**Bilyamin Abdulmumin | Abdullahi Jibril | Abdulwasiu Abdurrahman**
**尼日利亚扎里亚阿德姆杜·贝洛大学工程学院化学工程系**
**摘要**
在生物乙醇生产中，微生物固定化是一种战略性的方法，与游离细胞相比，它提供了更高效的生物加工。存在多种固定化技术，如吸附、共价键合、包封和封装，每种技术在微生物细胞与支撑材料的相互作用方式上有所不同。包封技术因其坚固性而受到工业界的关注，它提供了一种半透膜，使包封的生物质保持最佳存活状态。尽管具有这些优势，包封也面临一些挑战，包括工业应用的可扩展性、整体生物乙醇生产成本的增加、次优的微观结构导致渗透性和孔隙率降低（与游离细胞相比），以及难以实现微米和纳米级的载体尺寸。因此，本综述重点关注解决这些挑战的策略，特别是微观结构（孔隙率、迂曲度和胶囊几何形状）的限制。已报道的研究的定量合成显示，乙醇产量范围为0.40–1.125克/升·小时，性能的提升通常与微观结构的改善相关，这增强了有效扩散性并减少了内部质量传递的限制。本综述为开发高效的包封技术提供了见解，从而有助于提高工业规模生物乙醇生产的兴趣。
**1. 引言**
固定化是一项开创性技术，显著推进了工业生物乙醇的生产。该方法提供了许多优势，包括提高微生物活性、增强对恶劣发酵条件的抵抗力、简化产品纯化过程、提高底物转化率和产品形成率等[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。根据具体应用的不同，使用不同类型的材料进行微生物包封，包括有机材料、无机材料、复合材料和新兴材料。诸如海藻酸盐、壳聚糖、卡拉胶、琼脂糖、纤维素衍生物以及聚乙烯醇（PVA）和聚乙二醇（PEG）等合成聚合物因其生物相容性和温和的凝胶化条件而被广泛使用。相比之下，二氧化硅、生物炭和其他金属氧化物基质因其结构强度和热稳定性而受到重视。通过结合这些特性，可以开发出兼具生物相容性和增强机械稳定性的混合或复合系统。材料科学和工程的进步使得可以开发出满足特定应用需求的精细调整的有机、无机或复合材料。例如，可以通过引入氨基或羧基团对材料进行功能化，或者用含氧基团进行修饰以增强微生物固定[6]。其他先进材料还包括磁性纳米材料（如金纳米颗粒[7]）和基于碳纳米管的材料[8]。这些材料具有高表面积与体积比、改善的质量传递和更容易分离等优点。
同样，也有多种技术可用于实现微生物固定化，如吸附、共价键合、包封和封装。吸附是最简单的固定化形式；微生物细胞可以通过氢键和范德华力等弱相互作用轻松附着在载体上。除了吸附的简便性外，吸附过程使用的材料通常是廉价的生物产品，如玉米芯残渣、稻壳、小麦秸秆、花生壳、橙皮和锯末。
最稳定的固定化技术是共价键合，因为它涉及强共价键[9]；然而，这种方法不仅处理复杂，而且对固定微生物有负面影响。对于包封技术来说，与紧密相关的封装方法相比，会产生多孔生物催化剂。但封装具有生理优势，它提供了一个液态核心，有利于微生物的生长和繁殖[10]。一些微生物天生会形成絮状物，这种现象被利用作为交联固定[11]。有趣的是，可以使用戊二醛等化学物质来强制微生物交联[12]。每种固定化技术的区别主要在于固定细胞的位置；细胞可以通过强作用力（离子键和共价键）或弱相互作用（氢键和范德华力）固定在表面上，或者嵌入支撑材料中。
在各种固定化技术中，包封技术越来越受到研究人员的关注，因为它具有坚固性，能够为包封的生物质提供半透膜，从而保持最佳存活状态[10]、[13]、[14]。然而，任何技术进步都伴随着相应的挑战。当微生物被包封时，第一个明显的挑战是质量传递；待转化的底物在到达目的地之前会遇到多种阻力[15]、[16]、[17]。这些阻力包括外部和内部的阻力。因此，生物反应速率取决于底物质量传递和微生物存活率。这需要开发增强质量传递的策略，包括提高膜孔隙率或减小胶囊尺寸[16]、[18]、[19]、[20]、使用更薄的胶囊膜[21]、控制细胞浓度[22]、[23]、在胶囊内均匀分布细胞[24]、降低迂曲度[15]以及在发酵过程中提高搅拌效率或流速[17]。
封装的另一个挑战是产生的胶囊随时间的不稳定性和降解[25]、[26]。可以通过利用不同材料的固有特性来解决这一稳定性问题。例如，合成有机材料通常比天然材料更强，因此将它们组合成复合材料可以提高结构完整性。同样，无机材料比有机材料具有更高的强度，因此有机-无机复合材料可以提供更坚固的载体支持。此外，涂层胶囊已成为进一步增强胶囊稳定性的有前景的方法。尽管固定化允许重复使用，但其作为额外的发酵步骤会导致总体生产成本增加。为了抵消这一额外成本甚至使过程盈利，必须在批处理过程中反复使用固定化细胞，并在连续过程中长时间使用它们[21]、[27]、[28]。
除了质量传递、稳定性和成本增加的问题外，放大也是微生物封装中的一个主要挑战[29]、[30]。解决这些限制对于包封技术在生物乙醇生产中的成功应用至关重要[30]。近年来，几篇综述文章讨论了微生物封装技术的不同方面。例如，Valdivia-Rivera等人[30]详细介绍了包封技术和用于微生物固定的各种载体材料。Wang等人[14]进行了全面回顾，强调了包封微生物与其周围基质之间的相互作用。Homburg和Patel[31]研究了针对敏感微藻系统的封装策略。此外，Agriopoulou等人[32]主要关注与封装技术相关的控释机制，而[29]讨论了微封装技术在各种应用中的作用、挑战和未来展望。表1展示了2021-2025年间选定的近期综述的结构化比较。
**表1. 2021-2026年关于微生物封装的最新综述对比**
| 综述标题 | 主要关注点 | 包封材料覆盖范围 | 微观结构（孔隙率、迂曲度、几何形状）分析 | 使用扩散模型的质量传递分析 | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 将微生物封装以提高废水中生物 nitrogen 的去除：最新进展和未来机遇 | 自然聚合物（海藻酸盐、壳聚糖等） | 无描述 | Wang等人[14] |
| 用于生物修复的微生物封装：技术和载体 | 有机和无机（壳聚糖、聚乙烯醇（PVA）、硅胶等） | 无描述 | Valdivia-Rivera等人[30] |
| 在含细胞材料中的定殖与封装：孔隙率和工艺生物相容性决定定殖途径 | 有机和无机 | 无描述 | Parisi等人[33] |
| 微藻在硅胶水凝胶中的封装 | 无机二氧化硅材料 | 有限描述 | Homburg和Patel[31] |
| 微生物接种剂的生物封装：机制、配方类型和应用 | 有机聚合物（海藻酸盐、壳聚糖、卡拉胶等） | 有限描述 | Rojas-Sánchez等人[34] |
| 益生菌的封装策略应用 | 有机和无机 | 简要描述 | Agriopoulou等人[32] |
| 微封装：现代科学中的创新技术 | 有机（天然、合成）和 hybrids | 有限描述 | [29] |
| 冷冻干燥和喷雾干燥技术生产可持续农业用固体微生物制剂 | 干燥方法和储存期间的保护与损伤机制 | 有机（天然、合成）、无机、hybrid | 概念性描述 | Luft和Mazutti[35] |
