马赞·优素福 | 拉维库马尔·拉贾拉辛南 | 奥尔温·埃比内萨尔·雅各布·塞缪尔·塞哈尔
生物技术系，Vel Tech Rangarajan Dr Sagunthala 科学与技术研究与发展研究所，金奈，泰米尔纳德邦 600062，印度
**摘要**
石油焦（PC）是一种富含碳的固体副产品，在石油精炼过程中大量产生，给石油工业带来了显著的环境和处置挑战。本研究探讨了使用来自煤矿的微生物群落，在碱性预处理前后，通过厌氧消化将PC作为生物甲烷生产底物的潜力。该微生物群落通过宏基因组分析进行了开发和表征，而PC的结构和物理化学变化则通过X射线衍射（XRD）、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜结合能量分散X射线（SEM-EDX）、电感耦合等离子体（ICP）-碳、硫、氧、氢和氮（CSOHN）以及微傅里叶变换红外光谱（μ-FTIR）技术进行了检测。碱性预处理使用氢氧化钠（NaOH）浓度范围为0.5至2.0 M。宏基因组分析显示，Arcobacter、Mesotoga（16%）、Paracoccus（9%）、Clostridium、Clostridioides、Desulfovibrio、Desulfomicrobium、Pseudomonas和Flavobacterium等菌属在厌氧条件下促进了水解、酸生成、乙酸生成和甲烷生成。DLS和XRD分析表明，石油焦的平均粒径约为344 µm，d间距为3.5 Å，平均晶粒直径为57.9 nm。SEM-EDX、ICP和CSOHN分析证实，在生物甲烷生产后有机硫和重金属（Ni、Ba、Fe和V）显著减少，表明生物浸出和脱硫效果显著。μ-FTIR分析显示存在线性烷烃链。在含有1.5 M NaOH预处理的反应器中，第30天获得了最高的甲烷浓度（32.5% v/v），表明碱性预处理显著提高了PC底物的厌氧生物降解性，并为这种难处理原料的生物甲烷生产提供了机制上的见解。
**1. 引言**
工业的指数级增长和现代城市化导致了大量有机污染物和污泥的形成。未经处理的废水污泥中含有多种有毒重金属、化学物质和微生物，对水生生态系统构成威胁[1]。作为炼油厂废物，PC具有与其他石化残留物的共同特征，含有复杂的烷烃和芳香烃、重金属以及难处理的有机化合物，这使得传统的处理和处置方法变得复杂[2]。然而，这种废物流也代表了一种未开发的能源资源，可以通过适当的生物技术手段转化为有价值的生物燃料。
涉及微生物将复杂有机碳转化为甲烷的生物甲烷化过程为像PC这样的难处理碳质材料的增值提供了一种有前景的废物转能源途径。该过程利用水解菌、发酵菌、乙酸生成菌和甲烷生成菌的联合体，通过已建立的生化途径逐步将复杂底物分解为甲烷[3][4]。作为替代化石燃料和减少温室气体排放的方法，沼气和生物甲烷正受到科学研究的关注，旨在替代基于化石的燃料[5]。国际能源署（IEA）报告称，如果能够有效维持沼气和生物甲烷的生产，全球约20%的天然气需求可以得到满足[6]。通过厌氧细菌对废水污泥中的有机物进行厌氧消化，可以产生沼气和生物甲烷[7]。
厌氧消化在从污泥中生成生物甲烷方面具有重要意义。然而，其有机负荷率低、稳定性差、转化效率低以及消化后金属积累等问题限制了该技术的发展[8]。因此，使用生物炭、石墨烯、碳纤维、磁铁矿和活性炭等可持续材料可以增加生物甲烷的产量[9]。最近，PC（一种存在于煤水浆中的残留成分，类似于生物炭）被认为是一种有效的生物甲烷生成底物[10]。最新研究表明，通过微生物降解过程可以从煤炭和其他碳质材料中生产生物甲烷。例如，对富含焦油的煤炭进行厌氧消化可以产生可测量的甲烷产量，并导致煤炭基质的结构变化，包括孔隙结构和芳香化合物的降解[11][12]。例如，在中温污泥消化实验中，向厌氧反应器中添加1.5 g·L⁻¹的PC可使沼气产量增加23.40%，甲烷产量增加42.55%[2]。此外，经过化学预处理的煤炭底物结合生物强化技术在实验室条件下可实现高达约1350 μmol CH₄·g⁻¹的甲烷产量，表明当溶解度得到优化时具有巨大的能源回收潜力[13]。PC的元素组成和物理化学特性对其厌氧消化有积极影响。
PC的难处理性质和复杂的芳香结构需要有效的预处理，以提高其生物利用度和水解速率，这些通常是限制碳质底物生物甲烷化的因素。使用氢氧化钠（NaOH）进行碱性预处理已被证明对多种难处理原料有效，可以分解复杂结构，增加可溶性有机组分，并提高甲烷产量[14]。例如，通过碱性处理对煤炭和褐煤进行化学解聚，可以有效将其转化为低分子量有机物和短链脂肪酸，从而便于微生物群落代谢[15]。添加NaOH通过将煤炭中的高分子量成分分解为低分子量芳香化合物，提高了煤炭的溶解度，从而促进了后续的微生物降解，提高了生物甲烷产量[16]。
