恒在|陈斌杰|田佩|杨洪宁|庄伟|胡书群|徐铁|闫先亮|赵宁军|苏成雷
中国江苏省徐州市徐州医科大学附属医院急诊医学中心，邮编221002
**摘要**
**目的**
探讨心脏骤停（CA）后轻度治疗性低温（MTH）的神经保护作用及其机制在年龄上的差异，以制定针对不同年龄段的个性化治疗策略。
**方法**
从临床数据库中选取660例心脏骤停患者，通过随机森林模型进行进一步验证分析。183只雄性大鼠接受6分钟窒息性心脏骤停处理，并随机分为成年组（12-16周）和老年组（76-84周）：假手术组（无心脏骤停，37°C）、假手术+MTH组（无心脏骤停，33°C持续2小时）、对照组（诱导心脏骤停，37°C）和MTH组（诱导心脏骤停，33°C持续2小时）。在自主循环恢复（ROSC）后的5天内，评估生存率、神经功能（缺陷评分和运动活动）、白细胞介素（IL）-17/IL-6水平（血清和海马区）以及CA1区神经元凋亡情况。
**结果**
临床数据分析显示，年龄与MTH在预测生存率方面存在显著交互作用（β=-0.15，P<0.001）。在成年大鼠中，MTH显著提高了生存率。与对照组相比，接受MTH处理的成年心脏骤停大鼠在ROSC后的5天内表现出更低的神经功能障碍，表现为神经缺陷评分降低和运动活动改善。MTH减少了海马CA1区的神经元凋亡，并降低了血清和海马区IL-17及IL-6的水平。在老年大鼠中，MTH对生存率、神经功能、凋亡或炎症标志物均无显著影响（P>0.05）。
**结论**
与成年大鼠相比，老年大鼠从MTH中未获得生存率、功能或炎症方面的益处。年龄改变了MTH在心脏骤停后的神经保护和抗炎作用。
**引言**
心脏骤停（CA）是全球公共卫生问题，也是急诊和重症监护医学中的重大挑战。据估计，全球每年发生约50万例心脏骤停病例。即使成功复苏，仍有高达70%的患者因脑损伤而死亡。轻度治疗性低温（MTH）已被广泛用于治疗心脏骤停后的神经功能障碍。尽管动物研究一致表明MTH比常温治疗具有更好的神经保护效果，但多项临床研究结果并不一致。先前的回顾性研究表明，MTH对院外心脏骤停（OHCA）的老年患者无效，多项随机对照试验也质疑了MTH的临床应用价值，这导致2025年欧洲复苏委员会指南不再推荐常规使用MTH。现有研究表明，大多数动物实验使用的是3至6个月大的成年动物，而临床中实现自主循环恢复（ROSC）患者的平均年龄约为60岁。因此，我们假设MTH的神经保护作用具有年龄依赖性，在老年动物中效果减弱。
**材料与方法**
**临床数据收集**
本研究使用三个大规模重症监护数据库的患者数据：Medical Information Mart for Intensive Care（MIMIC）-IV版本2.2、MIMIC-III版本1.4和EICU Collaborative Research Database（EICU-CRD）版本2.0。EICU-CRD（v2.0）是一个美国多中心重症监护数据库，包含2014至2015年间来自美国200多家医院的去标识化临床数据；MIMIC-IV（v2.2）整合了2008至2019年间波士顿Beth Israel Deaconess Medical Center患者的去标识化临床数据；MIMIC-III（v1.4）涵盖2001至2012年的患者数据。这三个数据库均获得了各自机构伦理委员会的批准。所有患者数据均经过去标识化处理以保护隐私。
**纳入和排除标准**
详见图1A。所有纳入患者符合以下标准：（1）诊断为OHCA；（2）年龄≥18岁；（3）入住重症监护病房（ICU）；（4）ICU入住后存活超过24小时；（5）格拉斯哥昏迷量表（GCS）评分≤8分。排除因创伤原因导致OHCA、怀孕或体温数据缺失的患者。首先比较MTH组与非MTH组，然后分析MTH在不同年龄亚组中的差异性保护作用。通过使用唯一的重症监护系统标识符排除不同数据库中的重复记录。MTH定义为ICU入住后核心体温持续低于35°C至少24小时。主要结局指标为出院前的死亡率。