**2. 方法论**
本综述采用半系统文献回顾方法，评估用于生物乙醇生产的微生物封装技术。半系统方法允许对不同的实验回顾研究进行概念综合和批判性分析（原始数据见补充材料）。
**2.1. 文献搜索策略**
使用Scopus、Web of Science、ScienceDirect、PubMed和Google Scholar数据库进行了全面的文献搜索。搜索涵盖了2015年至2025年的出版物，反映了与生物乙醇生产相关的微生物封装和固定化技术的基础和最新进展。搜索词和布尔组合包括：
• “微生物封装”，
• “细胞固定”，
• “生物乙醇生产”，
• “质量传递限制”，
• “海藻酸盐胶囊”，
• “二氧化硅涂层胶囊”，
• “介孔材料”。
还手动筛选了关键综述和研究文章的参考列表，以识别数据库搜索中未捕捉到的其他相关研究。
**2.2. 研究筛选和资格标准**
检索到的记录经过两个阶段的筛选。首先，检查标题和摘要以排除明显不相关的出版物。其次，根据预定义的纳入和排除标准进行全文筛选。
- **纳入标准**：
- 研究涉及用于生物乙醇生产的微生物固定或封装。
- 研究专注于封装材料、胶囊微观结构、质量传递行为、稳定性或放大。
- 实验、建模或回顾性研究，报告与性能相关的结果（例如，乙醇产量、产量、扩散行为、操作稳定性）。
- **排除标准**：
- 与发酵或生物乙醇生产无关的研究。
- 仅关注酶固定且与微生物系统无关的文章。
- 没有可访问翻译的非英语出版物。
- 缺乏足够实验、分析或工程细节的研究。
**2.3. 数据提取和结构化**
从符合条件的研究中提取相关信息，并将其组织成主题类别，以便进行比较和批判性分析。提取的数据包括：
- 固定化材料类型（有机、无机、复合材料和改性或新型材料）；
- 固定化技术（吸附、共价键合、包封）；
- 胶囊特性（尺寸、孔隙率、膜厚度、涂层策略）；
- 性能指标（乙醇产量、产量、可重复使用性）；
- 识别的挑战（质量传递阻力、机械不稳定性、细胞过度生长和泄漏、可扩展性及成本）。
**2.4. 数据分析和综合**
使用比较和主题综合方法分析提取的数据。根据与性能相关的标准，以及其他描述性比较，评估了不同的封装技术。重点关注：
- 胶囊微观结构与质量传递行为之间的关系；
- 无机和混合涂层对机械稳定性和扩散阻力的影响；
- 稳定性、渗透性和可重复使用性之间的权衡；
- 对工业可扩展性和过程经济性的影响。
**3. 文献回顾**
本章提供了关于用于生物乙醇生产的微生物固定的同行评审工作。
**3.1. 固定化材料**
固定化生物催化剂的最终属性和功能始于材料的选择。这些属性包括比表面积、孔隙率、化学性质和机械强度。其他考虑因素包括简易性、可用性和成本。常用的固定化材料包括有机材料、无机材料、复合材料和新型材料（图1）。
**图1. 微生物固定化材料分类：有机、无机、复合和新型材料**
**3.1.1. 有机材料**
用于固定化的有机材料分为天然和合成类型。天然材料包括海藻酸盐、琼脂、壳聚糖、卡拉胶、纤维素及其衍生物（例如羧甲基纤维素）[39]。合成材料包括聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯铵和聚乙二醇（PEG）。在天然材料中，海藻酸盐和PVA因其优异的特性而脱颖而出，如简易性、可用性、高孔隙率以及适合固定化过程的温和条件[13]。Talebnia等人[10]使用高毒性水解物比较了游离细胞和海藻酸盐包封细胞在生物乙醇生产中的表现。研究表明，海藻酸盐包封的细胞在不到10小时内转化了水解物，而游离细胞在24小时内无法转化相同的水解物。此外，固定化的细胞可以重复用于多达十次连续批次发酵，所有批次的生物乙醇产量和产率保持一致。Herkommerová等人（2018）研究了多种酵母菌株（包括Debaryomyces hansenii、Pichia sorbitophila、Saccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica和Zygosaccharomyces rouxii）在聚乙烯醇（PVA）凝胶上的固定化。研究发现，固定化提高了所有菌株的存活率，其中Saccharomyces cerevisiae和Yarrowia lipolytica的存储稳定性最高，存活时间超过一年，而游离细胞仅存活三个月。此外，可重复使用性研究表明，固定在PVA上的酿酒酵母（S. cerevisiae）可以重复使用多达55次。天然聚合物如藻酸盐具有弹性、生物相容性和多孔性，有助于促进物质传递和维持细胞活性。然而，它们缺乏合成聚合物（如PVA）所具备的长期机械强度[40]。3.1.2. 无机材料 无机材料因其坚固性、易获得性、稳定性和独特的表面特性而被广泛用于微生物固定。常见的例子包括活性炭、生物炭、硅胶和沸石[41]。其中，生物炭尤为突出。其层次化的孔结构和大量的官能团（如羧基、羟基和酚基）显著增强了固定的效果，提高了细胞附着和稳定性。此外，生物炭还可以根据需要调整孔径和表面化学性质，从而进一步提高其作为微生物固定载体的有效性[41]。Kyriakou等人[42]研究了酿酒酵母在生物炭上的固定情况，并在41°C的高温下进行了发酵实验。实验发现，固定化的细胞的乙醇产率为30.8克/升，远高于自由细胞的13.4克/升。这些结果进一步证明了如何通过热解温度来改变生物炭的性质（如孔径和表面积），从而提高酿酒酵母在恶劣条件下的耐热性。无机材料具有高刚性、热稳定性和出色的化学抗性，使其适用于恶劣和高应力的环境。3.1.3. 复合材料 如前所述，单独的有机和无机材料都有局限性，可能无法完全满足某些固定应用的具体要求。为了利用两种材料的优点并克服各自的局限性，越来越多地采用复合材料[41]。例如藻酸盐-PVA（有机-有机）或藻酸盐-硅胶（有机-无机）这样的复合材料，结合了有机聚合物的生物相容性和弹性以及无机成分的结构强度和耐久性。在一项研究中，Rakin等人[43]定量比较了藻酸盐和PVA（聚乙烯醇）材料的性能指标。作者报告称，PVA材料表现出更好的机械强度和稳定性，可以重复使用五次，而藻酸盐载体仅能维持两次重复使用。在生物相容性和乙醇产量方面，藻酸盐载体产出了10.1克/升的乙醇，而PVA载体在相同条件下仅产出了7.2克/升。PVA较低的乙醇产量可能与生物相容性限制有关。Mohd Azhar和Abdulla[44]展示了PVA-藻酸盐载体的综合优势。他们将野生型酿酒酵母固定在PVA-藻酸盐复合材料中，在41°C下进行发酵，乙醇浓度达到了9.57克/升，产率为93.82%，并且该生物催化剂可以重复使用四次。与Rakin等人[43]在相似条件下的结果相比，这一乙醇浓度更高，且非常接近仅使用PVA时能达到的结果（10.1克/升，即五次重复使用）。此外，研究还指出，添加藻酸盐有助于缓解通常与PVA珠子相关的聚集问题。这表明，通过组合材料可以最大化其优势并克服各自的局限性。利用复合材料，可以通过按一定比例混合多种材料来实现单一材料无法实现的功能或特性。3.1.4. 