黄健|胡梦欣|宋丽英|邓巧木|彭亮|文桂林|程安春
中国贵州省贵阳市贵州大学动物科学学院兽医系兽医免疫学与绿色药物研究所，国家重点绿色农药实验室，邮编550025
**摘要**
在禽类生产中，多重耐药（MDR）大肠杆菌（E. coli）的传播风险日益严重，活禽市场中的混售模式进一步加剧了跨物种病原体传播的威胁。本研究结合表型耐药性和毒力分析以及全基因组测序技术，对来自鸽子和鸡的两种MDR E. coli分离株进行了表征。共分离出两种MDR E. coli菌株，它们属于不同的MLST基因型和血清型，其中来自鸽子的菌株表现出更高的毒力。两种菌株的基因组大小相似，但鸽子来源的菌株携带更多的基因岛和三个质粒（均不携带耐药基因），而鸡来源的菌株携带两个携带blaTEM-1和tet(A)基因的质粒。这两种菌株主要依赖外排泵和靶标修饰机制产生耐药性，然而氟喹诺酮类抗生素的敏感性存在显著差异：鸽子来源的菌株在gadX基因的247位和249位发生氨基酸突变，导致其具有高度的环丙沙星耐药性（MIC = 128 μg/mL）。尽管鸽子来源的菌株拥有的毒力基因较少，但它具有与免疫调节（gtrB）和生物膜形成（cah）相关的独特功能类别，而这些在鸡来源的菌株中不存在。宿主-病原体相互作用分析显示，这两种菌株的策略存在差异：鸽子来源的毒力基因与宿主的凋亡和应激反应途径相互作用，而鸡来源的毒力基因主要与炎症信号通路相关。本研究揭示了共生E. coli中抗生素耐药性的持续进化，强调了加强对活禽市场的管理以及定期监测抗生素耐药性的必要性，以降低公共卫生风险。
**引言**
活禽市场中频繁的禽类交易促进了抗菌素耐药性（AMR）的传播，并增加了人类通过直接接触禽类而暴露于耐药菌的风险（Hasan等人，2025；Wang等人，2019）。活禽市场中的禽类产品经常被多重耐药细菌污染。这些病原体可通过食物链传播给人类，构成重大的公共卫生威胁。尽管之前的研究已经全面调查了活禽市场中的抗生素耐药性和毒力基因（Yang等人，2025），但针对贵州省不同禽类来源的耐药菌株的比较分析仍然较少。初步调查显示，在贵阳市的农贸市场普遍存在鸽子和鸡的混售现象。这一情况促使我们研究在这种交易模式下主要细菌的抗生素耐药性特征。
在贵阳市，多样的饮食偏好和传统的活禽交易方式形成了“鸽子和鸡混售”的独特市场模式。先前的研究表明，抗生素耐药细菌可以在人类-动物-环境之间传播，从而形成复杂的公共卫生风险网络（Forsberg等人，2012；Hu等人，2016）。作为连接农场、环境和食物链的关键节点，活禽市场由于禽类来源多样且卫生条件较差，已成为促进耐药细菌传播和耐药基因水平转移的关键热点（Yao等人，2016）。值得注意的是，除了鸡、鸭和鹅之外，鸽子也被发现携带编码CTX-M型广谱β-内酰胺酶（ESBL）和质粒介导的喹诺酮类抗生素耐药性（PMQR）基因的E. coli菌株。其中一些菌株携带高度可转移的质粒结构和克隆类型，表明鸽子可能成为耐药基因的传播媒介（Cordero等人，2019；Yang等人，2015）。尽管氟喹诺酮类抗生素耐药性的机制（如gyrA/parC基因突变，Muggeo等人，2020）已得到广泛研究，但活禽市场仍被认为是AMR传播的关键热点，不同禽类混售对AMR传播的具体影响机制尚不清楚。此外，这些耐药菌株通常携带多种毒力因子基因（如与黏附、侵袭和毒素合成相关的基因），从而增强了其在宿主体内的致病潜力。AMR和毒力因子的共传播可能进一步加剧公共卫生风险。
