全局转录调节因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic adenosine monophosphate receptor protein，CRP）在多种细菌中调控多样的细胞进程。研究人员所在团队此前报道，FIP52_09345（命名为crpR1）的转座子Tn4531插入会减弱鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer）的毒力，该基因编码一种不含螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）基序的特殊CRP蛋白。序列分析表明，根据开放阅读框（open reading frame，ORF）长度，R. anatipestifer crpR1可分为三个亚型：crpR1a、crpR1b和crpR1c。在52株菌株中，42株携带crpR1a；CrpR1b和CrpR1c同时含有CRP结构域和HTH基序，而CrpR1a缺乏HTH基序。crpR1a序列存在两个等位基因，部分菌株的crpR1b起源于crpR1a的等位基因1，而CH3株的crpR1c起源于crpR1a的等位基因2。点突变和插入序列可能在crpR1的进化中发挥重要作用。此外，敲除Yb2株的crpR1a会使雏鸭毒力降低约1000倍，而敲除crpR1a的3'端（编码无序区）或其下游AS87_RS10485（编码HTH基序）也会导致Yb2株雏鸭毒力下降。另外，将Yb2株crpR1a ORF的450C451A突变为450G，会产生无致病性的Yb2 crpR1-450G突变体，其crpR1亚型转变为crpR1b；当该突变体的crpR1 ORF 3'端与HXb2或CH3株的crpR1一致时，突变体恢复对雏鸭的致病性。这些发现证实，适应性进化导致R. anatipestifer crpR1形成三个亚型。
鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer）是黄杆菌目（Flavobacteriales）威克斯氏菌科（Weeksellaceae）里默氏菌属（Riemerella）的模式种，主要感染家鸭、鹅和鸡，给全球养鸭业造成重大经济损失。目前已知该菌有21种血清型，即使同一血清型内毒力也存在显著差异，但其致病机制尚不明确。研究人员此前通过基于转座子Tn4351的标记诱变技术鉴定到17个对鸭疫里默氏菌在雏鸭体内存活和致病性至关重要的基因，其中包括编码特殊环腺苷酸受体蛋白（cyclic adenosine monophosphate receptor protein，CRP）家族转录调节因子的FIP52_09345（命名为crpR1）。经典CRP蛋白由负责二聚化和结合环腺苷酸的N端核苷酸结合结构域，以及负责识别并结合靶基因启动子区的C端螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）基序组成，广泛参与细菌的代谢、应激抵抗、生物膜形成及毒力调控。但研究人员发现，不同鸭疫里默氏菌分离株的crpR1开放阅读框（open reading frame，ORF）长度存在差异，其中部分菌株的CrpR1蛋白缺乏HTH基序，甚至曾被注释为假基因。基于此，研究人员开展本研究，旨在解析crpR1的进化规律及其在无HTH基序情况下的毒力调控功能，相关成果发表于《Journal of Bacteriology》。
为开展研究，研究人员首先检索GenBank数据库中截至2025年1月的51株鸭疫里默氏菌全基因组序列，以模式菌株ATCC 11845（1954年分离自美国病鸭）为核心，涵盖中国近30年分离的46株菌株，通过ClustalW法进行crpR1 ORF的多序列比对并构建系统发育树；利用ISfinder数据库和重复序列查找工具分析crpR1侧翼区域的插入序列（insertion sequence，IS）和重复元件；通过同源重组技术构建系列缺失突变体和点突变体，采用Reed-Muench法计算雏鸭半数致死量（median lethal dose，LD50），并通过组织载菌量测定评估毒力变化。
研究结果如下：