创新材料 材料科学的进步为通过改进现有材料来开发新型材料铺平了道路[41]。通过修改材料的性质（如官能团、比表面积、孔隙率和结构特征），可以显著提高其在固定过程中的性能或使其更适合特定应用。表1总结了创新型材料及其他类型材料的关键性能指标，包括生物乙醇产量、生产效率、产率和可重复使用性。作者还报告了主要微生物固定材料的相关发现和结论。从表2可以看出，为了实现这些改进，采用了多种改性技术，如氧化铁（Fe₂O₃）处理来提高载体孔隙率[52]，光交联和甲基丙烯酸基团修饰来增强结构耐久性[53]，以及胺基修饰来提高固定效率[9]。表2. 用于生物乙醇生产的微生物封装固定材料的定量和半定量比较。分类 载体 生物乙醇产量（克/升·小时） 生物乙醇产率（克/克） 可重复使用次数（次） 发现 结论 参考文献 有机载体 藻酸盐 5.15 0.46 46–10 藻酸盐珠子中的酵母封装不仅提高了乙醇产量和产率，还减少了副产物的形成。藻酸盐具有优异的生物相容性和高发酵效率；然而，其机械强度相对较弱。Talebnia等人[10] PVA 未报告（NR） NR 55 固定在PVA水凝胶中的酵母在长时间储存和多次发酵过程中保持了稳定的乙醇产量。尽管PVA等合成聚合物具有更好的机械稳定性，但它们的生物相容性较低。Herkommerová等人[45] 明胶 0.26 0.33 4 固化的明胶块可以切割成所需大小的胶囊。明胶-明胶通过热诱导凝胶化实现简单的细胞捕获；然而，与藻酸盐类似，其机械强度也较低。Singh等人[46] κ-卡拉胶 42.8 NR NR 固定化细胞反应器在87天内运行，固定化细胞活性没有丧失。从温和的凝胶化条件来看，κ-卡拉胶与藻酸盐相当。Nigam [47] 南瓜海绵 0.39 NR NR 南瓜海绵主要通过吸附和多孔表面上的生物膜形成来固定细胞。其宏观多孔结构和相互连接的通道有助于高效的质量传递，使其在聚合物中独具特色。Chacón-Navarrete等人[48] Lentikat 12.8 8 NR NR Lentikat盘片由于结构完整性更高，优于藻酸盐。与藻酸盐相比，Lentikat盘片在生物相容性方面也有所改进。Mathew等人[49] 有机-有机复合材料 PVA-藻酸盐 NR 0.79 4 固定在PVA-藻酸盐珠子中的酿酒酵母能有效将半乳糖发酵为乙醇，产率较高。PVA-藻酸盐复合材料结合了藻酸盐的生物相容性和PVA的机械稳定性。Mohd Azhar, Abdulla [44] 藻酸盐-纤维素 4.2–4.8 40.4 3–5 藻酸盐-纤维素复合珠子将发酵速率提高了约三倍。藻酸盐-纤维素复合材料通过改善孔结构减少了内部扩散阻力。Pratama等人[50] N-乙烯基-2-吡咯烷酮修饰的钠藻酸盐 8.7 10.6 97 NR 用N-乙烯基-2-吡咯烷酮修饰钠藻酸盐提高了乙醇产量，因为增加了亲水性。亲水性聚合物修饰是一种提高底物扩散和发酵效率的有前途策略。Inal, Yigitoglu [51] 无机载体 生物炭 7.2–7.3 NR 6 提高热解温度可以改善生物炭的孔隙率和表面积，从而提高乙醇产量。生物炭作为一种低成本、可调孔结构和热稳定的无机载体具有吸引力。Kyriakou等人[42] 有机-无机复合材料 钙藻酸盐磁性纳米颗粒（Ca-MNP） NR NR NRR 钙藻酸盐磁性纳米颗粒与自由细胞和传统藻酸盐固定方法相比提高了乙醇产量。磁性载体提高了回收率、装载能力和重复使用潜力，但工艺经济性取决于纳米颗粒的合成成本。藻酸盐-壳聚糖-硅胶（微孔或介孔） 0.67 5–1.1 25 0.27–0.4 57–9 藻酸盐-壳聚糖胶囊的硅胶涂层提高了乙醇产量，因为增强了膜通透性。膜工程是一种重要的微结构改性策略，可以改善质量传递[36],[38]。创新载体 氧化铁（Fe₂O₃）修饰的PVA 24.2 4 或 12.4 7（仅PVA） NR 连续操作20天后，Fe₂O₃的加入增加了PVA基质内的孔密度，从而提高了微生物装载量并提高了乙醇产量。金属氧化物修饰是一种有效改进孔结构和质量传递特性的策略。Nurhayati等人[52] 光交联和甲基丙烯酸基团修饰的Ca-藻酸盐 NR 0.05–0.25 NR 甲基丙烯酸修饰的藻酸盐珠子比传统钙藻酸盐珠子具有更好的硬度和机械强度。光化学交联提高了载体的耐久性，同时保持了适合微生物固定的孔隙率。Cha等人[53] 聚-L-乳酸（PLLA）-微管阵列膜（MTAM） 2.69 0.48 7 纳米孔PLLA微管阵列膜（MTAM）提供了高有效扩散性，提高了乙醇产量。工程化的纳米多孔膜是一种新型策略，可用于控制固定化生物反应器中的质量传递[54]。修改后的介孔硅胶载体 NR NR 10–25 功能化的介孔硅胶载体通过吸附和共价键合机制实现固定。多孔材料的表面修饰提供了灵活的固定策略，并可提高稳定性和微观结构特性。Banjanac等人[9] 文献中还报道了其他策略，如酸和碱修饰以调整表面化学性质并增加孔隙率[55]。盐修饰（如氯化物处理）可以提高材料稳定性和催化活性[56]。硫酸亚铁和碳酸钙修饰可以改善吸附能力和机械性能[40]。Nurhayati等人[52] 用氧化铁（Fe2O3）修饰钠藻酸盐以固定Zymomonas mobilis。作者发现，Fe2O3处理增加了PVA载体中的孔数量，从而提高了微生物负载量并提高了底物利用率，使生物乙醇产量几乎翻倍（31.09克/升·小时）。此外，修饰后的PVA固定化细胞可以使用超过20天而不会失去活性。Cha等人[53] 通过互穿网络方法调整了藻酸盐凝胶珠的结构耐久性，以实现持续的乙醇生产。他们发现，由此制备的甲基丙烯酸藻酸盐凝胶珠（IPN-MA）具有更高的硬度、 ultimate strength和ultimate strain，优于未修饰的钙藻酸盐凝胶。此外，封装在IPN-MA凝胶中的酵母细胞在乙醇生产中的代谢活性也更强。表2的数据为各种材料的角色提供了指导。天然有机材料（如藻酸盐）一贯表现出高乙醇产量和生产效率（例如5.15克/升和0.464克/升·小时），这主要归功于它们的生物相容性；然而，它们通常机械稳定性较差。合成有机聚合物（如PVA）则提供更好的机械强度和长期稳定性以及更高的可重复使用性。复合材料（无论是有机-有机（如PVA-藻酸盐）还是有机-无机（如藻酸盐-壳聚糖-硅胶）结合了各自组分的优点。无机载体（如生物炭）则以可调孔隙率和成本效益著称。新兴和创新材料（包括磁性纳米颗粒、氧化铁修饰的PVA、光交联的甲基丙烯酸藻酸盐和纳米结构聚合物载体）展示了材料工程在提高乙醇产量、生产效率和操作耐久性方面的潜力。新兴材料彻底改变了固定技术，因为可以根据特定需求和应用定制特定材料。3.2. 封装技术 封装技术是一种特殊的固定方法，越来越受到研究人员的关注。这得益于其多种优势，例如半透明膜不仅可以防止封装的生物质泄漏或恶劣的生物过程条件，还能提供有利于细胞生长和最佳活性的生理环境。在封装技术中，通过将凝胶聚合物、细胞和活性阳离子结合来形成生物催化剂。带负电的凝胶聚合物与阳离子之间的瞬时静电相互作用在细胞周围形成半透明膜，将细胞封装在液体核心中。封装技术有多种实现方法，每种方法都针对特定需求和应用进行了优化。