**动物准备**
所有动物实验均获得徐州医科大学动物护理和使用委员会的批准，并遵循美国国立卫生研究院的实验室动物护理和使用指南（XYFY2021-KL121-01）。成年雄性Sprague-Dawley大鼠（12-16周，350–400克）和老年大鼠（76-84周，550–600克）来自认证供应商，饲养在标准条件下（23±1°C，55±5%湿度，12小时光照/黑暗周期），可自由获取食物和水。
**实验设计和分组**
大鼠随机分为四组：（1）假手术组：无心脏骤停或MTH；（2）假手术+MTH组：无心脏骤停，但接受MTH处理；（3）对照组：心脏骤停后恢复正常体温；（4）MTH组：心脏骤停后接受MTH处理。随机分组按年龄（成年或老年）分层进行。进行结果评估的研究人员对分组情况不知情。为确保统计效力，每组至少有10只大鼠存活至实验结束。
**窒息性心脏骤停的诱导**
大鼠的窒息性心脏骤停模型如前所述建立。首先使用5%异氟醚在塑料箱中麻醉大鼠，进行气管插管，连接呼吸机（型号R407，RWD，中国），设置潮气量为6 mL/kg、呼吸频率为100次/分钟。放置皮下电极持续监测心电图和心率（BL-420N，Taimeng，中国）。将PE-50导管插入左股动脉并推进至主动脉以测量平均动脉压（MAP）。另一根PE-50导管插入左股静脉，用于给药和采血。在整个实验过程中使用血管内热电偶探头持续监测核心体温（BL-420N，Taimeng，中国）。通过静脉注射2 mg/kg的顺式阿曲库铵实现肌肉完全松弛。通过阻塞气管插管诱导心脏骤停，以MAP下降<20 mmHg为心脏骤停的开始标准。6分钟后开始复苏，包括100%氧气的机械通气、每分钟300次的胸外按压以及通过股静脉注射肾上腺素（10 μg/kg）。如果未实现ROSC，则每2分钟重复注射一次肾上腺素。ROSC定义为恢复持续性的室性心律且MAP≥50 mmHg至少5分钟。如果10分钟内未实现ROSC，则终止复苏尝试。
**MTH的实施**
MTH的实施方法如前所述。ROSC后15分钟内使用表面冷却（冰袋和风扇）将核心体温降至33±0.5°C，并维持2小时，随后缓慢升温至37±0.5°C持续2小时。对照组大鼠在整个实验期间保持正常体温（37±0.5°C），使用保暖毯和加热垫。
**神经缺陷评分（NDS）和生存分析**
ROSC后24、48、72和96小时检测NDS。根据标准化NDS系统（0–500分：0表示无神经缺陷；500表示无脑功能）评估意识、呼吸频率、角膜和颅神经反射、运动感觉功能、听觉反射及协调能力。为避免与死亡率相关的混杂因素，仅对存活的大鼠进行NDS分析。ROSC后每天监测生存情况，所有实现ROSC的大鼠均纳入生存分析，死亡定义为自主呼吸和心跳不可逆停止。
**开放场测试**
ROSC后第5天进行开放场测试，评估大鼠的一般运动能力和焦虑相关行为。使用96厘米×96厘米×50厘米的测试箱，地面划分为16个方格。将大鼠置于箱中央，允许其自由活动5分钟，使用视频跟踪软件（ANY-maze，Stoelting Co.，美国伍德代尔）自动记录活动情况。
**Y-迷宫测试**
ROSC后第5天进行Y-迷宫测试，评估空间工作记忆。装置为对称的Y形迷宫，三个臂长度相等（40厘米，宽度10厘米，壁高15厘米），每个臂呈120°角。将大鼠放入其中一个臂，允许其自由探索所有三个臂，记录进入中央区域的次数。
**酶联免疫吸附测定（ELISA）**
ROSC后4小时采集股静脉血液样本（1毫升），使用商业夹心ELISA试剂盒（JL20979-96T和JL20879-96T；Jianglai Biological，上海）检测血清中的IL-6和IL-17浓度。严格遵循制造商协议进行双重检测。