目前的研究主要集中在传统的耐药基因家族（如bla、tet、sul）上（Chetri，2025；Nobrega等人，2021），而对MDR E. coli中新耐药机制及其与宿主相互作用的理解仍然有限。基于此，本研究提出以下假设：（1）鸽子-鸡混售环境可能促进MDR E. coli菌株之间的水平基因转移；（2）来自不同禽类来源的E. coli菌株的耐药性和毒力表型存在差异；（3）这些菌株的基因组特征可能具有宿主来源特异性。为了验证这些假设，本研究采用了多种方法，包括最小抑菌浓度（MIC）测定、Galleria mellonella感染模型和全基因组比较生物信息学分析，系统评估了贵阳市活禽市场中“鸽子-鸡混售”环境下目标MDR细菌的分布特征及其与宿主的相互作用机制。研究结果有望为降低此类环境中抗菌素耐药细菌的传播风险提供科学依据。
**材料与方法**
我们在贵州省贵阳市的11个农贸市场或活禽市场进行了初步调查，发现所有市场都存在鸽子和鸡的混售现象（见图1）。2024年8月，我们从贵阳市花溪区吉林新村农贸市场同一零售摊位的鸽子和鸡中随机采集了三份新鲜粪便样本。样本使用无菌拭子无菌采集后，转移到含有1 mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的2 mL离心管中，置于4°C低温下，并立即送回实验室。收到样本后，依次进行了细菌分离和鉴定、最小抑菌浓度（MIC）测定、Galleria mellonella毒力测定以及全基因组测序，随后进行生物信息学分析。
**细菌分离与鉴定**
分别采集鸽子和鸡的新鲜粪便样本后，将其在无菌PBS中稀释一千倍。然后使用标准无菌划线法接种到血琼脂平板上，37°C下5% CO2条件下过夜培养。选择单个菌落并在血琼脂平板上连续传代培养三代。随后随机选取单个纯化菌落接种到无菌Luria Bertani（LB）肉汤中，37°C下180-220 rpm旋转速度下过夜摇床培养。当细菌悬液出现浑浊时，4°C下5000 rpm离心5分钟无菌收集细菌细胞。将细菌菌株无菌划线接种到血琼脂、MacConkey琼脂和伊红美蓝（EMB）琼脂上，观察其菌落形态特征。进一步使用标准革兰氏染色和光学显微镜进行鉴定。之后，使用商业试剂盒提取细菌基因组DNA，进行标准16S rRNA基因扩增（Weisburg等人，1991）、测序和物种鉴定。
**16S rRNA基因分析**
使用通用引物27F/1492R通过PCR扩增16S rRNA基因（见补充表1）。扩增产物进行测序，并使用NCBI BLAST进行序列同源性比对。基于16S rRNA基因序列构建系统发育树，使用IQ-TREE v1.6.12（Nguyen等人，2015）进行进化分析，命令如下：iqtree -s name.fasta -m MFP -bb 1000 -bnni -nt AUTO。系统发育分析包括十二个参考菌株：三种E. coli标准菌株、五种人类来源的菌株、一种鸟类来源的菌株、一种牛来源的菌株和一种玉米来源的菌株。另外还包括一种鸟类致病性E. coli（GenBank登录号：CP006834.2）作为外群。
**最小抑菌浓度测定**
根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南（CLSI M100，第34版，2024年），使用标准肉汤稀释法测定了两种E. coli菌株对十一种不同抗生素的MIC。选用的抗生素包括四类：β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素类，包括头孢噻肟、头孢他啶、氨苄西林、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、阿普拉霉素、四环素和多西环素。该抗生素组合用于系统评估菌株的耐药性特征。