常用的方法包括共凝聚、喷雾干燥、乳化和简单滴注（挤出）[57]。挤出是封装微生物的主要和广泛采用的方法（图2）。图2. 微生物封装的反向外部凝胶化方法示意图。挤出封装有两种策略：外部凝胶化和反向外部凝胶化。在外部凝胶化方法中，将细胞与凝胶聚合物（如藻酸盐）混合，然后使用滴注机将混合物滴入交联剂（通常是钙）。结果，细胞被封装在半透明的Ca-藻酸盐膜中。而在反向外部凝胶化方法中，将细胞和阳离子（如钙）的混合物逐渐从喷嘴、移液管或蠕动泵等孔口中滴入藻酸盐溶液中。当混合物从孔口中流出时，在末端形成液滴，逐渐变大直至分离并落入藻酸盐溶液中。使用这种技术制备的藻酸盐凝胶通常具有毫米级尺寸，范围从1到2毫米[58]。为了提高细胞-阳离子混合物的粘度并促进球形液滴的形成，通常会加入羧甲基纤维素（CMC）。此外，将Tween 20与藻酸盐混合物混合可以降低表面张力，有助于挤出过程的顺利进行。Talebnia等人[10]展示了Ca-藻酸盐胶囊的可重复使用性。他们使用相同的酵母Ca-藻酸盐胶囊进行了十次连续批次发酵，所有批次的乙醇产量和产率均保持一致。作者还比较了自由细胞和封装细胞在高毒性水解物中的乙醇生产情况；研究发现，封装细胞在10小时内转化了水解物，而自由细胞则需要24小时。这表明封装细胞对发酵条件的耐受性更强。此外，细胞封装提高了对高温的耐受性，允许其在高达45°C的条件下工作，而自由细胞只能在37°C的中温下工作[59]。因此，由于糖化和发酵酶的操作温度不同所带来的挑战，通过细胞封装实现了同时进行糖化和乙醇生产。Najafpour等人[60]的研究表明，包封的酵母能够将高达150克/升的高葡萄糖浓度转化为生物乙醇，而自由细胞则无法发酵约100克/升的葡萄糖浓度；此外，由于该过程是连续进行的，这表明通过细胞包封可以实现连续发酵。不同固定化技术之间的差异通常源于固定化细胞的位置（图3）：细胞可以固定在表面上（吸附和共价结合），或者可以嵌入支撑材料中（包封和捕获）。下载：下载高分辨率图片（339KB）下载：下载全尺寸图片 图3. 固定化技术分类：物理吸附、共价吸附、交联、捕获和包封。在钙藻酸盐中的捕获和包封之间的关键区别在于钙离子（Ca²⁺）的引入方式[13]。在包封过程中，钙离子被添加到外部，并且几乎立即与藻酸盐发生交联，形成明显的核壳结构。而在捕获过程中，交联是由一个激活步骤触发的，例如pH值的变化，这会释放或激活聚合物网络中的阳离子，从而产生一个均匀的多孔水凝胶基质，但没有核壳结构。吸附和共价结合之间的关键区别在于所涉及的化学键类型。在吸附的情况下，微生物通过氢键和范德华力等弱相互作用被固定。相反，共价结合涉及强共价键[9]。这四种固定化方法在表3中通过性能指标和操作属性进行了比较。表中的数据显示，由于细胞在核壳结构中的有效保留，尤其是在添加了二氧化硅涂层的情况下，包封方法实现了最高的固定化效率（85-95%）和可持续的重用性（6-10个循环）。然而，物质传递受膜的限制，因此直径大于0.5毫米或孔径小于2纳米的胶囊容易受到扩散影响。表3. 微生物固定化方法的比较性能指标。
方法 固定化效率（%） 乙醇产率（g/L·h） 乙醇产量（g/g） 重用性（循环） 关键限制 关键优势 参考文献
包封 85–95 0.40–0.55 0.42–0.48 6–10 膜扩散限制 >0.5毫米；孔径<5–20纳米；胶囊在搅拌速率超过200转/分钟时膨胀或破裂 高固定化效率；由于存在内核，细胞存活率高；微生物泄漏最小 Chan [10], [28], [58], [61], [62]
捕获 70–90 0.35–0.50 0.38–0.46 4–10 缺乏内核，由于膜孔隙率较高，可能导致细胞泄漏 由于孔隙率高，外部物质传递阻力较低；由于可以控制交联过程，更容易调整孔隙率和大小 Chan [58], [63], [64], [65], [66]
吸附（物理和共价） 40–80 0.45–0.65 0.43–0.50 3–7 没有物理膜屏障；在剪切速率超过180转/分钟时，细胞脱落风险高；在低OH值表面上固定化效率低；有时需要有毒的交联剂才能有效固定 提供最低的物质传递阻力；工艺成本低廉；使用的材料通常是农业生物产物，如甘蔗渣、木屑、玉米芯残余物 Araujo等人[67], [68], [69], [70]
捕获提供了更均匀的基质，并且能够调节交联程度，从而实现定制的孔隙率和珠子大小，这降低了外部物质传递阻力。然而，如果没有明确的内核，当膜孔隙率较高时，可能会增加微生物泄漏。吸附（物理和共价）提供了最低的物质传递阻力，并且使用了常见的农业废弃物作为材料基础。尽管如此，它显示出最低的细胞保留率（40-80%），并且对剪切引起的细胞脱落非常敏感。与其他固定化方法相比，包封技术由于其简单性和为微生物提供液态核心以促进高效生长等优点而更具吸引力。然而，任何技术进步都会伴随着相应的挑战。
4. 结果与讨论
本章探讨了从关于生物乙醇生产固定化的全面文献回顾中识别出的与包封相关的关键挑战。
4.1 稳定性挑战
钙藻酸盐胶囊是通过藻酸盐的β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）残基之间的离子交联形成的。钙离子（Ca²⁺）与相邻链上对立的-COO⁻基团的氧原子配位（图4a）。然而，当存在螯合剂（如柠檬酸、磷酸盐或EDTA）时，这些分子会竞争性地结合钙离子（蓝色球体），从而破坏维持钙藻酸盐水凝胶网络的离子交联。
4.2 质量传递挑战
微生物固定化在生物乙醇生产中的一个主要限制是物质传递阻力。与自由细胞发酵不同，在固定化细胞发酵中，营养物质必须经过一系列步骤才能被转化。首先，营养物质会遇到外部物质传递阻力[86]，这是由于在 bulk 浓度和固定化微生物细胞之间存在一层薄层。在这层薄层中，营养物质仅通过分子扩散进行传递，因此传递速率非常低。在 bulk 中营养物质浓度最高，然后在液-固界面上浓度下降，直到在固体界面上达到最低。因此，这层薄层的存在阻碍了营养物质到达固体生物催化剂表面的过程。如果微生物细胞吸附在支撑物的表面上，那么围绕生物催化剂的薄层是主要的物质传递阻力。但如果微生物被包封或捕获在支撑网络中，则内部物质传递阻力显著增加。在这个系统中，当营养物质到达胶囊表面后，它们需要通过内部阻力进行扩散，因此浓度梯度存在于固体生物催化剂内部：在生物催化剂表面浓度最高，而在支撑物中心浓度最低。
4.3 膜的机械稳定性挑战
大规模藻酸盐发酵受到机械稳定性的限制。发酵器中的重复机械磨损和流体动力学力（图4b）会导致膜逐渐疲劳。随着时间的推移，这种磨损会导致膜的结构退化，最终导致胶囊破裂。为了克服这个问题，已经进行了大量研究，开发出了喷涂了正电荷聚阳离子聚合物（如壳聚糖、聚乙烯亚胺（PEI）或聚-L-赖氨酸（PLL）的钙藻酸盐胶囊[41]。例如，添加壳聚糖可以形成壳聚糖-藻酸盐键，即使钙藻酸盐键断裂，这些键仍然保持完整[73]。Ylitervo等人[73]证明，壳聚糖包层的胶囊可以连续使用五个12小时的循环而不发生故障。同样，Soares等人[25]报告说，混合使用钙藻酸盐和壳聚糖的凝胶提高了酵母在粗水解液中的性能，使生产批次比纯钙藻酸盐珠子多一个批次。Kurayama等人[26]通过向培养基中添加过量的氯化钙来解决钙藻酸盐的不稳定性，这可以与螯合剂和其他竞争性化学物质相互作用，从而稳定钙藻酸盐键。然而，涂层方法提供了一个更好的替代方案，因为它消除了持续添加氯化钙的需要，并且还防止了培养基中盐分的积累。因此，胶囊配方必须考虑生物反应器环境的离子组成，并且在不可避免使用螯合剂的情况下，应采用共价交联或聚合物复合膜来防止钙藻酸盐网络断裂。