**Western Blot**
实验结束时（ROSC后第5天），对大鼠实施安乐死并采集海马组织。组织在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀缓冲液中裂解，使用比色法测定蛋白质浓度。将等量海马裂解物（20 µg）通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上（Millipore，美国马萨诸塞州）。膜用5%脱脂牛奶封闭，随后在4°C下用一抗（anti-IL-6，ab9324，1:5000；anti-IL-17，26163-1-AP，1:20000；anti-β-actin，1:3000；Proteintech，20536-1-AP）孵育过夜。洗涤后加入HRP结合的二抗（A1949，1:5000；A0168，1:5000；Sigma-Aldrich），通过化学发光（BeyoECL Plus，Beyotime Biotechnology，上海）显色，并使用ImageJ（美国国立卫生研究院，贝塞斯达）进行定量分析。蛋白质表达水平相对于每个样本的β-actin加载对照带密度进行标准化，然后以假手术组平均值为基础表示倍数变化。
**末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）**
实验结束时（ROSC后第5天），对大鼠实施安乐死并采集海马组织。海马组织在液氮预冷的2-甲基丁烷中快速冷冻，使用冷冻切片机（Leica CM1950）切成10微米厚的切片。切片在10%甲醛中固定10分钟，用PBS冲洗三次，使用TUNEL试剂盒（Roche Diagnostics，编号11684795910）染色检测凋亡。使用光学显微镜（Zeiss Axio Imager，德国耶拿）在高倍率（×400）下观察三个区域，统计CA1区域的TUNEL阳性细胞数量。
**统计分析**
数据使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美国加州圣地亚哥）和Python（版本3.10，荷兰）进行分析。统计显著性标准为P<0.05。描述性统计用于总结基线特征。连续变量呈正态分布时，表示为均值±标准差；而非正态分布的连续变量则用中位数和四分位数范围 [M (P25–P75)] 表示。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。生存率通过Kaplan–Meier分析和对数秩检验进行评估。各组在不同时间点的神经功能障碍（NDS）通过Kruskal-Wallis检验进行评估。后续的多重成对比较使用了Benjamini、Krieger和Yekutieli的两阶段逐步法来控制假发现率（FDR）。分类变量以频率和百分比 [n (%)] 形式总结。对于正态分布的连续变量，使用独立样本t检验；对于非正态分布的连续变量，使用Wilcoxon秩和检验；对于分类变量，使用χ2检验。缺失数据通过连续变量的中位数和分类变量的众数进行插补。年龄与MTH对生存概率的交互作用通过随机森林模型进行评估。使用部分依赖图（PDPs）增强了模型的可解释性，这些图表显示了每个预测因子及其交互作用对预测结果的边际影响。模型性能通过袋外准确率和接收者操作特征曲线下面积（AUC）进行评估。