**Galleria mellonella毒力测定**
为了评估两种E. coli菌株的毒力因子特征，本研究使用健康的Galleria mellonella幼虫（体重250–300 mg）作为感染模型（Tsai等人，2016）。细菌菌株在37°C下5% CO2条件下180-220 rpm摇床培养至对数生长阶段。4°C下5000 rpm离心10分钟后收集细菌培养物，弃去上清液，将细菌细胞沉淀重悬于无菌0.9%生理盐水中。通过标准浊度法将细菌悬液浓度调整至1 × 10⁸ CFU/mL（CLSI M100，第34版，2024）。随后，将细菌悬液用无菌生理盐水逐步稀释十倍，制备最终浓度为1 × 10⁴、1 × 10⁵、1 × 10⁶、1 × 10⁷和1 × 10⁸ CFU/mL的悬液。每种细菌悬液取10 μL微量无菌注入每只幼虫的血腔（靠近倒数第二对腹足）。同时设置阴性对照和无菌生理盐水对照组，每组含10只幼虫。感染后，幼虫在37°C的暗培养箱中培养96小时，每12小时记录一次存活情况。幼虫死亡定义为对外部机械刺激无反应，伴随明显的身体变暗和僵硬。
**两种MDR E. coli菌株的全基因组测序和生物信息学分析**
将两种MDR E. coli菌株送至广东Magigene生物技术有限公司进行全基因组测序，采用完整的细菌基因组策略。测序在PacBio Revio平台上使用HiFi Circular Consensus Sequencing（CCS）模式完成。根据SMRTbell® prep kit 3.0协议构建文库。基因组DNA用G-tubes片段化并末端修复，生成SMRTbell模板文库。使用Qubit 4.0荧光计和Agilent 4200 TapeStation系统分别量化文库浓度和插入片段大小，生成高质量HiFi读段（Q30）。使用FastQC v0.11.9评估原始测序数据的质量，并使用Trimmomatic v0.39（Bolger等人，2014）修剪低质量读段和接头序列。使用Canu（Koren等人，2017）进行从头基因组组装。通过BLAST v2.5.0进行物种注释，使用Prodigal v2.6.3进行基因预测和功能注释，参数设置为-p single（Hyatt等人，2010）。使用PlasmidFinder（Carattoli等人，2014）、MLST v2.11（Maiden等人，1998）和ectyper v2.0.0（Bessonov等人）分别进行质粒注释、MLST分型和血清型鉴定。
**E. coli的平均核苷酸同源性及泛基因组分析**
为了评估来自不同宿主来源的E. coli菌株之间的基因组序列相似性，从NCBI RefSeq数据库中选取了大约50种E. coli菌株（来自鸡、鸽子、鸭、鹅、人类、猪和牛，截至2024年8月的数据，详细数量见补充表2）。严格选择标准包括：（i）完整或高质量的草图基因组组装（contig N50 ≥ 20 kb）；（ii）明确的宿主来源注释；（iii）随机选择以避免样本偏差，每种宿主物种最多选取50个基因组以确保宿主间的平衡代表。使用FastANI v1.33（Jain等人，2018）计算成对平均核苷酸同源性（ANI）值。基于成对ANI结果，使用pheatmap包v1.0.12在R中生成热图，直观展示菌株间的遗传相似性模式。此外，还筛选了与本研究测序菌株基因密切相关的28个菌株。对这些28个菌株以及本研究中的两个分离株进行了全基因组分析，使用的是CD-HIT v4.8.1（Fu等人，2012年）来识别同源基因簇，并计算了每个菌株的同源基因簇数量。随后，使用pheatmap包生成了所有菌株中同源基因簇分布的热图。
