05），表明TZQD减少了DCD小鼠的肠道屏障损伤（图5O–Q）。
3.9. TZQD降低DCD小鼠的炎症反应
MOD组的血清、海马和结肠中的IL-1β和IL-6水平显著高于NC组（P < 0.01）。TZQD和二甲双胍逆转了这些变化（P < 0.05），表明TZQD减轻了DCD小鼠的全身、神经炎症和肠道炎症（图6A–I）。
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图6. TZQD减轻炎症并抑制DCD小鼠的TLR4/NF-κB/NLRP3通路。（A-I）血清/海马/结肠IL-1β/IL-6/IL-10水平（n = 3至8）；（J-O）结肠TLR4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1/ASC Western blot和定量；（P-U）海马TLR4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1/ASC Western blot和定量。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM（n = 3）。∗P< 0.05，∗∗P< 0.01，∗∗∗P < 0.001与NC组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001与MOD组相比。
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图7. TZQD-FMT降低DCD小鼠的血糖，增加体重，改善认知功能，并减轻炎症。（A）实验设计；（B）体重变化；（C）FBG变化；（D-G）MWM（逃避潜伏期曲线、游泳轨迹、平台穿越、总距离）；（H-P）血清/海马/结肠IL-1β/IL-6/IL-10水平。数据表示为平均值±SEM（n = 3至10）。∗P< 0.05，∗∗P< 0.01，∗∗∗P < 0.001，∗∗∗P < 0.0001与CON组相比；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，####P < 0.0001与DM组相比。
3.10. TZQD抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路
MOD组在海马和结肠中的TLR4、NFTZQD-FMT可改善2型糖尿病（T2DM）小鼠的学习和记忆能力。MWM结果显示，接受TZQD-FMT处理的糖尿病小鼠的逃避潜伏期明显短于未处理的小鼠。在第6天，TZQD-FMT小鼠的总游动距离更长，平台穿越次数也更多（见图7D–G）。这些结果表明TZQD-FMT有助于提高学习和记忆能力，且肠道微生物群的调节对认知功能有积极影响。
3.13 TZQD-FMT可降低糖尿病性认知障碍（DCD）小鼠的炎症水平。与对照组相比，CON-(DM)FMT、CON-(TZQ)FMT和DM组小鼠的血清和海马区的IL-1β水平升高，而IL-10水平降低。与DM组相比，TZQD-FMT组小鼠的血清、海马区和结肠中的IL-1β/IL-6比值降低，IL-10水平升高（见图7H–P）。这些结果表明，来自DM或TZQ处理的小鼠的粪便微生物移植（FMT）在正常小鼠中会引起轻微的炎症反应，而TZQD-FMT在DCD小鼠中具有抗炎作用。
3.14 TZQD-FMT可减轻DCD小鼠的海马神经元损伤。HE染色显示，CON-(DM)FMT和CON-(TZQ)FMT组小鼠的海马神经元排列紊乱，偶尔出现髓质变性和坏死，而DM组小鼠的神经元损伤更为严重。TZQD-FMT处理显著改善了神经元损伤（见图8A）。CON-(DM)FMT组在CA1、CA3和DG区域的Nissl小体数量少于对照组（P < 0.05），而TZQD-FMT组在CA1和CA3区域的Nissl小体数量多于DM组（P < 0.01，见图8B–E）。TZQD-FMT组小鼠的海马区IBA-1和GFAP荧光强度低于DM组（P < 0.05，见图8F–H）。这些结果表明，来自DM小鼠的FMT可能在正常小鼠中引起神经元损伤，而TZQD-FMT则能保护糖尿病小鼠的海马神经元。