4.4 其他挑战
一些间接方法也被用于解决过度生长和二氧化碳积累等问题[80], [81], [82]。根据这一观点，抑制性代谢副产物的存在——尽管对发酵中的酵母有害——可以通过抑制过度的细胞生长来间接提高整体生物乙醇产量。在这种背景下，细胞过度生长的负面影响被抑制性副产物的负面影响所抵消。其他策略包括调整营养供给：加入生长限制剂或有效控制营养物质，可以策略性地“饿死”微生物以实现平衡生长；另一种策略是使用生长缓慢的微生物系统，这可能是控制微生物过度生长的一种方法。
总之，尽管包封技术具有许多优点，如简单性和为微生物提供液态核心以促进高效生长，但任何技术进步都会面临相应的挑战。因此，优化包封技术以实现高效的微生物固定化仍然是一个关键挑战。Cbulk表示体系内的基质浓度（mol·m⁻³）。有效扩散率与体系扩散率、曲折度和孔隙率通过方程式4(4)相关联：
De = Dbulkετ
其中Dbulk为体系扩散率（m²·s⁻¹），τ为曲折度，ε为孔隙率。
有效扩散率进一步与无量纲的质量传递参数Thiele模量、颗粒半径（R）和膜厚度（δ）通过以下方程式（5）、（6）联系起来：
(5) φ = R√kDe
(6) R = r + δ
其中φ为Thiele模量，k为一阶反应常数（s⁻¹），R和r如前定义，δ为膜厚度（m）。
从上述方程式和图5可以看出，胶囊的微观结构特性显著影响有效扩散率。这些关键参数包括孔隙率（ε）、曲折度（τ）、膜厚度（δ）和颗粒尺寸（R）。它们的综合效应决定了胶囊内的质量传递阻力以及整体基质传输效率。
图5. 封装生物乙醇系统中的微观结构–扩散–生产力框架。 (a) 具有不利微观结构的胶囊，表现出低有效扩散率和低生物乙醇生产力。 (b) 单参数微观结构优化（增加孔隙率（I）、降低膜厚度（II）、减少曲折度（III）或优化颗粒尺寸（IV）导致高扩散率和 high 生物乙醇生产力。 (c) 双参数优化导致更高的扩散率和更高的生物乙醇生产力。 (d) 同时优化孔隙率、膜厚度、曲折度和颗粒尺寸，实现最高的有效扩散率和最终的最高生物乙醇生产力。
介孔二氧化硅膜（图5b(I)）比传统的微孔二氧化硅膜更好地缓解了基质扩散问题。根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的标准，微孔二氧化硅的孔径小于2 nm，而介孔二氧化硅的孔径范围为2–50 nm [87]。因此，介孔二氧化硅涂层有望显著降低质量传递阻力。
介孔二氧化硅的合成通常使用孔形成剂（PFA），常用的PFA是表面活性剂，通过煅烧去除。然而，煅烧条件往往不适用于微生物体系。有趣的是，非表面活性剂有机化合物也被报道可以作为替代的PFA。Pang等 [88] 和Wei等 [89] 的研究分别探讨了通过非表面活性剂尿素模板胶溶法和葡萄糖模板胶溶法合成介孔二氧化硅材料。这些研究中获得的孔隙率范围为4.2 nm至6 nm，使用的尿素和葡萄糖可以通过水提取方便去除。
介孔二氧化硅涂层的机制与传统的微孔硅烷路线类似，主要区别在于介孔过程中加入了有机非表面活性剂（PFA）。在传统的微孔方法中，藻酸盐胶囊直接浸入硅烷偶联剂溶液（例如APTES）中。在适当的pH和工艺条件下，带负电的藻酸盐表面通过静电吸引力与带正电的APTES相互作用，并通过氢键等额外的键合作用形成富硅表面层。这种相互作用的电荷兼容窗口由两组分的表面化学性质决定。APTES在pH值低于9.6时带有净正电荷，对应于其氨基官能团的pKa值。相比之下，藻酸盐胶囊在pH值高于3.56时带有净负电荷，这是藻酸盐单体G（甘露糖醛酸）和M（甘露聚糖酸）解离的pKa值。因此，藻酸盐和APTES之间的有效静电耦合发生在pH值介于3.56 < pH < 9.6的范围内。
在改进的介孔路线中，使用葡萄糖、单宁酸和尿素等PFA在发展的二氧化硅网络中生成临时有机模板。膜形成后，通过生物相容的提取方法（最常见的是水洗或温和溶剂扩散）去除PFA，以获得相互连接的介孔结构。
图6展示了使用非表面活性剂孔形成剂（PFA）生成介孔二氧化硅膜的合理机制。该过程始于非表面活性剂分子的自发聚集（图6a），通过超分子[90]、[91]相互作用（如氢键、偶极-偶极吸引和其他极性分子关联）。来自硅烷或硅酸盐前体的硅物种随后在有机聚集体周围发生水解、缩合和聚缩合反应，形成临时的硅-有机界面框架（图6b）。最后，通过生物相容的提取方法（通常为水洗或温和溶剂扩散）去除有机模板，得到连续的介孔二氧化硅膜。
为了确定孔隙率增强后的有效扩散率，Abdulmumin等人 [38] 通过数值方法解方程式3，发现传统微孔二氧化硅涂层胶囊和介孔二氧化硅涂层胶囊中的葡萄糖扩散率分别为 (3.04 ± 0.09) × 10⁻³ mm²/min（G-0）和 (7.77 ± 0.57) × 10⁻³ mm²/min（G-3），表明膜扩散率提高了2.6倍。这表明改善微观结构（如膜孔隙率）可以显著提高基质扩散率。
天然聚合物通常具有较高的孔隙率（表4），从而增强内部质量传递。相比之下，合成聚合物如聚乙烯醇（PVA）虽然机械稳定性和结构坚固，但通常具有较低的天然孔隙率。通过混合天然聚合物和合成聚合物制成的复合材料可以在孔隙率和机械稳定性之间找到平衡。如前所述，聚合物-无机复合材料通常提供更好的机械强度；然而，这种改进常常伴随着孔隙率降低或结构密度增加。尽管如此，新兴工程材料通过精心设计的微观结构提供了实现更高孔隙率的机会。例如，据报道氧化铁（Fe₂O₃）处理可以改变孔结构并提高孔隙率 [52]。类似地，工程化的膜系统也可以被定制来提高有效扩散率 [38]。这些微观结构修改直接影响有效基质传输，并最终决定生物乙醇生产力。
表4. 不同用于生物乙醇发酵的固定化材料的微观结构扩散参数和乙醇生产力。
材料类别 | 孔隙率 ε（–） | 曲折度 τ（–） | 估计的D_e / D_bulk（–） | 扩散机制（φ趋势） | 乙醇生产力范围（g/L·h）
-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-------------------|
天然聚合物（藻酸盐）| 0.70–0.90 | 2.0–4.0 | 0.18–0.45 | 中等，但在大颗粒中φ较高 | 0.70–1.07 | Ledesma-Durán等人[10]，[92] |
合成聚合物（PVA）| 0.40–0.65 | 1.8–3.0 | 0.13–0.36 | φ中等；由于孔径较小导致D_e降低 | 0.55–0.80 | [45]，[93] |