**两个多重耐药性大肠杆菌分离株中的抗生素抗性基因和毒力因子映射**
来自鸽子和鸡的多重耐药性大肠杆菌分离株的全基因组被全面注释，参考了综合抗生素抗性数据库（CARD，v3.1.4）（Alcock等人，2020年），以获取有关抗生素抗性基因的信息。使用R语言中的networkD3包v0.4为每个分离株生成了Sankey图，以直观展示抗性机制、抗性基因家族、基因名称及其相应抗生素之间的成对关联。特别关注了特定的氟喹诺酮类抗性基因（包括环丙沙星）和外排泵相关基因。使用Clustal Omega v1.2.4提取并比对了这两个分离株中这些目标基因的同源序列。此外，为了研究与抗生素抗性相关的特定点突变基因及其编码蛋白的结构变化，进行了同源建模（Sali和Blundell，1993年）。使用PyMOL v3.1预测了由点突变引起的突变蛋白的三维构象变化，从而评估这些突变在空间层面对抗性发展的潜在影响。来自鸽子和鸡的大肠杆菌分离株的毒力因子基因也根据毒力因子数据库（VFDB，v:2021/9/24）（Liu等人，2022年）进行了全面注释，使用的阈值是>85%的覆盖率和>85%的序列同一性，随后进行了功能分类。在Cytoscape v3.9.1中生成了功能分类图，以可视化毒力因子基因在功能类别中的分布。
**病原体-宿主相互作用**
使用KOBAS v3.0（Bu等人，2021年）对来自鸽子和鸡的宿主基因进行了KEGG通路富集分析，以识别参与免疫反应、炎症反应和凋亡途径的基因（详细信息见补充表3）。对于这两个大肠杆菌分离株，使用毒力因子数据库（VFDB，2024年更新）对毒力因子基因进行了注释，设定的截止值为>85%的覆盖率和>85%的序列同一性。使用STRING数据库（https://cn.string-db.org/，v12.0）（Szklarczyk等人，2023年）重建了多重耐药性大肠杆菌的毒力因子基因与鸽子和鸡的免疫相关基因、炎症相关基因和凋亡相关基因之间的相互作用网络，并在Cytoscape v3.9.1中进行了可视化。
**进一步的全基因组分析**
使用CD-HIT v4.8.1对这两个大肠杆菌分离株进行了全基因组分析，以识别特定于鸡源或鸽源菌株的基因。在这些菌株特异性基因中，进一步筛选了被注释为毒力因子基因的基因。随后，通过STRING数据库（v12.0）构建了这些宿主特异性毒力因子基因与相应的宿主（来自鸽子或鸡）之间参与免疫、炎症和凋亡的相互作用网络，并使用Cytoscape v3.9.1软件进行了可视化。
**统计分析**
在G. mellonella毒力测定中，使用Kaplan-Meier方法（Sanger等人，2022年）生成了生存曲线，以比较不同处理组之间的生存情况，包括注射不同浓度细菌悬浮液的组别和对照组。使用Log-rank（Mantel-Cox）检验来评估组间生存差异的显著性。所有统计分析均使用GraphPad Prism v9.5软件进行。
**细菌分离、鉴定和16S rRNA基因系统发育分析**
两个分离株在血琼脂平板上产生了光滑、湿润的灰白色菌落（图2A）。在MacConkey（MAC）琼脂上，菌落呈粉红色且湿润（图2A）。在伊红美蓝（EMB）琼脂上，菌落呈现蓝紫色，中心较暗，边缘透明，并具有特征性的金属光泽（图2A）。革兰氏染色显示这两个菌株都是非产孢子的革兰氏阴性大肠杆菌（图2A）。来自鸽子和鸡的大肠杆菌分离株分别被命名为GZ2408P和GZ2408C。基于16S rRNA基因序列的BLAST比对和系统发育分析进一步验证了这两个分离株都属于大肠杆菌（补充表4和图2B）。
**两个大肠杆菌分离株的抗菌敏感性测试**
两个分离株均表现出多重耐药性（MDR）表型。GZ2408P菌株对氨苄西林、美罗培南、环丙沙星和四环素具有抗性（表1）。相比之下，GZ2408C菌株的抗性谱更广，对氨苄西林、美罗培南、头孢他啶、环丙沙星和四环素以及多西环素具有显著抗性（表1）。值得注意的是，这两个菌株对头孢噻肟、阿米卡星、庆大霉素和阿普拉霉素仍然敏感（表1）。