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图8. TZQD-FMT减轻DCD小鼠的海马神经元损伤。(A) 海马区HE染色（×400倍）；(B-E) 海马区Nissl染色（×400倍）及CA1/CA3区域的Nissl小体计数；(F-H) 海马区IBA-1/GFAP相对于表达和免疫荧光（×200倍）。数据表示为均值±SEM（n = 3）。*P< 0.05，***P< 0.01，****P< 0.001，*****P< 0.0001，与对照组相比；#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001，####P< 0.0001，与DM组相比。
3.15 TZQD-FMT可改善DCD小鼠的肠道损伤和肠道微生物群失调。结肠HE和AB-PAS染色显示，CON-(DM)FMT、CON-(TZQ)FMT和DM组小鼠的结肠结构受损，杯状细胞数量减少。与DM组相比，TZQD-FMT处理显著改善了结肠的病理变化并增加了杯状细胞数量（见图9A–C）。
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图9. TZQD-FMT减轻DCD小鼠的肠道损伤并改善肠道微生物群失调。(A-C) 结肠HE/AB-PAS染色（×200倍）及杯状细胞计数；(D) 文氏图；(E-G) ACE/Chao1/Shannon指数；(H) PCoA分析；(I-J) 门纲/属水平相对丰度（前10名）；(K-L) 门纲/属水平差异分析；(M) LEfSe分析（LDA>4）。数据表示为均值±SEM（n = 6）。
16S rDNA测序（n = 6）证实了DM小鼠的肠道微生物群失调；TZQD-FMT有效改善了失调并恢复了肠道微生物多样性。与对照组相比，DM组中Bacteroidota和不分类的Muribaculaceae家族比例升高，而Firmicutes、Cyanobacteria和Desulfobacterota家族比例降低。TZQD-FMT组中Bacteroidota、Firmicutes、Desulfobacterota、Muribaculaceae、Peptococcus和[Eubacterium]_oxidoreducens_group的丰度恢复，表明TZQD-FMT对肠道微生物多样性有积极作用（见图9D–M）。
4. 讨论
长期高血糖会导致多种系统并发症，其中DCD是T2DM常见的中枢神经系统并发症。糖尿病病程长、血糖控制不良以及微血管/大血管病变是糖尿病患者认知功能障碍的主要风险因素（Dove等人，2021；Rawlings等人，2019）。
UPLC-Q-TOF-MS/MS分析了TZQD中的123种化学成分，发现咖啡酸、槲皮素和丁香树脂醇是其中的常见活性成分。通过OB和DL筛选，TZQD的主要活性成分包括柚皮素、槲皮素、木犀草素、白花柏叶素、槲皮素、豆甾醇和迪奥斯根素。这些成分具有文献记载的神经保护、抗炎和调节肠道微生物群的作用：咖啡酸可逆转海马区的胆碱能/嘌呤能信号通路缺陷并减少NLRP3炎症小体的激活（Castro等人，2023）；槲皮素可抑制NF-κB通路，调节肠道微生物群并缓解代谢紊乱（Aa等人，2020；Yang, Chen等人，2022）；丁香树脂醇通过NRF2和SIRT1通路具有抗氧化和神经保护作用（Li等人，2023；Liu等人，2024；Zheng等人，2024）；柚皮素和槲皮素可减轻氧化应激，调节肠道微生物群并抑制小胶质细胞的激活（Han, Xu等人，2021；Rahigude等人，2012；Shabbir等人，2021）；白花柏叶素和豆甾醇可降低促炎细胞因子水平并抑制NLRP3炎症小体的激活（Jie等人，2022；Li等人，2019）；木犀草素和迪奥斯根素通过调节NF-κB通路改善糖尿病患者的认知缺陷（Fu等人，2024；Mahmoudi等人，2021）。
