基于机器学习的物理校准技术实现了在3D μPAD上对呼吸道病毒抗原的稳健多重检测

Jia-Xin Wang|Rui Wang|Si-Yi Wang|Ting Yang|Jian-Hua Wang

中国沈阳东北大学理学院化学系分析科学研究中心，邮编110819

摘要

诸如甲型流感病毒（IAV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和腺病毒（AdV）等呼吸道病毒常常同时存在，并表现出重叠的症状，这迫切需要快速、多重且可在现场使用的诊断方法。本文报道了一种基于掺铽碳氮化物纳米片（Tb-BCNNS）的硼酸功能化荧光免疫传感器。抗体通过与Fc糖链的硼酸-顺式二醇相互作用以一步法固定，形成定向的传感界面，在抗原结合时产生明显的荧光淬灭现象。通过将该传感器与均相检测方法和三通道3D μPAD结合，我们实现了对三种病毒抗原（IAV核蛋白、RSV核蛋白和AdV六邻体蛋白）的同时检测。均相格式的检测限分别为1.06、1.02和1.14 ng/mL，而纸质格式的检测限分别为1.88、1.62和2.16 ng/mL，并且可以在20分钟内完成多重分析。为了提高基于智能手机的读数的稳健性，我们进一步引入了“机器学习+物理”校准工作流程：SHAP分析用于识别主要的成像/环境干扰因素，基于物理的模型用于补偿环境光和拍摄角度引起的荧光偏差。加标唾液测试证实了结果的可靠性，证明了其在实际样本中的可行性。总体而言，这项工作提供了一种集成的传感和校正策略，适用于快速多重呼吸道病毒检测，具有很强的实际POCT应用潜力。

引言

呼吸道病毒病原体是呼吸道感染的主要原因，对全球公共卫生构成重大威胁[1]。根据美国CDC的数据，在2024-2025年流感季节，呼吸道病毒导致了超过31万例住院病例和1.3万例死亡。在这些病原体中，甲型流感病毒（IAV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和腺病毒（AdV）尤其普遍且具有临床重要性[2]、[3]、[4]。这些感染的临床症状非常相似，如发热、咳嗽和呼吸困难，因此仅凭症状很难区分这些病毒[5]。然而，不同病毒之间的临床管理策略存在显著差异。对于IAV，神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦）是一线抗病毒药物；对于RSV，利巴韦林仅作为特定高风险人群的辅助治疗；而对于AdV，目前没有常规使用的特异性抗病毒药物，管理主要是支持性的[6]、[7]、[8]。然而，基于症状的管理如果没有及时的病因诊断，可能会错过流感抗病毒治疗的最佳时机，这突显了通过准确病原体识别进行针对性治疗的必要性[9]、[10]。因此，准确识别这些病毒对于早期诊断、治疗和及时预防至关重要。

目前，主要的诊断方法包括病毒分离和培养、血清学检测以及核酸扩增技术[11]、[12]、[13]。病毒分离和培养仍然是呼吸道病毒检测的金标准，具有很高的特异性，但耗时且技术要求高。血清学检测主要检测患者血清中的特异性抗体，但这种方法有较长的窗口期，限制了其在早期诊断中的价值。核酸扩增技术可以快速检测病原体基因组，但受到复杂引物设计、依赖精密仪器和高检测成本的限制。作为一种方便的现场检测技术，即时检测（POCT）近年来在呼吸道病毒感染筛查中显示出显著的价值[14]、[15]。POCT无需专门的实验室设施或大型设备即可实现快速诊断，有效降低了患者住院期间的交叉感染风险，为家庭自我检测提供了极大便利[15]、[16]。侧向流动免疫测定（LFIA）被认为是最有前景的POCT方法之一[17]、[18]。然而，其灵敏度较低且无法进行定量分析，限制了其应用。近年来，基于纸张的微流控分析设备（μPAD）因其多通道、低样本消耗、低成本和易于功能修饰等固有优势而在POCT应用中受到越来越多的关注[19]、[20]、[21]。它们在提高检测灵敏度、实现定量分析和同时检测多个目标方面展现出巨大潜力。目前，针对呼吸道病毒的POCT研究主要集中在多抗体结合、信号放大策略和便携式读数设备的开发上。例如，空间编码的多重LFIA可以实现预定义位置的视觉或仪器辅助读数[18]、[22]；引入基于杂交链反应（HCR）的等温核酸扩增策略可以放大目标衍生信号，从而提高分析灵敏度[23]；基于智能手机的信号读数（例如，结合应用程序分析的相机成像）允许对比色结果进行定量解释[16]、[24]。然而，仍存在一些挑战：首先，多重检测技术经常面临不同通道之间“交叉干扰”的风险；其次，大多数新型信号放大策略的复杂制造过程与POCT的基本原则（低成本、简单性和便携性）不兼容；第三，结果解释严重依赖于主观的视觉评估，阻碍了在复杂环境中的客观分析。因此，迫切需要开发一种具有高特异性、易于制备、操作方便且能够进行客观定量分析的传感器。