**两个大肠杆菌分离株的致病性**
在10⁶、10⁷和10⁸ CFU/mL的细菌悬浮液浓度下（每只幼虫注射10 μL），来自鸽子的大肠杆菌感染组的死亡率明显高于来自鸡的大肠杆菌感染组（图3A和3B）。在108 CFU/mL的接种剂量下，来自鸽子的菌株表现出急性毒力，导致所有幼虫在24小时内迅速死亡（图3C和3D）。然而，在48小时后没有观察到更多的G. mellonella幼虫死亡，96小时的生存结果见补充图1。
**两个多重耐药性大肠杆菌分离株的全基因组特征和全基因组分析**
来自鸽子的大肠杆菌菌株的基因组大小为5,172,175 bp，而来自鸡的菌株的基因组大小为5,149,987 bp。来自鸽子的大肠杆菌染色体含有20个基因岛和3个质粒，这些质粒均不携带抗生素抗性基因。对于来自鸡的大肠杆菌，其染色体上预测有15个基因岛和2个质粒；这些质粒携带两个抗性基因：blaTEM-1和tet(A)（图4A）。对来自不同宿主的分离株进行ANI分析显示，大肠杆菌的基因组同源性与其宿主来源之间没有强相关性（图4B）。进一步对来自鸽子和鸡的30个大肠杆菌菌株进行了核心基因和特定基因分析。来自鸽子的菌株具有更多的特定基因簇（998个），而来自鸡的菌株具有823个。所有菌株共享3,712个核心基因（图4C和补充图2）。
**MLST和血清型鉴定**
MLST分型将来自鸽子的菌株归类为序列类型466（ST466），将来自鸡的菌株归类为序列类型632（ST632）（补充表5）。血清型鉴定将来自鸽子的菌株鉴定为血清型O107/O117:H42，而来自鸡的菌株属于血清型O91:H28（补充表5）。
**两个大肠杆菌分离株的抗性基因和分子特征**
根据CARD数据库的注释，两个分离株携带了广泛的抗性基因。来自鸽子的大肠杆菌分离株携带48个抗性基因，属于22个抗生素类别，而来自鸡的菌株携带54个抗性基因，覆盖22个抗生素类别（图5A和5B）。两个分离株的抗性谱涵盖了主要的抗生素类别，包括氟喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类和β-内酰胺类（包括青霉素和碳青霉烯类）。抗性机制分析显示，编码抗生素外排泵的基因在两个分离株中占主导地位（各40个），其次是介导抗生素靶标改变的基因（鸽子分离株10个，鸡分离株15个）、抗生素失活基因（各2个和3个）以及降低抗生素通透性的基因（各2个）。此外，在两个分离株中都检测到了具有双重抗性机制（外排泵和靶标修饰）的四个基因：marR、acrR、soxR和soxS。
**氟喹诺酮类抗性的显著差异**
两个菌株在氟喹诺酮类抗性方面存在显著差异。MIC测试证实，来自鸽子的菌株对环丙沙星具有高水平抗性，MIC为128 µg/mL，而来自鸡的菌株敏感，MIC低于0.25 µg/mL。为了探讨这种表型差异的分子基础，我们分析了抗性相关基因，并在两个分离株中发现了gyrA、parC、gadW和gadX的突变。同源建模表明，gyrA、ParC和gadW中的氨基酸替换并未改变这些蛋白质的二级结构（图5C-E）。相比之下，来自鸽子的菌株在gadX中的突变发生在247和249位氨基酸位置，导致了二级结构的变化，特别是在α-螺旋结构域内（图5F）。此外，两个分离株都携带染色体编码的β-内酰胺酶基因（ampH、ampC1），并且共享EF-Tu靶蛋白的突变。相比之下，来自鸡的菌株独特地携带了质粒携带的blaTEM-1和tet(A)，以及GlpT/UhpT的突变。