厌氧消化过程利用了一组特定的微生物，如水解菌、酸生成菌和甲烷生成古菌，实现厌氧降解反应[17]。来自煤矿的厌氧微生物特别适合用于预处理后的PC的生物甲烷化，因为它们天然适应于降解难处理的碳质材料。这些微生物群落包含多种发酵菌（如Bacillus、Gracilibacter以及各种Firmicutes和Proteobacteria）以及甲烷生成古菌（如Methanothermobacter、Methanobacterium、Methanococcus和Methanosarcina）[18][19]。富集的煤源微生物群落在实验室研究中表现出色，其中一个富集的烟煤联合体产生了243.3 μmol CH₄·g⁻¹的甲烷产量，比对照组高出12.3倍[18]。这些适应煤炭的微生物具有专门的酶和代谢途径，能够在典型的厌氧中温条件下有效降解杂环和多环芳香化合物，并在富集和生物强化研究中显示出显著的甲烷生产能力[20]。当预处理后的PC被送入厌氧消化器时，底物与微生物细胞之间会发生直接的种间电子转移，从而改善厌氧消化，最终提高生物甲烷转化效率[21][22]。
尽管有这些有希望的基础，但仍存在重大挑战和知识空白。化学预处理过程的经济可行性需要优化能源和化学成本[23]，而营养限制（特别是Co、Cu和Mo等微量元素）可能会限制微生物活性和甲烷产量[24]。最关键的是，目前文献中缺乏将NaOH预处理后的PC与来自煤矿的厌氧微生物群落直接结合的实验证据。这一研究空白为将经过验证的预处理策略与专门的微生物接种剂相结合，开发有效的PC增值生物转化过程提供了重要机会。
当前的研究工作旨在探讨在来自炼油厂的厌氧微生物存在下，对煤水浆中的石油焦进行预处理对生物甲烷生产的影响。在标准温度条件下，通过改变NaOH浓度对PC进行了预处理。使用宏基因组分析研究了来自煤矿现场的微生物群落。此外，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和化合物氮源对未经处理的和预处理的PC产品进行了表征，以了解生物甲烷生成过程中的结构变化和生化反应效率的提高。
**2. 材料与方法**
2.1. 材料
PC（5 kg）从Chennai Petroleum Corporation Limited（CPCL，印度金奈）采购。氯化钾（KCl）、六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）、七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、氯化铵（NH₄Cl）、二水合氯化钙（CaCl₂·2H₂O）、氯化钠（NaCl）和醋酸钠（CH₃COONa）从Merck（印度孟买）购买。磷酸氢钾（K₂HPO₄）、碳酸氢钠（NaHCO₃）、酵母提取物、Wolin维生素溶液、L-半胱氨酸-HCl·H₂O和九水合硫化钠（Na₂S·9H₂O）从SRL Chemicals（印度）购买。胰蛋白酶胨从HiMedia Laboratories（印度）和BD BBL（美国）获得。改良的Wolin矿物溶液和硫酸亚铁[Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O]溶液（0.1% w/v）由Merck提供。亚甲蓝钠盐溶液（0.1% w/v）从SRL Chemicals采购。所有溶液均使用去离子水（Millipore，电阻率为18 MΩ·cm）配制。
2.2. 样品制备
收集的PC样品在45°C下使用托盘干燥机干燥6小时。然后将干燥后的PC用粉碎机研磨，通过120目筛网筛分，得到用于进一步研究的PC粉末。对石油焦粉末样品进行了最终分析，以检测和量化CSOHN（碳、硫、氧、氢和氮）。为了研究PC的粒径，进行了动态光散射技术；将0.5 g样品分散在100 mL去离子水中，并在5脉冲/秒的频率下超声处理15分钟。样品的制备方式确保分散液稳定且无沉淀。使用DLS粒径分析仪（Malvern，德国）评估粒径。
2.3. 培养基制备
使用甲烷生成富集培养基（MEM）培养甲烷生成菌。培养基的配方为：0.34 g KCl、4 g MgCl₂·6H₂O、3.45 g MgSO₄·7H₂O、0.25 g NH₄Cl、0.14 g CaCl₂·2H₂O、0.14 g K₂HPO₄、1 g CH₃COONa、5 g NaHCO₃、2 g 酵母提取物和2 g 胰蛋白酶胨，溶于800 mL去离子水中。将培养基的pH值调整至7，然后加入去离子水至1000 mL。之后，加入维生素溶液和L-半胱氨酸作为注射器过滤灭菌的补充剂，将厌氧培养基在121°C和15 psi下高压灭菌。为了建立无氧环境，用氮气（N2）和二氧化碳（CO2）的不同比例混合物对培养基进行吹扫：对于甲烷生成菌为80%氮气和20%二氧化碳，对于氢营养型甲烷生成菌为80%氢气和20%二氧化碳，直到培养基变为无色。随后，将制备好的培养基转移到手套箱中以维持厌氧条件进行培养。向培养基中加入亚甲蓝试剂以指示氧气的存在，使其变红[25][26]。
2.4. 接种物制备