PPI网络分析确定了TZQD治疗DCD的核心靶点，包括与炎症相关的靶点TP53、STAT3、AKT1、TNF、MAPK3、MAPK1、SRC和JUN（Ma等人，2024）。高血糖诱导的TNF上调会触发神经炎症并激活NF-κB、MAPK和STAT3通路（Xu等人，2019），而JUN的激活会调节促炎基因表达，损害神经元微环境和功能，破坏神经递质系统，从而导致认知衰退。与细胞损伤/凋亡相关的靶点包括TP53、HSP90AA1、BCL2和HIF1A。高血糖和氧化应激会激活TP53并破坏BCL2家族，促进神经元凋亡（ZHOU等人，2024），而HIF1A的激活通过促进血管生成和糖酵解抑制凋亡。GO和KEGG富集分析显示TZQD可调节AGE-RAGE通路、胰岛素抵抗和脂质代谢，表明其通过改善代谢、抗炎和神经调节多重作用于DCD。
尽管网络药理学预测了78个核心靶点，但我们的实验验证主要集中在TLR4/NF-κB/NLRP3通路，因为该通路在KEGG富集中的中心性及其在神经炎症中的作用已被证实。我们认识到其他预测的靶点（如TP53、STAT3、AKT1）尚未得到实验验证，这是一个局限性。未来的研究应系统地研究这些靶点，以全面阐明TZQD的多重作用机制。
STZ的给药方法为单次腹腔注射100 mg/kg。研究表明，这种方法稳定、可靠且成功率较高，适用于研究各种T2DM并发症（如糖尿病神经炎症和认知障碍（Chang等人，2022；Jeong等人，2021）、糖尿病心肌病（Hu & Lin，2024）和糖尿病肾病（Han, Tang等人，2021；Shen等人，2023）的病理机制和药物干预效果。研究还表明，高血糖可导致胰腺β细胞氧化应激和炎症因子的分泌，还会引起星形胶质细胞增殖、小胶质细胞激活、血脑屏障通透性增加和血管脆弱性增强，最终导致DCD（Grizzanti等人，2018；Piatkowska-Chmiel等人，2021）。MOD小鼠表现出显著的高血糖、类似焦虑的行为、学习和记忆障碍、严重的海马神经元损伤以及海马区IBA-1/GFAP表达升高，符合DCD的病理特征。TZQD处理可降低空腹血糖，改善认知功能，保护海马神经元，增加Nissl小体数量，抑制小胶质细胞/星形胶质细胞的激活，减轻血脑屏障损伤，并调节全身/神经炎症因子水平，显示出其在T2DM小鼠中减轻炎症负担和发挥神经保护作用的潜力。二甲双胍具有稳定的降糖效果，但在改善认知功能和保护神经元方面效果不如TZQD，突显了TZQD治疗DCD的独特治疗潜力。
肠道微生物群失调会损害肠道屏障，增加肠道通透性，促进促炎因子的释放，这些因子穿过血脑屏障并引发慢性中枢神经系统炎症，从而导致认知障碍（Carranza-Naval等人，2021；Piatkowska-Chmiel等人，2021）。间歇性禁食和肠道微生物群调节已被证明可通过抑制NF-κB/JNK通路和恢复海马突触超微结构来改善糖尿病患者的认知功能（Liu等人，2020）。在阿尔茨海默病患者中，研究发现Firmicutes减少而Bacteroidetes增加（Vogt等人，2017）。Firmicutes/Bacteroidetes比率常被用作与肥胖相关的指标。一些研究表明肥胖与Firmicutes/Bacteroidetes比率呈正相关（Magne等人，2020）。除了肥胖外，Bacteroidetes和Firmicutes还与糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病、炎症性肠病等有关（Garshick等人，2021；Martínez-López等人，2022；Tsai等人，2025；Zang等人，2023）。在糖尿病患者中，肠道微生物群的组成和功能发生变化，Bacteroidetes与Firmicutes的比例失衡，可能影响胰岛素敏感性和血糖调节（Chen等人，2021）。在神经系统疾病中，肠道微生物群的失衡可能通过“肠道-大脑轴”影响神经炎症和神经递质的合成与释放，从而影响神经功能（Agirman等人，2021）。在MOD组中，小鼠在STZ注射后体重逐渐下降，Firmicutes/Bacteroidetes比率降低，这与Xu Huan等人的研究结果一致（Xu等人，2022）。TZQD处理显著逆转了T2DM小鼠的体重下降，随着体重的增加，Firmicutes/Bacteroidetes比率也上升。在属水平上，TZQD干预后，10种肠道菌群（如Escherichia-Shigella和Alistipes）的丰度下降，而8种肠道菌群（如Ruminococcus）的丰度增加。Escherichia-Shigella作为一种典型的促炎微生物（Yang, Xiang等人，2022），与焦虑等神经系统疾病有关（Baske等人，2024）。Alistipes和Ruminococcus在维持肠道稳态和调节炎症中也起重要作用（Hall等人，2017；Parker等人，2020）。