**毒力因子分析**
毒力因子基因的分类分析显示，来自鸽子的大肠杆菌菌株中有九类毒力因子基因，而来自鸡的菌株中有七类（图6A和6B）。两个菌株的毒力因子基因主要集中在四个功能类别：（1）运动相关基因（来自鸽子的菌株46个，来自鸡的菌株48个）；（2）粘附相关基因（分别为31个和51个）；（3）效应子传递系统基因（分别为21个和47个）；（4）营养/代谢相关基因（分别为14个和23个）。值得注意的是，来自鸽子的菌株还携带了两个在来自鸡的菌株中未检测到的独特毒力因子类别：免疫调节类别（由gtrB代表）和生物膜形成类别（由cah代表）。总体而言，尽管来自鸽子的菌株的毒力因子基因总数低于来自鸡的菌株，但在功能类别上表现出更大的多样性。针对VFDB数据库注释的毒力因子分类，分别针对（A）GZ2408P菌株和（B）GZ2408C菌株。（C）鸽子来源的大肠杆菌毒力基因与鸽子宿主基因之间的相互作用网络。红色节点表示宿主基因，蓝色节点表示大肠杆菌毒力基因。（D）鸡来源的大肠杆菌特定毒力基因与鸡宿主基因之间的相互作用网络。紫色节点表示宿主基因，蓝色节点表示大肠杆菌毒力基因。（E）鸽子来源的大肠杆菌特定毒力基因与鸽子宿主基因之间的相互作用网络。红色节点代表宿主基因，蓝色节点代表大肠杆菌毒力基因。（F）鸡来源的大肠杆菌特定毒力基因与鸡宿主基因之间的相互作用网络。紫色节点代表宿主基因，蓝色节点代表大肠杆菌毒力基因。
两种多重耐药性大肠杆菌分离株的病原体-宿主相互作用分析显示，鸽子来源的大肠杆菌毒力基因（蓝色节点，103个基因）与鸽子宿主基因（红色节点，23个基因）形成了一个多节点相互作用网络，包含1,276个相互作用对，涉及毒力基因（如cheZ和entC）与宿主免疫相关基因之间的直接关联（图6C）。相比之下，鸡来源的大肠杆菌毒力基因（蓝色节点，159个基因）与鸡宿主基因（紫色节点，24个基因）形成了一个特定的相互作用网络，包含2,041个相互作用对，核心毒力基因包括flhB、ecpR等（图6D）。
通过CorePan分析鉴定了鸽子来源和鸡来源的大肠杆菌的核心基因，并筛选了VFDB注释的毒力基因，以进一步分析它们与相应宿主途径基因的相互作用。结果显示，鸽子特异性的毒力基因（如gtrB、cah）与鸽子宿主基因（如TP53、HSP90AA1）紧密相互作用，涉及凋亡和应激反应途径（图6E）。鸡特异性的毒力基因（如sitA、iutA）主要与参与炎症信号途径的鸡宿主基因相互作用（图6F）。
在活禽市场中同时销售鸽子和鸡可能会增加跨物种病原体传播的风险，促进多重耐药性细菌的扩散，并增加控制人畜共患病的难度，从而对公共卫生和生物安全构成威胁。这种混合销售环境可以通过粪便和羽毛等媒介促进来自不同禽类宿主的微生物之间的基因交换和传播，从而增加环境耐药组的复杂性，并可能通过食物链（如禽类产品）或直接接触将耐药性和高毒力菌株传播给人类。在这项研究中，从贵阳活禽市场的一个鸽子-鸡混合销售点收集的新鲜粪便样本中分离并鉴定了两种多重耐药性大肠杆菌菌株（鸽子来源的GZ2408P菌株和鸡来源的GZ2408C菌株）。这两种不同宿主来源的菌株在耐药机制、毒力谱和宿主适应策略方面存在差异。这些发现为混合饲养环境中耐药细菌的进化和传播提供了重要见解。
这两种菌株表现出相似的基因组大小（鸽子来源的菌株约为5.17 Mb，鸡来源的菌株约为5.15 Mb），但在结构组成上存在显著差异。鸽子来源的菌株携带三个质粒，其中不包含可检测到的耐药基因。相比之下，鸡来源的菌株携带两个质粒，含有典型的耐药基因blaTEM-1和tet(A)，表明具有高水平水平基因转移（HGT）的潜力。质粒介导的HGT是自然环境中细菌耐药性传播的关键机制（Coluzzi和Rocha，2025），而在禽类市场等环境中这种转移可能会加速。全基因组分析显示，30株禽类来源的大肠杆菌共享3,712个核心基因簇，反映了大肠杆菌分离株在核心基因组特征上的功能保守性。MLST和血清型分析进一步突出了遗传差异：鸽子来源的菌株被鉴定为ST466（血清型O107/O117:H42），而鸡来源的菌株被鉴定为ST632（血清型O91:H28）。这些发现表明不同的宿主来源可能导致大肠杆菌菌株的分化。