有机-有机复合材料（PVA–藻酸盐）| 0.55–0.80 | 1.5–2.5 | 0.15–0.43 | 扩散与反应平衡；φ通常约为 | 0.70–0.95 | Bailey, Ollis [44]，[94] |
有机-无机复合材料（藻酸盐–壳聚糖–二氧化硅）| 0.40–0.75（可调）| 1.3–2.5 | 0.16–0.48（介孔 > 密集） | 密集涂层：φ升高；介孔：φ降低 | 0.75–1.05 | Bailey, Ollis [37]，[94] |
新材料（增强复合材料或纳米结构系统）| 0.50–0.80 | 1.1–1.8 | 0.28–0.73 | φ较低（<1）；反应控制 | 0.95–1.125 | [52][54] |
曲折度是另一个影响有效扩散率的关键微观结构参数（图5b (III)；方程式4）[15]。在曲折度高的材料中，基质扩散路径变长且复杂，增加了内部质量传递阻力。相反，具有简单和直接孔结构的材料表现出较低的曲折度，因此扩散路径长度较短。天然聚合物系统通常显示中等到相对较高的曲折度（τ ≈ 2.0–4.0），主要是由于它们不均匀且缠结的聚合物网络。然而，曲折度并不是有效扩散率的唯一决定因素。尽管它们的τ值相对较高，但由于孔隙率较高、亲水性和生物相容性，天然聚合物通常保持有利的有效扩散率。相比之下，合成聚合物由于其更均匀和紧凑的结构，通常表现出较低的内禀曲折度（表4）。因此，混合天然聚合物和合成聚合物可以平衡曲折度和孔隙率。聚合物-无机复合材料可以通过引入刚性框架来进一步改变曲折度，从而修改孔连接性和通道几何形状。但是先进的材料工程策略现在可以实现曲折度设计。例如，Ledesma-Durán等人 [92] 成功控制了纤维形状和空间排列，简化了孔结构并减少了扩散路径的复杂性。虽然根据方程式4，曲折度理论上会影响有效扩散率，但在理论和实验研究中，孔隙率往往对扩散率有更主导的影响（表4）。
膜厚度是显著影响质量传递的关键微观结构参数（图5b (II)；方程式6）。膜厚度的增加延长了扩散路径长度，从而延长了基质到达胶囊内活性部位所需的时间。因此，较厚的膜通常导致有效扩散率降低和整体反应速率降低。Kurayama等人 [21] 报告称，胶囊壳层厚度强烈依赖于核心溶液中的初始CaCl₂浓度以及凝胶形成过程中的反应时间。换句话说，仔细优化CaCl₂浓度和交联时间可以生产出壳层厚度较低的胶囊（图5b(II)），从而提高基质扩散和改善质量传递性能。
膜厚度也可以通过在胶囊涂层过程中战略性地选择二氧化硅前体来调节。如前所述，常用的二氧化硅来源是硅烷偶联剂，如3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）。然而，APTES通常需要引入额外的负电荷层以促进带正电的硅物种的吸附。此外，与APTES相关的多步涂层过程可能会由于长时间处理和化学暴露而对封装的微生物造成生理压力。相比之下，烷氧基前体如四乙基正硅酸盐（TEOS）可以直接在藻酸盐-壳聚糖胶囊上形成二氧化硅，从而形成更简单的Ca-藻酸盐-壳聚糖-二氧化硅结构。这种简化的涂层策略预计可以产生更薄的膜（图5b(II)），从而降低扩散阻力，提高质量传递效率，并减少细胞压力。
另一个显著影响质量传递的重要微观结构参数是颗粒尺寸（R）。颗粒尺寸通过无量纲的质量传递参数Thiele模量（ϕ）与有效扩散率直接相关，ϕ表示内在反应率与扩散率的比率。当ϕ较高时，扩散限制占主导地位，导致显著的内部质量传递阻力 [16]、[18]、[19]、[20]。
如方程式（5）所示，Thiele模量与颗粒半径（R）成正比，与有效扩散率（De）的平方根成反比。因此，减小颗粒尺寸会降低ϕ。较低的ϕ可以减少内部基质浓度梯度，提高效率因子（η），并增强观察到的乙醇生产力。关于生产更小胶囊的策略的详细讨论在后续部分提供。
具有传统微观结构的胶囊通常由于内部质量传递限制而表现出较低的生物乙醇生产力。数学建模和实验研究表明，单参数修改（如调整孔隙率、曲折度、膜厚度或颗粒尺寸）可以在一定程度上提高生物乙醇产量。双参数优化进一步提高了质量传递性能和生物生产效率。然而，同时多参数微观结构优化通过集体最小化多维扩散阻力并最大化基质可及性，实现了最高的整体性能。尽管文献中有许多研究调查了单个微观结构参数对扩散和生产力的影响，但系统地整合和优化所有关键微观结构因素的综合性研究仍然有限。这类综合研究对于实现最高效的生物乙醇生产系统至关重要。
4.3. 规模放大挑战
成功放大需要保持质量传递效率、胶囊稳定性和流体动力学条件之间的平衡。增大反应器尺寸会放大扩散限制和机械应力，这可能会降低实验室规模观察到的性能优势。因此，放大策略必须考虑胶囊设计参数（如直径、膜厚度和孔隙率）和反应器操作条件（包括混合强度和流动模式）。为了解决胶囊的限制，已经开发了多种方法，每种方法都具有独特的优势（图7）。Gao等人 [95] 描述了一种具有13个喷嘴的新多喷嘴系统，利用层流喷射破碎原理。这不仅允许大规模生产，还生产了直径从0.2到1 mm的钙藻酸盐珠子。Homayouni-Rad等人 [96] 报告了一种涉及通过200微米大小孔的内部的和外部相的共挤出方法的最新进展，产生了115–550微米的胶囊尺寸分布。Schutzman [97] 报告了通过空气喷射雾化工艺实现了1–50微米的更小尺寸分布。[98] 审视了振动喷嘴技术，以生产具有狭窄尺寸分布的单分散、形状均匀的胶囊。此外，喷射破碎技术 [99] 研究了用于商业应用的高性能和可扩展的脂肪酶固定化方法，用于生产含有捕获的级联脂肪酶酶的微胶囊。Guzmán-Martínez等人 [99] 详细描述了连续生产直径从250到1000微米的珠子的过程。
图7. 基于挤出方法的新型封装技术用于液滴形成：(a) 多喷嘴挤出用于高通量液滴生成，(b) 由电场力驱动的静电挤出，(c) 喷射切割挤出产生均匀液滴，(d) 振动频率挤出用于控制尺寸的液滴，(e) 同轴/共挤出挤出实现核-壳液滴结构。
胶囊尺寸显著影响生物反应器中的质量传递阻力、机械稳定性和流体动力学行为。较大的胶囊往往导致底物和产物的扩散路径更长，这可能会降低反应速率；而较小的胶囊虽然扩散距离较短，但在混合过程中可能更容易受到机械损伤。因此，通过改进简单的滴加方法（如多喷嘴、静电力、喷射切割、共挤出或频率生成）来实现小微球的大规模生产是一个目标。除了微球的大规模生产挑战外，生产纳米球并进一步扩大规模也同样具有挑战性。已经开发了几种方法来克服这些限制，包括离心纺丝、冷冻干燥、Bubbfil纺丝和电纺丝。离心纺丝是一种从多种材料生产纳米纤维的有效方法。在离心纺丝过程中，聚合物溶液或聚合物熔体从旋转的纺丝头中喷出，当离心力克服了聚合物液体的表面张力时，聚合物射流会经历拉伸过程，并最终沉积在收集器上，形成固化的纳米纤维[100]。在Bubbfil纺丝方法中，首先在纺丝头上形成多个聚合物气泡，然后施加外力使气泡立即破裂，从而调整纤维直径[101]。由于水的作用，制备的纳米球容易降解，因此提出了使用冷冻保护剂进行冷冻干燥的方法[102]。在这些纳米球制备技术中，同轴电纺丝是最广泛使用的方法，因为它可以从多种不同的材料中生产出具有高表面积与体积比的生物催化剂，同时还可以轻松设计用于特定应用的多层核心-鞘结构纳米球[103]。