本研究中使用的微生物物种是从印度安得拉邦Singareni Collieries煤矿现场采集的样品中分离得到的。在分离过程中，最初将1 g煤炭土壤样品加入50 mL灭菌的甲烷生成培养基中，置于100 mL血清瓶中，在37°C下培养28天。通过多次传代培养获得纯化且生长良好的菌落。在5个血清瓶中，选择释放最多生物甲烷的菌落作为PC生物甲烷化的接种物。之后，将分离出的菌种划线接种到MEM固体斜面上，并在4°C下保存。重复传代培养3-4次以获得生长良好的菌株。最终，使用这些生长良好的细胞进行甲烷生成过程。通过宏基因组分析验证了分离出的微生物物种的遗传信息和物种名称。所有操作均在厌氧手套箱中进行，以维持厌氧条件。
2.5. 宏基因组分析
2.5.1. DNA提取、PCR扩增和下一代测序（NGS）
使用QIAGEN试剂盒按照制造商的协议提取细菌基因组脱氧核糖核酸（DNA）。对于Illumina Miseq系统（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）的测序，使用含有通用引物的2x300PE v3测序试剂盒扩增16SrRNA基因的V3-V4变异区域，该引物可以同时检测细菌和古菌。然而，这些引物通常对细菌的覆盖度更高，因此细菌序列在结果数据集中占主导地位。使用40 ng的提取DNA和每种引物10 pM进行扩增。使用16S正向引物（5’ AGAGTTTGATGMTGGCTCAG3’）和16S反向引物（5’ TTACCGCGGCMGCSGGCAC3’）进行扩增。PCR条件为：(a) 初始变性95°C 3分钟；(b) 然后25个循环：(i) 最终变性95°C 15秒；(ii) 退火60°C 15秒；(iii) 延长72°C 2分钟；(iv) 最终延伸72°C 10分钟；(v) 4°C保持。扩增产物随后用Ampure珠子纯化，以去除未反应的引物。进行了额外的8轮PCR（在上述相同条件下），使用Illumina条形码适配器按照[27]中描述的方法制备测序文库。生成的文库随后使用Ampure珠子进行纯化，并使用Qubit dsDNA高灵敏度检测试剂盒进行定量，最终使用Illumina Miseq系统进行测序。
2.5.2. 微生物组分析的生物信息学协议
原始序列数据使用FASTQC和MULTIQC进行质量控制，然后修剪适配器。通过使用通用引物扩增16S rRNA基因的V3–V4区域来进行微生物群分析，这些引物可以检测细菌和古菌的分类单元。然而，这些引物通常对细菌的覆盖度更高，因此细菌序列在TRIMGALORE处理后的数据集中占主导地位。修剪后的读段随后经过处理，包括配对末端合并、嵌合体去除以及OUT丰度计算和校正，这些步骤是通过QIIME / MOTHUR / KRAKEN / BRACKEN软件完成的。这使得在属水平上进行高度准确的评估成为可能。用于分类变异序列的数据库包括SILVA、GREENGENES和NCBI。每个读段根据覆盖率和服务进行分类。统计分析从科到属的层次进行，以测试α和β多样性，这些多样性指标反映了样本变异之间的距离。然后生成热图，通过层次聚类展示了分类结果。
2.6. 基底的碱性预处理
根据Guo等人的方法[16]，碱性预处理可以去除木质素，增加石油焦的孔隙率和表面积。在此过程中，将已知量的5克石油焦加入100毫升不同的NaOH溶液（0.5 M、1 M、1.5 M和2 M）中，并将初始pH值分别调整到9、11.5、12.1和12.6。选择0.5–2.0 M的NaOH浓度范围是基于之前关于煤炭和难处理碳质材料碱性预处理的报告，这些报告表明类似的浓度可以增强基底的溶解度和生物甲烷产量。所选范围允许评估轻度、中度和高度的预处理，以确定提高甲烷产量的最佳条件。NaOH预处理后，石油焦样品经过过滤、洗涤至中性pH值，然后干燥后使用。在所有实验中，厌氧消化测试中使用了相同质量的5克基底。样品在200转/分钟的轨道振荡器中振荡12小时，以增强溶液的均匀性，如图1所示。12小时后，样品通过0.22微米过滤器过滤，并用去离子水洗涤直至达到中性pH值。此外，过滤后的石油焦样品在45摄氏度下干燥6小时，然后在用于生物甲烷化之前测定其质量。我们感谢审稿人的这一重要评论。
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图1. 未经处理和经过预处理的石油焦的处理和表征。(i) 石油焦预处理过程，(ii) 未经处理的石油焦，(iii) 经过预处理的石油焦。
因此，所报告的生物甲烷产量增加是基于相同的基底加载量，而不是基于原始石油焦中挥发性有机固体的标准化。这一澄清已添加到修订手稿的材料与方法（2.6）和4.4部分。
2.7. 生物甲烷的生产