**结果**
**MTH在OHCA患者中的生存益处随年龄增长而减弱**
根据预定义的纳入和排除标准，从三个数据库中共识别出660名符合条件的OHCA患者（图1A）。基线特征总结在表1中，365名患者（55.3%）未接受MTH，而295名患者（44.7%）接受了MTH。尽管某些变量的缺失值不可避免，但数据集中的整体缺失比例较低。这些缺失值的分布总结在表1中。平均年龄为62.4 ± 14.8岁，63.9%的患者为男性。与非MTH组相比，接受MTH的患者显著更年轻（60.1 ± 13.9岁 vs 64.2 ± 15.1岁，P < 0.001），且更可能出现初始可电击心律（33.9% vs 26.8%，P = 0.044）。MTH组的SOFA评分较低（9.3 ± 4.0 vs 10.2 ± 4.3，P = 0.005），ICU入院时的GCS评分中位数较高 [5.0 (IQR 3.0–7.0) vs 3.0 (IQR 3.0–5.0)，P = 0.001]。在性别（65.8% vs 62.5%，P > 0.05）、目击者（81.4% vs 76.2%，P > 0.05）或旁观者CPR（79.0% vs 73.7%，P > 0.05）方面，两组之间没有统计学上的显著差异。总体出院死亡率为61.8%。MTH组的出院死亡率显著低于非MTH组（55.3% vs 67.1%，P = 0.002）。
**表1. 患者的基线特征**
| 特征 | 全体（n=660） | 未接受MTH（n=365） | 接受MTH（n=295） | P值 |
|------------|-----------|-------------|-------------|-----------|
| 年龄（岁） | 62.4 ± 14.8 | 64.2 ± 15.1 | 60.1 ± 13.9 | <0.001 |
| 性别（男性，%） | 422（63.9%） | 228（62.5%） | 194（65.8%） | 0.380 |
| 初始心律（可电击，%） | 198（30.0%） | 98（26.8%） | 100（33.9%） | 0.044 |
| 目击者逮捕（%） | 518（78.5%） | 278（76.2%） | 240（81.4%） | 0.099 |
| 旁观者CPR（%） | 502（76.1%） | 269（73.7%） | 233（79.0%） | 0.121 |
| SOFA评分 | 9.8 ± 4.2 | 10.2 ± 4.3 | 9.3 ± 4.0 | 0.005 |
| GCS评分 | 4.0 (3.0–6.0) | 3.0 (3.0–5.0) | 5.0 (3.0–7.0) | 0.001 |
| 出院死亡率（%） | 408（61.8%） | 245（67.1%） | 163（55.3%） | 0.002 |
**随机森林模型显示年龄与MTH在预测生存概率之间存在显著交互作用**
随机森林模型识别出年龄与MTH在预测生存概率之间的显著交互作用（β = -0.15，P < 0.001，图2）。该模型表现稳健，袋外准确率为0.776，AUC为0.832。如图2所示，年轻患者接受MTH后的预测生存概率显著增加，尤其是在50岁以下的患者中（平均绝对生存概率差异 = +23.8%，P < 0.001）。在50至70岁之间，生存概率的益处逐渐下降（平均绝对生存概率差异 = +11.7%，P = 0.004）。在70岁以上的患者中，MTH和非MTH的生存曲线几乎重叠，表明没有益处（平均绝对生存概率差异 = +4.9%，P > 0.05）。
**基线和复苏特征**
研究中使用了183只大鼠，包括73只成年大鼠和111只老年大鼠。在成年大鼠中，46只（88.5%）恢复自主循环（ROSC），其中23只存活至实验终点（ROSC后第5天）。在老年大鼠中，77只（84.6%）恢复ROSC，其中27只存活至实验终点。成年组和老年组在体重、基线平均动脉压（MAP）和心率参数方面没有显著差异（所有P > 0.05）。对照组和MTH组在复苏特征（心脏骤停持续时间、肾上腺素剂量以及从心脏骤停到ROSC的时间）方面也没有显著差异（所有P > 0.05，表2）。