除了胶囊尺寸分布外，生物反应器中的流体动力学行为也是封装微生物系统扩大规模时的另一个主要挑战（见表5）。在工业生物反应器中，封装的颗粒与复杂的流体动力环境相互作用。搅拌、通气和流体循环模式会影响胶囊悬浮、混合效率以及碰撞频率。混合不足可能导致胶囊沉降，从而造成底物分布不均和局部营养耗尽。相反，过度搅拌可能会增加剪切力和碰撞力，损害胶囊并破坏其结构完整性。因此，扩大封装发酵系统的规模需要优化叶轮设计、搅拌速度和反应器几何形状，以确保充分的混合同时最小化对胶囊的机械应力。
表5. 微生物封装系统的扩大规模挑战
| 扩大比例 | 工程问题 | 对发酵性能的影响 | 可能的缓解策略 | 参考文献 |
|---------|---------|----------------|-------------|---------|
| 胶囊尺寸分布 | 大规模生产时珠子直径不均匀 | 扩散距离不均匀和反应速率不稳定 | 振动喷嘴封装、静电液滴生成 | Homayouni-Rad等人 [96] |
| 质量传递限制 | 通过胶囊膜的扩散阻力增加 | 底物利用率降低，发酵速率减慢 | 优化膜孔隙率和胶囊直径 | Zhang等人 [104] |
| 流体动力学应力 | 搅拌反应器中的剪切力和胶囊碰撞 | 胶囊损伤，细胞泄漏 | 优化搅拌速度，叶轮设计 | Bailey, Ollis [94] |
| 颗粒沉降 | 混合不足导致胶囊沉淀 | 局部营养耗尽 | 改进混合或流化系统 | Bechtold, Panke [105] |
| 流体动力环境差异 | 不同的流体动力学环境 | 质量传递和稳定性变化 | 选择合适的反应器类型（填充床、流化床、搅拌罐） | Bechtold, Panke [105] |
已经探索了几种反应器设计，包括：搅拌罐反应器[106]、填充床反应器[19]、流化床反应器[107]、浆料反应器[105]和空气提升[108]反应器。每种配置都有其独特的优缺点。例如，填充床反应器提供了低剪切环境，但可能存在通道效应和质量传递限制；而搅拌罐反应器虽然混合效果较好，但可能会使胶囊承受更高的机械应力。流化床和浆料反应器可以通过改善颗粒悬浮来增强质量传递，但需要仔细控制流体速度以防止颗粒流失。选择合适的反应器配置对于实现封装微生物系统的稳定长期运行至关重要。
封装微生物系统的扩大规模还可以利用生化工程中常用的无量纲数来分析流体动力学和质量传递行为[94]。这些参数有助于将实验室规模的观察结果与工业反应器条件联系起来。例如，雷诺数（Re）描述了生物反应器中的流动状态，决定了胶囊运动是在层流还是湍流条件下进行。较高的雷诺数通常能改善混合和颗粒悬浮，但也可能增加流体动力学剪切力，从而加速胶囊损伤。可以使用谢伍德数（Sh）来评估胶囊周围的质量传递性能，该数将对流质量传递与分子扩散联系起来[104]。谢伍德数常与雷诺数和施密特数（Sc）一起使用，以描述底物从液体整体到胶囊表面的传输过程。高效的底物输送需要足够高的谢伍德数来克服通过胶囊膜的扩散限制。另一个重要参数是达姆科勒数（Da），它表示生化反应速率与质量传递速率的比率。如质量传递部分所述，当达姆科勒数较大时，反应速率超过底物扩散速率，表明质量传递限制主导了系统性能；较小的达姆科勒数则表示反应动力学控制了过程。这些无量纲参数为设计和优化扩大规模后的封装发酵系统提供了有用的工具，因为它们允许工程师评估混合、扩散和反应动力学在大规模生物反应器中的相对贡献。
尽管实验室规模的研究显示封装微生物系统具有更好的稳定性和生产力，但由于扩散限制、机械应力和复杂的反应器配置，这些优势在工业规模上可能会减弱。因此，解决这些限制对于成功地将封装微生物系统从实验室规模扩大到工业规模至关重要。
4.4. 成本挑战
固化过程增加了一个额外的步骤，提高了整体生产成本。为了抵消这些费用并使过程在经济上可行，必须采取几种策略（见表6）。
表6. 生物乙醇生产中微生物封装的成本效益生物工艺策略
| 策略 | 机制 | 优点 | 权衡 | 参考文献 |
|--------|------|------|------|---------|
| 多次重复使用胶囊（多批次操作） | 分散胶囊制造成本 | 7-10批次及以后的稳定生产力 | [109]、[110]、[111]、[112] |
| 连续乙醇生产（填充床、流化床、CSTR系列） | 消除批次重启成本；持续运行时间 | 高时空产量；工业可行性 | [113]、[114]、[115]、[116] |
| 低成本底物（木质纤维素水解物、农业残余物、废料原料） | 替代精制糖；降低原料成本 | 高可用性；符合循环经济 | [117]、[118]、[119] |
| SSF（同步糖化与发酵） | 将水解和发酵合并到一个反应器中 | 能源消耗更低，单元数量减少，转化更快 | [120]、[121]、[122] |
| 生物精炼概念 | 集成多产品增值（化学品、燃料、材料） | 成本分布在副产品中；经济性提高 | [123]、[124]、[125] |
| 共固化（全细胞+酶或混合微生物菌群） | 每单位质量的生物催化剂转化率更高 | 动力学协同效应；有效生产力更高 | [126]、[127]、[128] |
| 生物反应器流体动力学优化（控制搅拌<180 rpm、流动调节、α/迂曲度控制） | 减少剪切引起的脱落；降低机械损耗 | [116]、[129]、[130] |
| 低成本载体（木质纤维素残余物、农业残余物、废物衍生的生物聚合物，如生物炭、纤维素浆、半纤维素凝胶） | 作为固化基质 | 避免合成或高纯度聚合物的购买；将废物转化为有价值的生物催化剂支持 | [131] |
| 固态发酵（使用不含游离液相的湿润固体原料） | 减少工艺用水量，缩小反应器尺寸和灭菌能耗 | [132] |
| 合成生物精炼 | 在一个反应器中同时进行水解和发酵 | 减少酶成本，单元操作减少，过程简化 | [133]、[134] |
| 细胞基因工程 | 促进酶共表达和耐受性 | 减少外部酶的添加，降低催化剂更换成本，操作更快，提高对低成本原料的耐受性 | [135]、[136]、[137] |
表6中列出的一些策略包括多次重复使用胶囊（多批次操作）和连续使用胶囊（通过硅胶涂层等固化载体），这些策略有助于降低成本并提高生产效率。例如，Kurayama等人[21]、Pannier等人[27]和Xu等人[28]通过改良藻酸盐基载体使其能够连续使用十次。其他人则利用固化载体在连续过程中延长使用时间[60]、[139]、[140]。连续生物乙醇生产通常通过填充床反应器（PBRs）、流化床反应器（FBRs）和浆料反应器实现。每种配置在流体动力学、质量传递和扩大规模方面都有不同的影响。PBRs的一个关键优点是它们能够保持高细胞密度和塞流行为，从而提高体积生产力[139]。然而，其主要局限性在于压力降，其比例约为：ΔP∝L/d²p，其中ΔP是压力降，L是床层高度，dp是颗粒（胶囊）直径。这种比例关系源于Ergun关系，在低雷诺数下粘性项占主导。因此，减小胶囊直径（以改善内部扩散并降低Thiele模量）会显著增加压力降，而增加床层高度（以延长停留时间）会进一步放大ΔP。这造成了一个基本的扩大规模权衡：较小的颗粒可以提高质量传递（较低的φ值，较高的有效性系数η），但会指数级增加压力降和泵送能量。此外，高ΔP可能会压缩软质凝胶胶囊，改变其微观结构（孔隙率和迂曲度），从而降低有效扩散性De。因此，尽管PBRs在机械上简单且应用广泛，但其可扩展性受到流体动力学阻力和大床层高度下的机械压缩效应的限制。