使用Ding等人[28]改进的方法进行了生物甲烷生产的批次实验。在此实验中，将已知量的5克预处理过的石油焦加入35毫升悬浮在100毫升血清瓶中的MEM中。然后，向含有4个不同预处理样品的烧瓶中加入5毫升细菌菌群。样品用石蜡密封，并放置在手套箱内以维持室温（约25摄氏度）下的厌氧条件。在甲烷生产前后对石油焦进行了表征，以观察发生的变化。为了揭示厌氧细菌影响下同时进行的生物浸出过程，对甲烷生产前后的预处理石油焦进行了电感耦合等离子体（ICP）分析。从宏基因组分析中获得的细菌菌群与生物浸出过程相关联。使用Biogas Analyzer 5000（Geotech Instruments, UK）定期每10天测量一次生物甲烷产量，该仪器使用双红外传感器测量产生的生物气体中的甲烷（CH₄）和二氧化碳（CO₂）的体积组成。报告的生物甲烷产量代表了厌氧消化过程中产生的总生物气体中甲烷的百分比组成，并通过双红外传感器辅助参考通道进行分析。气体分析仪使用三种不同的CH4、CO2和O2混合物（比例分别为1:2:0、3:2:0和1:1:1）进行了优化。此外，使用氮气来维持平衡条件并进行校准。还进行了一个对照实验，使用未经处理的石油焦（未经NaOH预处理）并接种相同的细菌菌群，在相同条件下评估内在的产甲烷活性和碱性预处理的增强效果。甲烷产量作为气体组成（%）随时间进行监测，而不是最初表示为特定甲烷产量（mL CH₄·g⁻¹基底），因为分析仪直接报告甲烷浓度。
2.8. 石油焦的表征
进行了XRD分析，以研究未经处理和经过预处理的石油焦的结晶度变化和形态指数变化。使用X射线衍射仪（Thermo Scientific, UK）进行。使用扫描电子显微镜结合能量分散X射线分析仪（SEM-EDX, Quanta, UK）研究了金溅射样品的表面形态和元素分布。使用FTIR光谱仪（Agilent Technologies, USA）探讨了参与生物甲烷化的石油焦样品中的官能团。光谱是在4000至400 cm⁻¹范围内扫描获得的。还使用微FTIR（μ-FTIR）光谱技术（FTIR-microscope, Thermo Fischer, Nicolet iS50, ATR spectrophotometer, UK）检测了经过预处理和生物甲烷生成后的石油焦的化学组成。对于ICP和CHONS（碳、氢、氧、氮、硫）分析，样品制备方法是取0.5克石油焦并与2% HNO3和1.5% 70%高氯酸混合在100毫升标准烧瓶中，最终体积为50毫升。然后将样品分配到特氟龙容器中，并在450摄氏度下加热3小时。之后，将消化后的样品冷却至室温。此外，使用电感等离子体光谱仪（Thermo Fischer, UK）[29]分析了样品中不同金属的浓度。通过生物气体分析仪（Biogas 5000 – Geotech Instruments (UK) Ltd）评估了过程中释放的甲烷和CO2的百分比。分析使用了双红外传感器辅助参考通道。气体分析仪使用三种不同的CH4、CO2和O2混合物（比例分别为1:2:0、3:2:0和1:1:1）进行了优化。此外，使用氮气来维持平衡条件并进行校准。
3. 结果与讨论
3.1. 颗粒大小的确定
图1(i & ii)展示了从煤矿收集的原始石油焦的物理形态。样品被研磨成粉末（图1(iii)）。粉末样品使用不同筛子分离。进一步地，使用120目筛子收集工作样品，并在生物甲烷生产实验前在45摄氏度下干燥6小时。这确保了原料的均匀性并去除了水分，从而提高了后续预处理和厌氧消化过程的有效性[31]。研磨后的颗粒大小约为344微米，如图2所示。研磨对于增加石油焦颗粒的表面积和促进有机物质与预处理试剂及厌氧微生物的接触非常重要。此外，减小颗粒大小可以增强厌氧消化过程中的基底和产物质量传递，从而提高生物气体产量[32]。
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图2. 经过预处理的石油焦的颗粒大小分布曲线。
3.2. XRD分析
进行了XRD分析，以评估NaOH预处理前后石油焦的晶体结构和矿物学特性，结果如图3(i–ii)和表1、表2所示。在25.53°和43.39°观察到的衍射峰证实了存在类石墨晶体相，分别对应于(002)和(110)/(101)晶格平面[33]。这些反射表明石油焦主要由石墨碳框架组成。25.5°处的峰归因于石墨的层状结构以及不同石墨化程度的碳层和层间距。同样，43.39°处的峰表明石墨结构中存在层内碳原子和湍流结构。此外，处理后石油焦的XRD中25.50°峰的宽化表明石油焦的结晶度降低和层间距的变化[34]。这主要是由于石油焦碳层中硫和其他杂质的去除。最终，表1和表2分别表示未经处理的石油焦的计算值（d间距、平均直径、表面积、体积、比表面积和形态指数为（0.35, 38.80 nm, 31,406.34 nm², 523,491.72 nm², 14.18 m²/g）和经过碱预处理的石油焦为（0.34, 57.9 nm, 31,551.80 nm², 527,132.79 nm², 14.15 m²/g）。
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图3. (i) 未经处理的和 (ii) 经过预处理的石油焦的XRD衍射图。XRD = X射线衍射。
表1. 未经处理的石油焦的d间距、直径、表面积、体积、比表面积和形态指数的评估