短链脂肪酸（SCFAs）可增强肠道黏膜免疫系统，促进免疫细胞增殖和活性，并通过抑制TNF-α和IL-1β的合成来保持肠道免疫平衡（Parada Venegas等人，2019）。SCFAs可通过“肠道-大脑轴”影响神经系统功能。SCFAs能穿过血脑屏障，直接影响中枢神经系统，调节多巴胺和血清素的产生和释放，从而影响情绪、行为和认知（O'Riordan等人，2022）。MOD小鼠的粪便SCFA水平显著降低，表明DCD患者的肠道微生物代谢功能受损；TZQD处理可上调SCFA浓度，为其通过肠道-大脑轴介导的神经保护提供新的机制。虽然我们的数据显示SCFA增加与认知改善之间存在强烈相关性，但尚未建立直接的因果关系。已知SCFAs，特别是丁酸，可通过组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制发挥神经保护作用，从而调节涉及突触可塑性和炎症的基因表达。未来的实验需要直接补充SCFAs（如丁酸灌胃或菊粉喂养），以测试SCFAs本身是否能模拟TZQD的效果。
肠道屏障损伤会增加循环中的脂多糖（LPS）水平，从而激活TLR4通路并诱导促炎细胞因子的产生（Howard等人，2022）。一旦由于肠道微生物组和免疫系统稳态的变化激活TLR4，肠道相关免疫细胞会产生IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α。这些因子可通过扩散或细胞因子转运蛋白穿过血脑屏障，导致中枢神经系统不可逆的慢性亚临床炎症反应，进而引起T2DM患者的认知障碍（Carranza-Naval等人，2021；Piatkowska-Chmiel等人，2021）。MOD小鼠的结肠黏膜损伤严重，杯状细胞数量减少，ZO-1/Occludin表达降低，肠道炎症因子水平升高，而TZQD处理可保护肠道黏膜，增强紧密连接蛋白表达，增加黏液分泌，并减轻肠道炎症。这些效果优化了肠道微生物微环境，促进益生菌定植并恢复肠道微生物平衡（Wang等人，2024）。我们未直接测量循环或结肠中的LPS水平，这是一个局限性。然而，我们的数据显示肠道屏障完整性（ZO-1/Occludin）和全身炎症细胞因子的降低强烈支持TZQD能减少微生物产物转移的结论。测量LPS水平将提供肠道修复与TLR4通路抑制之间的直接联系，我们计划在未来的研究中包括这一内容。
TLR4/NF-κB/NLRP3通路是肠道-大脑轴炎症的关键介质（Zhong等人，2025）：LPS激活TLR4会导致NF-κB核转移，上调NLRP3炎症小体表达，并触发促炎细胞因子的释放，从而导致肠道和神经炎症（Coutinho-Wolino等人，2022；Feng等人，2023）。粪便微生物群移植已被证明可以降低LPS水平并抑制NLRP3炎症小体的激活（Zhang等人，2022），而肠道微生物群的调节可通过抑制TLR4/NF-κB通路来缓解神经退行性疾病（Zhao等人，2021）。在这项研究中，MOD小鼠的海马体和结肠中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相关蛋白的表达增加，而TZQD treatments显著降低了这些蛋白的表达，证实TZQD通过抑制这一通路发挥抗炎作用。粪便微生物群移植（FMT）是将供体的粪便溶液注入受体的肠道中，以改变受体的肠道微生态，从而达到治疗疾病的目的。研究表明，FMT可以改变2型糖尿病（T2DM）患者的微生物生态，从而改善血糖和胰岛素敏感性（Wu等人，2023年）。使用db/m小鼠作为FMT供体，对db/db小鼠进行4周的粪便悬浮液灌胃后，血浆空腹血糖（FBG）降低，胰岛素抵抗（IR）减轻，肠道屏障功能障碍改善，黏膜炎症减少，CD4+/CD8+比例下降（Chen等人，2023年）。