遗传标记与化学标记：针对细胞外囊泡的追踪策略的定量比较

时间：2026年5月16日

来源：Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine

编辑推荐：

北京同仁医院眼科中心，首都医科大学，中国北京

摘要

背景

细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中起着关键作用，并且是很有前景的药物递送载体。该领域的一个主要挑战是缺乏能够定量、稳定且不干扰地追踪单个EVs的标记策略。

方法

我们系统地比较了用于单囊泡追踪的遗传标记和化学标记策略。基于HaloTag的遗传方法与两种化学方法进行了评估——胆固醇修饰的反义寡核苷酸（ASO）和亲脂染料DiD。使用纳米流式细胞术（NanoFCM）、中角光散射（MALS）和细胞荧光显微镜评估了标记效率、稳定性、聚集效应和细胞摄取情况。

结果

HaloTag系统的标记效率达到了98%，且没有引起聚集现象，表现出极佳的稳定性。相比之下，两种化学标记方法存在严重局限性：DiD染料容易聚集形成纳米颗粒，这影响了EVs的回收效率和标记效率，但通过我们对EVs的基因工程改造，这一问题得到了改善。尽管新型Chol-ASO策略的初始标记效率高达99%，且没有引起聚集，但在细胞培养条件下，ASO-EV复合物会迅速解离。因此，观察到的荧光信号部分来源于细胞对游离ASO的摄取，而非EV介导的递送，这严重混淆了真正EV摄取的解读。

结论

使用HaloTag进行遗传标记为定量和稳定的单囊泡追踪提供了一种更优的方法，非常适合研究EV的功能机制。虽然化学标记方法在临床EV样本处理中较为方便，但存在局限性。需要进一步改进化学标记方法，以满足可靠EV追踪的需求。

引言

细胞外囊泡（EVs）通过运输生物活性分子，在从疾病进展到组织修复的各种生物过程中充当细胞间通讯的天然介质。1, 2 由于具有生物相容性、低免疫原性和向受体细胞递送功能性货物的能力，EVs已成为有前景的药物递送载体。3, 4 然而，研究EVs的分布、细胞摄取和功能机制需要可靠的标记技术，这些技术不应改变其天然特性。目前的标记策略面临重大挑战，包括聚集、不稳定性和非特异性结合，这些因素限制了准确的追踪和量化。5

EV表面工程方法包括基因修饰和化学标记。基因策略（如将目标蛋白（例如抗体、肽或酶）与富含EV的膜蛋白（例如PTGFRN、Lamp2b）融合）可以实现稳定和特异性的表面展示。6, 7, 8 基因方法具有高精度，但仅限于可进行基因修饰的细胞来源，限制了其在来自患者样本的临床EVs中的应用。相比之下，化学标记方法为分离后的EV修饰提供了一种快速且通用的替代方案。然而，标记稳定性、非特异性结合和颗粒聚集仍然是可靠化学EV追踪策略的关键挑战。这些局限性凸显了需要一种稳定、定量的EV标记方法。

为了解决这些问题，我们的研究采用了三种EV标记策略：（1）共价HaloTag蛋白-配体系统；（2）传统的膜插入型亲脂染料DiD；（3）新型的胆固醇锚定反义寡核苷酸化学修饰策略。我们从多个维度全面评估了这些方法：标记效率、聚集诱导、特异性、配体/探针结合的稳定性以及细胞摄取实验中的信号准确性。我们期望这项研究能为根据具体研究目标选择EV标记方法提供明确的实验基础和决策框架，并推动下一代更可靠、更智能的EV标记和功能化平台的发展。

章节片段

细胞系和培养

A549细胞在添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco）和1%青霉素/链霉素（Gibco）的DMEM培养基中培养。细胞在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中维持，并使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）在80–90%汇合度时传代。对于EVs的分离，通过150,000 xg的离心作用将胎牛血清替换为不含EV的血清，离心时间为18小时。

纳米流式细胞术分析

纳米流式细胞术分析使用Apogee MicroGxP流式细胞仪（Apogee Flow Systems，英国）进行。在样本处理之前

分离的细胞外囊泡的特性

为了确保本研究中使用的EVs的质量和纯度，我们进行了系统的特性分析。透射电子显微镜（TEM）显示，分离出的EVs具有典型的杯状形态和预期的尺寸分布（大约50–250 nm）（图1A）。Triton X-100介导的囊泡裂解的纳米颗粒追踪分析证实了提取囊泡的膜完整性（图1B）。纳米流式细胞术分析显示

讨论

本研究系统评估了三种EV标记策略：基于HaloTag的共价遗传标记、膜插入型DiD染料标记和胆固醇锚定的反义寡核苷酸（ASO）化学标记。通过全面比较标记效率、特异性、稳定性和在细胞摄取模型中的表现，为不同的实验目标提供了方法选择指南。

我们的研究表明HaloTag是一种稳健的遗传标记方法

CRediT作者贡献声明

Jikuan Jiang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究，概念化。Moxuan Yang：研究。Shengya Xu：研究。Tian Jiang：研究。Qingshan Luo：研究。Tong Zhao：资源获取，项目管理。Xiangyu Shi：正式分析，数据管理。Qiyan Li：正式分析，数据管理。Jingling Zou：正式分析，数据管理。Teng Teng：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。