两种菌株均表现出多重耐药性表型。耐药基因注释显示，两种分离株都携带多样的耐药基因库（鸽子来源的菌株有48个，鸡来源的菌株有54个——涵盖主要抗生素类别，包括氟喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类和β-内酰胺类）。检查耐药机制发现，外排泵基因在两种菌株中都很常见（各40个），其次是参与抗生素靶标修饰和抗生素失活的基因。这些发现表明，即使是一些常见或被忽视的大肠杆菌菌株也可以通过获得外排泵系统（如AcrAB-TolC）、靶标基因突变（如gyrA/parC）、调控基因突变（如gadW/gadX）和质粒携带的耐药基因（如blaTEM-1、tet(A)）等机制发展出高水平的多重耐药性。值得注意的是，两种菌株之间的耐药谱存在显著差异。例如，鸽子来源的菌株对环丙沙星表现出高水平耐药性（MIC = 128 μg/mL），而鸡来源的菌株仍然敏感（MIC < 0.25 μg/mL）。这一差异与先前的报告一致，即特定突变可以显著增强大肠杆菌的氟喹诺酮耐药性（Fuzi，2025；Tewawong等人，2025）。
氟喹诺酮类抗生素通过双重抑制细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶IV发挥其抗菌作用（Collins和Osheroff，2024）。为了探索两种菌株之间观察到的环丙沙星耐药性差异的分子基础，我们分析了基因关联，发现两种分离株都携带gyrA、parC、gadW和gadX的突变。同源性建模结果显示，只有gadX基因（247和249位置的aa替换）诱导了蛋白质二级结构α-螺旋的构象变化，而GyrA、ParC和GadW的突变没有引起显著的结构改变。GadX/W系统已被证明可以增强细菌在酸性环境中的存活能力（Tramonti等人，2008）；此外，GadX已被证明可以通过激活mdtEF多药外排泵的表达来促进大肠杆菌的多重耐药性（Nishino等人，2008），并在生物膜形成中起调节作用（Ma等人，2003）。因此，gadX的结构变异可能是鸽子来源菌株表现出高水平环丙沙星耐药性的关键分子机制。此外，鸡来源的菌株携带独特的GlpT/UhpT突变，并携带质粒编码的blaTEM-1和tet(A)基因。由于这两个耐药基因位于可移动质粒上，它们具有高水平水平基因转移的风险。先前的研究表明，质粒介导的HGT是细菌群体中耐药性传播的关键驱动因素（Hall等人，2017）。这表明这类菌株可能作为耐药基因的“携带者”和“传播者”，有可能将耐药性传递给其他肠道细菌甚至非肠道病原体，从而加剧动物来源细菌对公共卫生的威胁。
最近的研究证实，从禽类、人类和狗中分离出的致病性大肠杆菌菌株具有遗传相似性，表明这些菌株可以在不同宿主之间传播并成功定植。这一发现强调了将禽类、人类和其他哺乳动物（如伴侣动物）整合到一个统一的生态健康网络中进行全面监测的必要性，以评估微生物传播的风险。这也突显了应用“同一健康”框架来减缓耐药细菌和人畜共患病传播的必要性和紧迫性。
毒力相关基因的比较显示，尽管鸽子来源的菌株拥有的毒力相关基因总数低于鸡来源的菌株，但它独特地携带一个免疫调节相关基因（gtrB）和一个生物膜形成基因（cah）。这表明其适应策略包括免疫逃逸和生物膜介导的定植。毒力基因-宿主相互作用分析显示，鸽子来源的大肠杆菌毒力基因与鸽子宿主基因形成了一个多节点相互作用网络（1,276个相互作用对），涉及毒力因子基因（如cheZ和entC）与宿主免疫相关基因之间的直接关联。相比之下，鸡来源的大肠杆菌毒力基因与鸡宿主基因形成了一个特定于宿主的相互作用网络（2,041个相互作用对），其中核心毒力基因包括flhB、ecpR等。这些发现表明两种菌株在其各自的宿主环境中在宿主适应方面存在差异。