2θθcosθsinθFWHM (β) radβcosθ
大小, D (nm)
d间距, d (Å)
平均大小 (nm)
Sa(nm²)
Vol(nm³)
Ssa (m²/g)
Sa/Vol
形态指数
25.53
12.75
0.97
0.22
0.00
190.00
188
73.85
3.51
50.01
314
0.63
523
491.72
14.18
0.06
0.73
5.69
17.84
50.95
0.30
63
0.00
270.00
255
4.49
2.54
0.42
054
1.32
769
01.41
7.50
0.10
0.74
3.39
21.69
50.93
0.36
95
0.00
320.00
304
6.28
2.08
38.01
817
0.02
303
65.01
8.60
0.10
0.64
5.57
22.78
50.92
0.38
710.00
340.00
314
4.52
1.98
36.41
668
0.72
0263
1.11
9.50
0.10
0.65
6.58
28.29
0.88
0.47
370.00
410.00
363
8.08
1.62
34.91
528
0.91
776
667.32
0.30
10.66
6.35
33.17
50.84
0.54
700.00
480.00
403
4.70
1.40
33.11
378
4.41
522
17.72
1.40
0.10
0.5
表2. 经过碱预处理的石油焦的d间距、直径、表面积、体积、比表面积和形态指数的评估
2θθcosθsinθFWHM(β) radβcosθ
大小, D (nm)
d间距, d (Å)
平均大小 (nm)
Sa(nm²)
Vol(nm³)
Ssa (m²/g)
Sa/Vol
形态指数
11.35
5.65
0.99
0.09
80.00
086
0.00
085
162.27
82.46
659
43.25
159
2720.02
9.79
0.04
0.86
25.50
12.75
0.97
0.22
00.00
1920.00
188
73.85
3.49
50.01
314
0.63
523
491.72
14.18
0.06
0.73
43.24
21.62
0.92
0.36
80.00
3210.00
299
46.41
2.09
50.12
315
1.80
527
132.79
14.15
0.06
0.62
50.78
25.39
0.90
0.42
80.00
374
0.00
338
41.03
1.79
55.74
390
16.60
7248
66.48
12.72
0.05
0.59
55.22
760.88
0.46
30.00
4040.00
358
38.71
11.66
61.25
4711
2.13
9617
96.19
11.58
0.05
0.57
碱处理后石油焦直径的增加证实了石墨层间距的扩大，这是由于芳香化合物的分解、烷基链程度的增加、醚中C-O键的增加以及石油焦微晶性质的降低，这在XRD光谱图中得到了明确体现。NaOH预处理后观察到的层间距和晶粒直径的增加也表明石油焦的芳香碳矩阵部分破坏。这种结构松弛降低了结晶度，并引入了缺陷位点和边缘碳原子，这些位点可作为微生物酶攻击的反应中心。NaOH预处理引起的这种结构改变在提高石油焦的可生物降解性方面起着关键作用。该过程通过键断裂和轻微氧化破坏了芳香碳矩阵，引入了含氧官能团并增加了孔隙率[35]。结果，更多的低分子量有机化合物被溶解，提高了基底对微生物降解的可用性。这些变化改善了低分子量有机部分的溶解度，从而增加了基底对微生物菌群的可用性。在厌氧消化过程中，水解和产酸微生物将这些溶解的化合物转化为关键中间体，如乙酸、氢（H₂）和二氧化碳（CO₂），随后由产乙酸细菌和产甲烷古菌通过已建立的代谢途径生成甲烷[36]。类似的机制已在碱处理的煤炭[37]和其他难处理碳质基底中得到广泛报道，其中增强的溶解度显著提高了微生物的可用性和生物甲烷产量。此外，低取代的芳香化合物和醇及醚中的C-O键有助于增强微生物的攻击性，为产甲烷菌提供了更多的反应位点；Guo等人[16]也对煤炭样品进行了类似的观察。
4. 甲烷生产前后石油焦的表征结果
4.1. SEM和EDX分析
进行了SEM和EDX分析（图4(i)-(iv)），以了解甲烷生产后石油焦的形态和元素组成的变化，并与甲烷生产前的石油焦样品进行了比较。SEM图像显示，甲烷生产前的石油焦表面粗糙，而甲烷生成后的表面变得光滑。甲烷生成前的石油焦含有碳、氧、钠、镁、铝、硅、磷酸盐、硫和钙，比例分别为83.73%、8.20%、0.16%、0.08%、0.14%、0.21%、0.15%、6.74%和0.22%、0.37%。甲烷生产后，观察到碳（95.53%）、氧（1.68%）和硫（3.68%）。此外，由于微生物菌群中的脱硫机制，硫的百分比降低。处理前后元素组成的变化在表3中呈现。下载：下载高分辨率图像（382KB）下载：下载全尺寸图像