**MTH改善成年大鼠的生存率但未改善老年大鼠的生存率**
所有成功复苏的大鼠均纳入生存分析。在143只大鼠中，123只（86%）成功复苏。在成年组中，MTH组的5天生存率显著高于正常体温组（10/13 [76.9%] vs 13/33 [39.4%，P < 0.05）。在老年组中，MTH组和正常体温组的5天生存率没有显著差异（14/37 [37.8%] vs 13/40 [32.5%，P > 0.05）。所有组的生存时间变化在Kaplan–Meier曲线中显示（图3A，B）。
**MTH改善成年大鼠的神经功能但未改善老年大鼠的神经功能**
ROSC后24、48、72和96小时的神经功能障碍（NDS）在图3E，F中显示。在成年大鼠中，MTH组的NDS显著低于对照组（P < 0.05）。相反，在老年大鼠中，MTH组和对照组在4天内的NDS没有显著差异（P > 0.05）。ROSC后第5天的开放场地测试结果显示，MTH组进入中心区域的次数显著多于对照组（4.143 ± 1.069 vs 1.571 ± 0.787，P < 0.05）。在ROSC后第5天，MTH组在Y迷宫测试中的表现显著优于对照组（40.5 ± 23.5% vs 15.3 ± 17.0%，P < 0.05）。MTH降低了成年大鼠的海马神经元凋亡，但未影响老年大鼠。
**MTH降低成年大鼠的炎症细胞因子表达但未影响老年大鼠**
使用TUNEL染色评估了ROSC后第5天成年大鼠海马CA1区域的神经元凋亡情况。在成年大鼠海马CA1亚区检测到TUNEL阳性神经元（图4A-C）。值得注意的是，与对照组相比，MTH显著减少了TUNEL阳性神经元的数量。定量分析显示，MTH显著抑制了成年大鼠TUNEL阳性神经元的形成（34.67 ± 5.508% vs 56.0 ± 8.888，P < 0.05）。然而，在老年大鼠中未观察到这种神经保护效应，因为MTH未能抑制CA1区域内TUNEL阳性神经元的增加。
**讨论**
本研究表明，MTH的神经保护效果明显依赖于年龄。虽然MTH显著提高了成年大鼠的生存率、神经恢复、行为功能和炎症抑制，但在老年动物中这些益处明显减弱或消失。据我们所知，这是首次直接比较成年大鼠和老年大鼠在心脏骤停（CA）后MTH（低温疗法）效果的研究，并综合分析了全身性和中枢性炎症以及神经元凋亡的情况。我们的发现与先前的研究结果一致，这些研究表明低温疗法通过抑制凋亡途径和调节神经炎症来减轻缺血-再灌注损伤[20]、[21]。在5天终点之前死亡的动物被排除在神经功能评分（NDS）分析之外。死亡率结果与神经功能评估结果一致；尽管不能完全排除生存偏差的影响，但这种一致性支持观察到的NDS差异更可能代表真正的治疗效果，而不仅仅是生存差异所致。
在成年大鼠中，MTH减少了海马区的神经元凋亡，并降低了血清和海马区IL-6及IL-17的水平，这支持了低温疗法在抑制缺血后无菌性炎症中的作用。这些细胞因子是缺血后神经炎症和血脑屏障破坏的关键介质，其抑制与改善预后相关[22]、[23]、[24]。MTH未能降低老年大鼠的IL-6和IL-17水平，这可能反映了与年龄相关的免疫功能根本变化。衰老与免疫衰老和基线炎症状态（“炎症老化”）有关，其特征是IL-6水平升高以及Th17细胞极化增加和IL-17过度产生[25]。这种长期激活的免疫状态可能使老年动物对外部施加的抗炎调节（如低温疗法）产生抵抗。此外，老年生物在急性损伤后炎症消退能力受损，包括中性粒细胞浸润延长和细胞因子清除延迟[26]、[27]。例如，实验模型显示，尽管存在炎症消退信号，老年小鼠的IL-6水平仍然升高。同时，由于NF-κB持续激活以及热休克蛋白和冷响应转录调节因子表达减少，老年组织对冷却的分子反应可能减弱[28]。总体而言，这些机制可能是MTH在老年大脑中无法调节炎症反应的原因，从而减弱了其神经保护作用。