FBRs的主要优点是外部质量传递得到增强，因为颗粒悬浮在最小流化速度（Umf）以上[105]。流化作用增加了流体和颗粒之间的相对速度，提高了谢伍德数和外部质量传递系数kl。因此，外部扩散阻力降低。可以使用较小的胶囊而不会导致过高的压力降。更重要的是，一旦实现流化，压力降几乎独立于床层重量与横截面积的比值，消除了填充床中出现的二次ΔP问题。然而，FBRs由于颗粒间的碰撞和流体动力作用会产生机械应力。因此，胶囊必须具有足够的机械强度（例如， silica涂层或复合材料结构）以承受磨损和变形。流化系统特别适合直径较小但机械强度较高的颗粒，此时质量传递的好处超过了机械风险。对于更小的颗粒尺寸，则使用浆料反应器[105]。在浆料系统中，颗粒通过机械搅拌完全悬浮，提供非常高的外部质量传递系数、均匀的底物浓度和最小的轴向压力降。然而，工业规模下的搅拌能量需求显著增加。因此，单位体积的功率输入可能超过流化床。此外，高剪切率可能会损坏脆弱的胶囊。
虽然PBRs由于操作简单而具有吸引力，但扩大规模需要仔细管理床层高度和颗粒尺寸以控制压力降。如果能够缓解机械稳定性问题，流化床反应器由于质量传递和压力降的改善，提供了一个更先进且可扩展的解决方案。对于非常小且机械强度较高的颗粒，浆料反应器是一个可行的选择。表6还表明，结合使用基于废物的底物、废物衍生载体、反应器强化、SSF（同步糖化与发酵）和共固化等互补策略可以提高成本效益。固化的成本挑战与之前讨论的三个主要挑战（稳定性、质量传递阻力和可扩展性）密切相关。更稳定的载体可以实现多次重复使用和延长运行时间，从而将固化成本分散在更长的时间内，提高盈利能力。同样，高孔隙率的载体可以减少质量传递阻力，从而在产量、转化率和生产力方面实现更高效的发酵，最终提高成本效益。扩大规模的挑战也直接影响成本——如果固化载体的大规模生产高效，那么固化的总体成本将显著降低。
为了评估财务影响，表7定性地比较了自由系统和封装系统。虽然自由细胞系统由于初始生物催化剂制备成本较低以及搅拌罐配置较为简单而具有优势，但它们受到细胞保留率低、只能单次使用、下游生物质分离要求较高以及污染风险增加的限制。表7. 自由细胞与封装生物乙醇发酵系统的定性技术经济比较。
| 参数 | 自由细胞发酵 | 封装系统 | 参考文献 |
|-----------|----------------|-------------|---------------------------|
| 初始生物催化剂成本 | 低 | 中等至高（1.5–3倍自由细胞成本）| Darmayanti等人，[141] |
| 反应器配置 | 搅拌罐 | 堆积床、流化床、混合系统 | Najafpour等人，[60] |
| 细胞保留率 | 有限 | 高 | Islam Shishir等人，[142] |
| 细胞重复使用率 | 低 | 高（2–5次循环或更多） | Herkommerová等人，[71] |
| 污染风险 | 中等至高 | 较低（物理屏障效应） | Alftren等人，[143] |
| 下游分离成本 | 较高（需要去除细胞） | 较低（细胞被保留在胶囊中） | Assaf等人，[144] |
| 体积生产力 | 中等 | 中等至高（取决于φ和D_e） | Inal, Yigitoglu [145] |
| 扩大规模复杂性 | 低（成熟技术） | 中等（流体力学+扩散耦合） | Lin等人，[146] |
| 质量传递限制 | 主要外部 | 内部+外部 | AL-Muftah, Abu-Reesh [147] |
| 压降问题 | 最小 | 堆积床中显著 | Patel等人，[139] |
| 机械稳定性要求 | 低 | 流化床反应器关键 | Velichkova等人，[107] |
相比之下，封装系统引入了更高的前期材料和制造成本（通常为自由细胞制备成本的1.5–3倍），并且反应器设计更为复杂，尤其是在浆液或流化床配置中。然而，这些成本部分被增强的细胞重复使用性（多次操作循环）、提高的细胞密度、减少的下游澄清要求以及改善的长期运行稳定性所抵消。尽管如此，对采用固定化技术的生物乙醇生产进行全面的技术经济分析仍然是必要的。虽然最近的研究已经开始解决这个问题（例如，Pinheiro等人[148]对使用固定化重组酿酒酵母的乙醇生产进行了技术经济和生命周期评估），但跨不同固定化材料、反应器设计和原料的系统性和比较性分析仍然有限。这突显了在这一方向上进一步研究的必要性。
5. 结论
本综述综合了目前微生物封装技术在生物乙醇生产中的最新进展，特别关注胶囊微观结构与传输现象及发酵性能之间的联系。虽然微生物封装的扩散限制仍然是一个挑战，但本综述中提出的微观结构合成方法，尤其是介孔二氧化硅涂层的使用，有望缓解这一挑战。综述强调了可扩展的胶囊制备方法，如多喷嘴挤出、共挤出、振动喷嘴系统和气流雾化技术，这些方法能够生产出1–1000微米范围内的微胶囊，从而减少与较大胶囊尺寸相关的扩散限制。通过创新策略（如光化学反应交联、N-乙烯基-2-吡咯烷酮修饰、介孔二氧化硅涂层、甲基丙烯酸修饰的藻酸盐珠和纳米多孔PLLA微管阵列膜（MTAM））可以提高固定化载体的稳定性。在分析的所有研究中，乙醇产量的较高值约为0.40–1.125克/升·小时，这通常与通过优化孔隙率、减少迂曲度和缩小胶囊尺寸来最小化内部扩散阻力的封装结构相关。未来的研究应侧重于技术经济分析和创新材料——这些领域目前尚未得到充分探索。如果这些固定化挑战能够得到有效解决，该过程不仅能够弥补其1.5–3倍的额外成本，还能实现经济可行性。食品和饮料业以及制药业分别在益生菌封装和药物递送系统中成功应用封装技术，这应该为生物乙醇生产行业实现类似的成功提供了鼓励。
**CRediT作者贡献声明**
Abdulwasiu Abdurrahman：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，资源管理，数据管理。
Abdulmumin Bilyamin：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，项目管理，方法论，概念化。
Abdullahi Jibril：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，资源管理，数据管理。
**关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明**
在准备本工作时，作者使用了GPT-4来提高文本的清晰度和可读性，并使用Grammarly检查语法准确性。在使用这些工具后，作者对内容进行了彻底的审阅和编辑，并对最终版本的手稿负全责。