图4. 甲烷生产前后石油焦的特性：SEM和EDX图谱显示了石油焦的元素组成（i）和（ii）以及（iii）和（iv）甲烷生产后的情况。EDX = 能量分散X射线；SEM = 扫描电子显微镜。
表3. 未处理石油焦和碱预处理石油焦的元素组成
| 元素 | 线型 | 重量% | 原子% |
|------|------|------|------|
| CK系列 | 83.73 | 30.31 | 95.53 |
| OK系列 | 8.20 | 0.28 | 6.62 |
| NaK系列 | 0.16 | 0.03 | 0.09 |
| MgK系列 | 0.08 | 0.02 | 0.04 |
| AlK系列 | 0.14 | 0.02 | 0.07 |
| SiK系列 | 0.21 | 0.02 | 0.10 |
| PK系列 | 0.15 | 0.02 | 0.06 |
| SK系列 | 6.74 | 0.10 | 2.72 |
| ClK系列 | 0.22 | 0.03 | 0.08 |
| CaK系列 | 0.37 | 0.03 | 0.12 |
4.2. 电感耦合等离子体（ICP）分析
通过ICP分析揭示了生物甲烷生产前后预处理石油焦中的主要金属浓度（图5(a)）。结果显示，镍（Ni）、钡（Ba）、铁（Fe）和钒（V）在预处理石油焦中的含量分别为33.57%、13.51%、74%和9.01%。甲烷生产后，这些重金属如Ni、Ba、Fe和V的含量有所下降。石油焦中金属含量的减少可能归因于微生物吸附、沉淀或由于微生物群落的水解和酸生成反应导致有机化合物与重金属之间的键断裂而渗入液相的过程。通常，存在于煤样本中的微生物群落通过三种不同的机制将金属从不溶状态转化为可溶状态：酸解[38]：特定微生物种类通过生成硫酸改变pH值；氧化还原分解：微生物种类引发金属氧化态的变化；络合分解[39]：有机酸与金属络合并促进金属溶解[40]。宏基因组分析证实了Desulfovibrio、Acrobacter、Mesotoga、Paracoccus和Clostridium等物种的存在，这些物种具有在石油焦样本中启动水解和酸生成反应的能力。相反，锌的含量保持不变，因为锌与石油焦表面的氧分子有很强的络合作用[41]。此外，宏基因组分析发现的微生物群落增强了铁、钒和钡的浸出，这是本研究的新发现。
图5. (a) 条形图表示未处理和预处理石油焦中金属的ICP-OCS分析；(b) 条形图表示未处理和预处理石油焦中元素的最终分析。ICP = 电感耦合等离子体。
4.3. 碳、氢、氮、氧和硫的最终分析
图5(b) 显示了CSOHN百分比的图形表示。如表4所示，预处理石油焦中的CSOHN百分比为75.6%、11.7%、2.42%、1.01%和0%。甲烷生产后的石油焦中，CSOHN值分别为69.5%、2.52%、4.34%、1.01%和0%。通过比较分析结果，观察到硫含量从11.7%显著降低到2.52%，主要是由于Desulfomicrobium对硫的还原作用。此外，Desulfovibrio物种具有将煤样本中难处理的硫硫化的能力。厌氧消化后固体残渣中重金属和硫含量的减少可能表明了微生物的迁移过程，如生物浸出和生物脱硫。宏基因组分析证实了硫还原微生物的存在。类似的结果也在[42]中得到表达。此外，厌氧条件下二氧化碳的生成是碳质量变化的主要原因。发酵过程中产生的代谢物，包括有机酸和硫化物，可以促进含金属和硫化合物的溶解或转化。然而，这些发现需要通过液相元素分析进一步验证。
4.4. 从煤储层中分离的微生物群落的宏基因组分析
煤样来自安得拉邦Khammam区的Sathupalli村，位于经度17.20163、纬度80.7999，位于安得拉邦东部。分离过程后，进行了宏基因组分析以鉴定分离样本中的微生物物种。通过(i)门级、(ii)纲级、(iii)目级、(iv)科级、(v)属级和(vi)pi图对物种进行了分类，结果见补充材料1。鉴定出的物种Arcobacter、Mesotoga和Paracoccus已知参与中间代谢过程，如发酵和共生代谢，生成支持产甲烷古菌的底物（例如乙酸、氢气和CO₂）。结果显示，样本中有56%的Arcobacter参与水解和酸生成阶段，这与Arcobacter物种的代谢能力相符[43]；而16%的Mesotoga主要在乙酸生成阶段活跃[44]，有助于乙酸和氢气的产生。其活性对于支持产甲烷古菌至关重要[45]。Paracoccus在样本中的比例为9%，表明它参与了酸生成和乙酸生成阶段，将有机化合物发酵成挥发性脂肪酸和乙酸或氢气。其反硝化能力和代谢多种化合物的能力也可能有助于改善煤生态系统中的产甲烷条件[46]。最终，煤环境中的产甲烷途径由一个动态的微生物群落支持，每个属都发挥了特定作用。Desulfovibrio和Desulfomicrobium在硫酸盐还原过程中促进了氢气和乙酸的生成[47]。Clostridium和Clostridioides在水解和酸生成过程中对复杂有机物的分解至关重要[48][49]。Pseudomonas和Flavobacterium有助于难处理底物的降解，产生产甲烷的前体[50]。最后，Syntrophomonas在乙酸生成过程中通过将脂肪酸分解为乙酸和氢气发挥了关键作用[51]，这些物质直接被产甲烷古菌利用用于甲烷生产。这些属共同形成了一个协同的群落，有效转化煤底物为甲烷。