为了解决这些挑战，我们提出了一种适用于均相和纸质格式的双模式传感方法，用于同时检测呼吸道病毒。使用硼酸功能化的掺铽碳氮化物纳米片（Tb-BCNNS）作为荧光传感器（方案1）。抗体通过与抗体糖链的硼酸-顺式二醇相互作用直接连接到Tb-BCNNS上（所得传感器称为AB-Tb-BCNNS），实现一步法、无需额外交联剂的结合。抗原结合后，AB-Tb-BCNNS的荧光显著减弱，从而无需额外的信号放大步骤即可实现敏感检测。将传感器与三通道3D μPAD集成后，进一步实现了设备内采样、通道化流体分配和并行读数，从而能够同时检测三种呼吸道病毒抗原。所有三种目标抗原的敏感分析可以在20分钟内完成，且无交叉反应。为了减少视觉/智能手机读数的主观性和变异性，我们进一步建立了“机器学习+物理模型”荧光标准化流程：SHAP分析用于识别和排序影响测量信号的关键成像/环境因素，随后使用基于物理的校正模型进行补偿，从而获得稳健且可重复的性能。总体而言，这些结果表明，3D μPAD传感器结合算法辅助的信号校正可用于呼吸道病毒抗原的多重检测，显示出在早期诊断和POCT方面的强大潜力。

部分摘录

硼酸功能化掺铽碳氮化物纳米片（Tb-BCNNS）的制备

首先使用微波辅助合成法制备Tb-C₃N₄，然后通过HATU/DIEA偶联反应与羧基苯硼酸（4-CPBA）进行硼酸功能化[25]。之后，通过超声波（800 W，12 h）剥离硼酸功能化的Tb-C₃N₄，得到Tb-BCNNS分散液。详细信息见支持材料。

AB-Tb-BCNNS的构建

用于制备抗IAV抗体偶联的Tb-BCNNS

Tb-BCN和Tb-BCNNS的表征

Tb-BCNNS的制备方法参照我们之前的工作（方案1A）。简而言之，通过微波法从硫脲制备Tb-C₃N₄，并通过HATU/DIEA偶联与4-CPBA进行功能化，形成Tb-BCN。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）用于鉴定Tb-BCN、Tb-C₃N₄和g-C₃N₄的官能团。如图1C所示，所有样品均显示出g-C₃N₄的特征红外特征：特别是呼吸振动

结论

总之，我们开发了一种硼酸功能化的荧光免疫传感器（AB-Tb-BCNNS），并将其与三通道3D μPAD集成，实现了对三种呼吸道病毒抗原（IAV核蛋白、RSV核蛋白和AdV六邻体蛋白）在均相和纸质格式下的多重检测。为了提高在实际成像条件下纸质读数的稳健性，我们引入了一种结合机器学习因素分析和基于物理的校正框架

CRediT作者贡献声明

Jian-Hua Wang：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。Jia-Xin Wang：撰写 – 原始草稿，数据管理。Rui Wang：数据管理。Si-Yi Wang：方法学。Ting Yang：撰写 – 审稿与编辑，方法学，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Ting Yang报告获得了中国国家自然科学基金的支持；Ting Yang还获得了中央高校基本科研业务费的支持；Ting Yang还获得了辽宁省优秀青年科学基金的支持；Jian-Hua Wang报告获得了

致谢

T.Y. 感谢中国国家自然科学基金（22374014, 22174011）、中央高校基本科研业务费（N25QNR010）和辽宁省优秀青年科学基金（2024JH3/10200011）的财政支持。J.H.W 感谢中国国家自然科学基金（22334003）的财政支持。特别感谢东北大学分析测试中心的仪器分析支持。

利益冲突声明

Ting Yang目前是东北大学化学系的教授。她于2014年在中国东北大学获得分析化学博士学位。2012-2013年，她作为访问学者在美国德克萨斯大学阿灵顿分校与Purnendu Dasgupta教授合作。她的研究主要集中在病原体检测、液体活检和基于噬菌体的传感平台方面。