关于毒力适应策略，鸽子来源菌株中的趋化性调节基因cheZ可能通过调节细菌趋化性和黏膜定位间接调节宿主的炎症反应（Parkinson等人，2015）。同时，鸽子来源的菌株主要依靠编码肠杆菌素的entC来通过螯合宿主铁结合蛋白（如转铁蛋白）中的铁离子来有效获取铁，从而促进其在宿主体内的存活和定植（Skaar，2010）。相比之下，在鸡来源的菌株中，激活编码鞭毛/T3SS输出复合体的flhB基因对于组装功能性III型分泌系统至关重要（Worrall等人，2023）。这种分泌系统可以将效应蛋白转运到宿主细胞中，在那里它们可以增强炎症反应并诱导线粒体依赖性凋亡（Wong等人，2011）。菌毛调节因子ecpR调节ECP（大肠杆菌常见菌毛）的表达，从而促进细菌附着并加剧炎症反应（Nesta等人，2012）。这些发现表明两种菌株在毒力因子机制和宿主相互作用方面存在差异，为针对不同宿主来源的禽类来源菌株开发差异化的预防和控制措施提供了潜在的分子靶点。
CorePan分析鉴定了鸡来源和鸽子来源的大肠杆菌中的独特基因，发现鸽子特异性的毒力因子基因（gtrB、cah）与鸽子宿主基因（如TP53、HSP90AA1）紧密相互作用，涉及与凋亡和应激反应相关的途径。相比之下，鸡特异性的毒力因子基因（如sitA、iutA）主要与参与炎症信号途径的鸡宿主基因相互作用。这种差异突显了宿主驱动的毒力进化：鸽子来源的菌株采用急性致病策略，而鸡来源的菌株采用相对温和的适应策略。这项研究存在一定的局限性，主要是样本量较小。此外，未来的研究应重点关注gadX、gtrB和cah基因的深入功能表征，以明确它们在介导耐药性和毒力表型中的具体作用。
总之，结合表型测试、基因组分析和相互作用网络分析，这项研究阐明了鸽子来源和鸡来源的大肠杆菌菌株在耐药机制和毒力策略方面的显著差异。从鸽子和鸡中分离出的两种多重耐药性大肠杆菌菌株属于不同的MLST序列类型（鸽子来源的菌株为ST466，鸡来源的菌株为ST632）和血清型（分别为O107/O117:H42和O91:H28）。环丙沙星敏感性的表型差异可能归因于鸽子来源菌株中gadX基因247和249位点的点突变引起的次级结构变化。两种分离株主要依赖外排泵系统和靶标位点修饰作为其主要耐药机制。值得注意的是，鸽子来源的菌株携带两种独特的毒力因子：免疫调节和生物膜形成，分别由gtrB和cah基因编码。鸽子来源的菌株表现出更强的毒力，而鸡来源的菌株具有更大的定植和跨宿主传播潜力，且在毒力基因介导的宿主相互作用策略上存在显著差异。在活禽市场中同时销售鸡和鸽子为来自不同宿主的菌株之间的密切接触、基因交换和共同进化创造了有利条件。这些条件可能促进多重耐药性决定因素和超毒力基因型的整合和传播，从而增加相关的公共卫生风险。这些发现为评估混合禽类交易环境的生物安全性和制定针对耐药细菌传播的针对性策略提供了科学依据。
本工作得到了贵州省基础研究计划（自然科学）（项目编号QKHJC-[2024]Youth103）、贵州大学自然科学特别岗位项目（项目编号Leading Group2024-12）以及贵州省百千万领军人才团队（项目编号BQW(2025)-004）的支持。
作者贡献声明：
Jian Huang：撰写——原始草稿。
Mengxin Hu：方法学。
Liying Song：可视化。
Qiaomu Deng：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。
Liang Peng：方法学、正式分析。
Guilan Wen：项目管理、方法学。
Anchun Cheng：
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