4.5. 从分离的微生物群落中实验评估生物甲烷的生产
在30天的时间内分析了石油焦的生物甲烷生产情况，每隔5天进行一次测量，结果如图6(i)所示。研究发现，用不同浓度的NaOH预处理石油焦对生物甲烷产量有显著影响。对于未经处理的石油焦，生物甲烷产量从3.4±0.2%开始，逐渐增加，在第30天达到25.5±0.2%。用0.5 M NaOH预处理的石油焦，初始生物甲烷产量较低，为1.4±0.1%，但最终在第30天达到26.9±1.2%，略高于未经处理的样本。当NaOH浓度增加到1 M时，生物甲烷产量进一步改善，第5天为1.4±0.1%，第30天达到28.6±0.1%。用1.5 M NaOH预处理的石油焦在第30天产生的沼气中甲烷浓度最高，为32.5%（v/v），表明与未经处理和其他预处理条件相比，厌氧生物降解得到了增强。用1.5 M NaOH预处理的石油焦观察到的最佳生物甲烷产量可以归因于NaOH预处理对石油焦化学和结构性质的综合作用，提高了生物降解性和有机物质对厌氧微生物的可利用性。NaOH预处理可以通过皂化有效破坏石油焦中的难处理芳香结构[52]，从而增加其表面积和孔隙度。它还可以溶解木质素和腐殖质等抑制性化合物，从而提高生物可利用性[38]。1.5 M的浓度可能在最大化破坏、溶解抑制剂和保留生物可利用有机物质之间达到最佳平衡，以实现高效的厌氧转化。有趣的是，当NaOH浓度进一步增加到2 M时，生物甲烷产量并未相应增加。相反，第5天为1.4±0.1%，第30天达到27.4±0.1%，低于1.5 M NaOH预处理的样本。尽管碱预处理增强了结构破坏和溶解作用，但过高的NaOH浓度可能导致生物可利用有机物质的过度降解或抑制性化合物的生成。2.0 M NaOH下观察到的生物甲烷产量减少表明，结构修饰和底物保留之间需要达到最佳平衡，以最大化厌氧消化效率。过高的NaOH浓度可能导致抑制性化合物的生成或必需有机物质的降解，抵消了预处理的好处[53]。这些发现与其他几项研究的结果一致，这些研究表明碱预处理对各种原料的生物甲烷生产有积极影响[54]。本研究中观察到的最佳NaOH浓度（1.5 M）与其他木质纤维素和难处理材料的报告一致，其中确定了最佳碱浓度以最大化生物甲烷产量。总体而言，本研究的结果表明，特别是在1.5 M的最佳浓度下，NaOH预处理具有增强难处理石油焦原料生物甲烷产量的潜力。
4.6. 甲烷生产前后的FTIR分析
FTIR分析提供了关于结构变化和复杂芳香成分分解的宝贵见解，有助于理解和优化从难处理原料（如石油焦）中生产生物甲烷的过程[55]。比较了甲烷生产前后未处理石油焦的FTIR光谱，以观察生产过程中的官能团变化，结果见图6(ii)和表5、表6。从图6(ii)可以看出，2899.14 cm−1处的峰对应于烷基的CH2伸缩振动，强度中等[56]；3320.14 cm−1处的峰表明存在仲胺的OH-NH伸缩振动，强度中等。甲烷生产后，3320.14 cm−1处的峰（仲胺N-H伸缩）显著变化，移至3265.14 cm−1，表明存在醇的O-H伸缩振动，强度强且宽。这表明在甲烷生产过程中仲胺转化为醇。使用1.5 M NaOH的最佳预处理条件对预处理石油焦的FTIR光谱显示，730.55 cm−1处有一个峰，表明存在单取代芳香化合物的CC弯曲振动。1006.3 cm−1处的峰表明存在甲基化合物的C-CH3伸缩振动[57]。
表5. 甲烷生产前后原始石油焦的FTIR分配
| 未生产甲烷前原始石油焦的波数（cm−1） | 生产甲烷后原始石油焦的波数（cm−1） | 官能团（cm−1） | 官能团差异（cm−1） | 键合强度 |
|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|
| 3253 | OH（水分） | 2899 | CH2伸缩 | 2092 |
| 2121 | CH2伸缩 | 29 | 弱 |
| 1640 | CH3弯曲 | 1243 | C-C伸缩 | 1036 |
| 1036 | C-CH3伸缩 | FTIR = 傅里叶变换红外 |
表6. 甲烷生产前后预处理石油焦的FTIR分配
| 未生产甲烷前预处理石油焦的波数（cm−1） | 生产甲烷后预处理石油焦的波数（cm−1） | 官能团 | 官能团差异（cm−1） | 键合强度 |
|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|-----------------|