多项临床前研究已经证实，2小时的MTH方案可以改善年轻成年大鼠心脏骤停模型中的神经功能[29]、[30]。然而，老年大鼠在心脏骤停后可能遭受更严重的缺血-再灌注损伤，较短的治疗时间可能不足以在老年群体中提供强有力的神经保护。未来的研究可以考虑系统地优化MTH方案，包括开始时间、目标核心温度和维持时间，以严格验证其对老年大鼠神经恢复的治疗效果。然而，如TTM和TTM2等临床试验未能证明MTH具有生存或神经益处[31]、[32]。鉴于大多数院外心脏骤停患者为老年人，这些发现表明探索适应年龄的神经保护策略对于更好地满足这一脆弱群体的需求具有价值。我们的发现通过提供直接实验证据，表明年龄显著改变了机体对低温的生理反应，特别是通过炎症和凋亡途径，从而弥合了这一转化科学上的差距。此外，在临床前研究中纳入老年动物模型对于提高神经保护干预措施的临床转化性至关重要，因为这些模型更能反映最常受到院外心脏骤停影响的患者群体。
在这项研究中，我们使用了窒息性心脏骤停模型，因为它被广泛用于评估全身性脑缺血-再灌注损伤。然而，室性颤动（VF）诱导的心脏骤停模型在心脏骤停和复苏过程中的血流动力学和病理生理特征与窒息不同。为了增强这些发现的转化解释并确定其临床普遍性，未来需要在其他成熟的临床前环境中（如VF诱导的心脏骤停）验证这些与年龄相关的炎症和凋亡反应。
本研究存在一些需要考虑的局限性：(a) 临床发现来自公共数据库的回顾性分析，由于无法避免选择和信息偏差，结果可能与实际临床情况不符。值得注意的是，CPR（心肺复苏）和心脏骤停的持续时间（心脏骤停后生存的关键预测因素）无法获得，这限制了混杂因素的调整并降低了组间可比性。(b) 为了确保成年大鼠和老年大鼠在复苏后存活至实验结束，采用了6分钟的窒息期。然而，这种方法可能只引起了轻微的损伤，而不是临床环境中常见的严重脑损伤，从而可能限制了准确模拟临床复苏情景下观察到的神经功能障碍的能力。(c) 啮齿动物大脑的代谢和血流动力学特征与人类不同，这强调了通过临床研究进行验证的必要性。(d) 该研究没有探讨轻度低温如何调节炎症细胞因子的具体信号通路。理解这些通路对于阐明低温的抗炎机制至关重要，并可能为制定更有针对性的治疗策略提供有价值的见解。(e) 由于老年大鼠的死亡率较高，本研究没有进行预先的统计功效计算。因此，该研究可能不足以检测某些治疗效果，可能导致第二类错误。(f) 我们没有进行详细的炎症反应时间进程分析。仅在两个时间点测量细胞因子限制了我们对心脏骤停后炎症时间动态的理解。
结论：MTH在成年大鼠心脏骤停后具有显著的神经保护作用，但在老年动物中未能达到类似的效果。MTH无法在老年大鼠中抑制IL-6和IL-17可能是由于与年龄相关的免疫激活、炎症消退能力受损以及对低温信号的反应减弱所致。这些发现表明年龄可能是影响神经保护效果的关键因素，为未来研究特定年龄的复苏策略以及进一步将老年模型纳入转化研究提供了方向。
**作者贡献声明：**
- 郝志：撰写初稿、方法学、数据管理。
- 陈斌杰：撰写初稿、方法学、数据管理。
- 裴天：验证、方法学、数据管理。
- 杨洪宁：资源提供、项目管理。
- 庄伟：资源提供、项目管理。
- 胡书群：撰写审稿与编辑、资金获取、概念构思。
- 徐铁：撰写审稿与编辑、资金获取、概念构思。
- 闫贤良：撰写审稿与编辑、项目管理、资金获取。
- 赵宁军：项目管理、方法学、概念构思。
- 苏成雷：撰写审稿与编辑、方法学、资金获取、概念构思。
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