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鸭疫里默氏菌crpR1基因根据ORF碱基缺失分为三个亚型：比对分析显示，51株菌的crpR1均可分为三类：crpR1a（540 bp，编码179个氨基酸）、crpR1b（594 bp，编码197个氨基酸）和crpR1c（564 bp，编码187个氨基酸）。其中crpR1a占82.35%，包括模式菌株ATCC 11845，其下游存在一个重叠77 bp的小ORF AS87_RS10485，编码HTH基序；crpR1a存在两个等位基因，主要差异位于5'端的23个碱基替换（导致7个氨基酸差异）。crpR1b起源于crpR1a等位基因1的单碱基替换（540C541A→540G），crpR1c起源于crpR1a等位基因2的单碱基缺失（455A和556A），两种突变均导致移码并使ORF延长。CrpR1b和CrpR1c同时含CRP结构域和HTH基序，CrpR1a仅含CRP结构域。
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序列分析揭示鸭疫里默氏菌crpR1及邻近基因的进化特征：模式菌株ATCC 11845的crpR1属于等位基因1，提示其为最古老的亚型。系统发育树显示crpR1b-1与crpR1a等位基因1亲缘关系最近，crpR1c与crpR1a等位基因2亲缘关系最近。crpR1上下游各存在一个超可变区（hypervariable region，HVR）：HVR1（上游128–180位）和HVR2（下游795–840位），这两个区域存在大量碱基插入、替换及插入序列，包括ISRa1、IS1182、IS982等，表明插入序列在crpR1进化中起重要作用。
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CrpR1参与鸭疫里默氏菌Yb2株的毒力调控：敲除Yb2株的crpR1后，突变体Yb2ΔcrpR1的生长曲线与野生株无显著差异，但雏鸭LD50从4.0×106CFU升高至4.2×109CFU（降低约1000倍），感染后24小时血液、肝脏和脑组织载菌量显著下降，证实CrpR1是Yb2株毒力必需的。
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Yb2株crpR1 ORF中450C451A→450G的突变导致毒力丧失：将该位点突变为单碱基G后，突变体Yb2 crpR1-450G的crpR1亚型转变为crpR1b，蛋白获得HTH基序，但生长无变化，雏鸭LD50≥1010CFU（较野生株降低2500倍以上），组织无细菌检出，解释了为何自然分离株多为crpR1a而非crpR1b。
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crpR1 ORF 3'端突变增强Yb2 crpR1-450G的致病性：将Yb2 crpR1-450G的3'端改造为与HXb2或CH3株一致，分别获得突变体Yb2 crpR1-450G-HTHHXb2（LD50=8.54×107CFU）和Yb2 crpR1-450G-HTHCH3（LD50=4.15×109CFU），前者毒力更强。进一步构建5个点突变体发现，591T>C、586C>T和559C>A突变可使非致病株恢复部分致病性，60%（6/10）接种1010CFU m450G-591C的雏鸭死亡。
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敲除crpR1的无序区或下游AS87_RS10485的起始密码子均降低Yb2株毒力：删除CrpR1a C端的无序区（氨基酸残基154–179）后，突变体Yb2 crpR1-460T的LD50升至7.14×108CFU（降低约180倍）；突变下游AS87_RS10485的三个起始密码子（ATG→ACG）后，突变体Yb2ΔAS87_RS10485的LD50升至5.28×108CFU（降低约130倍），两组组织载菌量均显著低于野生株，表明两者均参与毒力调控。
讨论部分总结：细菌的适应性进化通过突变和自然选择实现，鸭疫里默氏菌仅能在宿主体内增殖的突变株才能存活。本研究表明，点突变和水平基因转移（horizontal gene transfer，HGT）（包括插入序列、噬菌体和质粒）介导的同源重组或非同源重组，共同驱动crpR1进化。crpR1a是祖先亚型，其下游AS87_RS10485编码的HTH基序与自身C端无序区协同调控毒力，使携带crpR1a的菌株更具生存优势；而crpR1b和crpR1c仅在获得特定3'端突变后才恢复致病性，因此未被广泛分离。此外，中国作为全球70%鸭群的养殖国，鸭疫里默氏菌感染压力大，可能加速了该基因的进化。未来研究将进一步解析CrpR1调控毒力的具体分子机制。
研究结论：点突变与水平基因转移（插入序列、噬菌体、质粒）可独立或与同源重组共同作用，参与鸭疫里默氏菌crpR1的进化，适应性进化最终形成了crpR1的三个亚型。