| 3678 | OH（水分） | 29 | 弱 | 2099 |
| 2107 | CH2伸缩 | 8 | 弱 | 1562 |
| 1554 | C-C | 8 | 弱 | 1017 |
| 1017 | C-CH3伸缩 | 0 | 弱 | 7557 |
| 34 | CC2 | 1 | 弱 | FTIR = 傅里叶变换红外 |
甲烷生产后，730.55 cm−1处的峰移至745.46 cm−1，表明从单取代芳香化合物转变为1,2-双取代芳香化合物。此外，1006.3 cm−1处的峰消失，新峰出现在902.1 cm−1，表明存在1,3-双取代芳香化合物的C-H弯曲振动。观察到的变化突显了1.5 M NaOH预处理在破坏石油焦难处理芳香框架和提高有机物质厌氧消化可利用性方面的有效性。
4.7. 甲烷生产前后的微FTIR分析
μ-FTIR是最广泛使用的非破坏性化学技术之一，用于识别有机和无机物质的组成[58]。在预处理过程中，由于添加了强酸或碱，石油焦的化学性质发生了变化。此外，聚碳（PC）中有机成分的物理化学性质在预处理后可能发生了变化。尽管通过ATR-FTIR光谱分析揭示了官能团的存在，但对PC的整体样品分析并未提供有关其利用情况的深入见解。因此，进行了μ-FTIR光谱分析，以在极小区域内分析测试样品的化学组成，收集了高空间分辨率的红外信号（图7i-iv）。该分析用于估算生物甲烷化过程后PC中的气油比。空间分辨率用绿色、红色和绿色表示（图7i和iii），用于分析的显微图像（图4ii和iv）显示了生物甲烷生产前后PC的地形变化。
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图7. 微FTIR焦炭。图像展示了（i和iii）微FTIR化学图谱（空间分辨率）以及（ii和iv）生物甲烷化前后焦炭的显微图像。（v）微FTIR光谱显示了生物甲烷生成前后焦炭中的官能团。FTIR = 傅里叶变换红外光谱。
从图7(v)和表7中的光谱可以看出，在甲烷生成过程中，3062 cm−1处的OH伸缩振动形成了弱的氢键。3062和2916 cm−1处的峰强度在甲烷生成后增加[59]，这可能是由于长链烃中的烷基CH3和CH2基团的断裂和消除所致。此外，1500 cm−1处的强峰证明了甲基和亚甲基官能团的存在[60][61]。由于甲烷生成细菌群落对CHX烃类的分解，酯基和芳香族C-H官能团的吸收增加。光谱还显示，生物甲烷化后代表烷基亚甲基的峰强度低于甲基峰。由于PC的线性且较长的烷基链，甲烷生成后的CH2/CH3比值增加。FTIR光谱中观察到的CH2/CH3比值变化反映了PC在碱性预处理后的烷基结构变化。CH2/CH3比值的增加表明较长且分支较少的烷基链暴露更多，这些链通常比高度分支或缩合结构更容易受到微生物酶的降解[62]。这些结构变化提高了厌氧消化水解阶段的底物可利用性，使细胞外酶能够将暴露的烷基成分转化为可溶性中间体。还可以推断，较高的CH2/CH3比值表示获得的PC品质较低。此外，烃类的长度和侧链可能影响了PC在过程中的热行为和强度。
表7. 生物甲烷生成前后预处理焦炭的微FTIR峰分配
生物甲烷生成前预处理焦炭的波数（cm−1）
生物甲烷生成后预处理焦炭的波数（cm−1）
官能团（cm−1）
官能团差异（cm−1）
键合强度（cm−1）
3820
OH伸缩（分子间）
3795
强
2968
烷基CH3
99
强
2902
烷基CH3, CH2
29
弱
1436
1500
CH3和CH2芳香环弯曲
64
强
885
881
芳香族C–H平面外弯曲模式
4
弱
FTIR = 傅里叶变换红外光谱。
5. 结论
本研究证实，NaOH预处理显著提高了PC的生物降解性并增强了生物甲烷的产量。物理化学分析显示底物可利用性提高、颗粒尺寸减小、结构变化有利，并且脱硫和重金属去除效果显著。宏基因组学结果揭示了一个多样化的微生物群落，能够将复杂的PC成分转化为甲烷前体，如乙酸和氢气。官能团分析表明，在甲烷生成后烃类发生了显著降解。总体而言，1.5 M NaOH的预处理使生物甲烷产量增加了约32.5%，显示出其在高效PC转化方面的潜力。建议进一步优化预处理和反应器条件，以提高工艺性能和经济可行性。
作者贡献声明：
Mazen Yousif：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理、概念化。
Ravikumar Rajarathinam：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、方法学、概念化。
Allwin Ebinesar Jacob Samuel Sehar：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、形式分析。
伦理批准：
本研究不存在伦理问题。
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