这些结果表明，FMT有助于重建肠道菌群，改变血清代谢物，调节T2DM患者的免疫变化，并减少炎症反应，进而影响和改善葡萄糖代谢（Zhang等人，2025年）。FMT可能是治疗T2DM的一种潜在有益方法。FMT在阿尔茨海默病（AD）的治疗中也显示出积极的潜力。FMT治疗可以改善APPswe/PS1dE9转基因小鼠的认知缺陷，减少Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化，增加突触可塑性，并逆转肠道菌群和短链脂肪酸（SCFAs）的变化（Sun等人，2019年）。我们的FMT实验没有对受体进行抗生素预处理，我们选择不使用抗生素以避免对代谢参数和炎症产生混淆效应。因此，观察到的效果反映了供体微生物群对现有菌群的叠加/竞争性影响，而不是完全替代。这可能低估了治疗效果，但并不否定TZQD调节的微生物群具有保护作用的结论。
TCMSP（中药物质谱）中定义的口服生物利用度和药物相似性标准包括OB≥30%和DL≥0.18。然而，许多TZQD成分可能通过肠道微生物群代谢发挥作用，而非直接吸收。因此，我们的网络药理学分析可能低估了那些吸收不良但能被微生物群激活的化合物的贡献。未来的研究应纳入肠道微生物群代谢的预测。接受TZQD调节粪便的正常小鼠（CON-(TZQ)FMT）相比对照组（CON）表现出轻微的炎症变化，这表明TZQD调节的微生物群可能在特定背景下具有保护作用：对糖尿病小鼠具有保护作用，而在健康宿主体内则仅具有轻微调节作用。这一观察结果强调了肠道-免疫相互作用的复杂性，需要进一步研究。我们的16S rDNA测序提供了分类学信息，但未提供功能预测。如果使用PICRUSt2分析，可以进一步了解代谢途径（如SCFA的产生）。我们已将此作为局限性，并将在未来的研究中纳入宏基因组或PICRUSt2分析。
TZQD-FMT改善了糖尿病小鼠的体重和血糖控制，增强了学习和记忆能力，减轻了海马体和肠道黏膜的损伤，抑制了小胶质细胞/星形胶质细胞的激活，调节了炎症因子水平，并恢复了肠道微生物多样性。尽管TZQD-FMT的效果不如直接给予TZQD显著，但其保护作用证实了肠道微生物群调节是TZQD改善DCD（糖尿病相关认知障碍）的关键机制。我们没有量化血清或大脑中的咖啡酸、山柰酚、槲皮素等关键化合物。证明其生物利用度可以直接将化学分析与体内效应联系起来。然而，我们的FMT实验证明了TZQD调节的肠道微生物群足以提供神经保护作用，表明治疗效果主要是通过微生物群-肠道-大脑轴介导的，而非典型化合物的直接中枢作用。鉴于黄酮类化合物广泛的II期代谢过程以及其在大脑中极低的浓度，对母体化合物的定量分析无法准确反映活性部分。我们已经注意到了这一局限性，并将在未来的研究中专注于代谢物的药代动力学研究。
结论：TZQD通过调节肠道微生物群组成，增加SCFA水平，减轻肠道黏膜屏障损伤和炎症，从而减少促炎细胞因子的产生，缓解海马体炎症和血脑屏障（BBB）损伤，抑制小胶质细胞/星形胶质细胞的激活，并通过肠道-大脑轴抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路，改善了2型糖尿病小鼠的认知功能障碍。这些发现证实了TZQD的神经保护作用，并为DCD的治疗提供了一种基于中医的新策略。
#### 作者贡献声明
管英婷：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据整理。
李青月：撰写 – 审稿与编辑、正式分析、概念构思。
志胜浩：数据可视化、项目管理、实验实施。
倪晓婷：资源获取、实验实施、正式分析。
王旭：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资金申请、概念构思。
#### 数据可用性声明
本研究使用的数据集可向通讯作者申请获取。
#### 资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号81973796）和江苏省研究生研究与创新项目（项目编号KYCX24_2243）的支持。
