玛丽亚姆·卡拉马蒂|马赫迪·拉海
纳米生物技术和仿生学系，生命科学与工程学院，跨学科科学技术学院，德黑兰大学，德黑兰，14399-57131，伊朗
**摘要**
背景
乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断对于提高治疗效果至关重要。在这项研究中，我们开发了一种双信号比色纳米生物传感器，用于同时检测两种与乳腺癌相关的microRNA：miR-145和miR-21。
**方法**
该纳米生物传感器利用目标触发的杂交链反应（HCR）生成G-四联体DNA酶，通过OPD氧化（在425 nm处）来检测miR-145。对于miR-21，目标诱导的杂交导致金纳米颗粒（AuNPs）聚集，并在535 nm处产生吸收峰。在多重分析中，miR-145对两种信号都有贡献，而miR-21特异性地影响535 nm处的吸收峰，从而实现同时定量。
**结果**
该纳米生物传感器在检测目标microRNA方面表现出优异的灵敏度和特异性，miR-145的检测限（LOD）低至0.15 nM，miR-21的检测限低至0.12 nM。观察到强烈的线性相关性，R2值分别为0.9887（miR-145）和0.9711（miR-21）。纳米生物传感器能够单独和同时区分目标microRNA，同时使用miR-195和miR-155作为非目标来验证其高特异性。
**意义**
在涉及同时检测两种目标的实验中，纳米生物传感器的检测限在0.01–0.4 nM范围内，进一步证实了其稳定性和高效的多重检测能力。总之，所开发的双miRNA检测平台为乳腺癌的早期筛查提供了强有力的测定方法，并显示出在临床多重诊断检测中的巨大潜力。
**引言**
根据世界卫生组织发布的最新统计数据，2022年全球报告了约230万例新发乳腺癌病例[1]。预测表明，如果当前趋势不变，到2050年，乳腺癌的全球负担将大幅增加，新发病例数将增加50%以上，相关死亡率将增加70%以上[2,3]。尽管在高收入国家，在早期诊断和治疗结果方面取得了显著进展，但在低收入和中等收入地区，该疾病的负担仍然很高，主要是由于筛查、治疗设施和技术人员不足。传统的诊断方法（包括乳腺X线摄影、磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）、超声波和活检）成本高昂、耗时较长，不适用于频繁或早期筛查。因此，开发快速、灵敏且成本效益高的乳腺癌早期检测策略变得至关重要[[4], [5], [6], [7], [8]]。为了解决这一需求，无创生物标志物和简单的检测平台非常受欢迎。
microRNA（miRNAs）是调节转录后基因表达的小型非编码RNA（22-25 bp），作为癌症诊断和预后的无创生物标志物受到了广泛关注[9,10]。特定miRNAs的失调，特别是致癌miR-21（上调）和肿瘤抑制miR-145（下调），与乳腺癌的发生和发展密切相关[11,12]。定量PCR（qRT-PCR）是目前miRNA检测的金标准，因其高灵敏度。然而，它依赖于多步骤样品制备（如RNA提取、纯化和逆转录），以及复杂的引物设计，限制了其实际应用。其他方法（如Northern blotting、微阵列和下一代测序）要么耗时，要么技术复杂，要么成本高昂。因此，需要稳健、高灵敏度且易于操作的替代方法。为了满足这一需求，已经探索了基于发光、荧光、电化学发光、表面等离子共振和微芯片电泳的各种生物传感策略[[13], [14], [15]]。其中，比色生物传感器结合了简单性和低成本的优点。
比色生物传感器具有高准确性、快速响应、用户友好性和低成本，可以通过肉眼观察可见的颜色变化或使用便携式光学读数器和简单仪器进行目标检测[16,17]。金纳米颗粒（AuNPs）因其局部表面等离子共振（LSPR）特性而被广泛用于比色生物传感器中，这种特性取决于颗粒间的距离，能够产生高度灵敏的信号，并且读数简单。根据大小、形状和聚集状态，AuNPs会产生不同的颜色[[18], [19], [20]]。虽然基于酶的扩增方法可以增强比色信号强度，但酶试剂通常成本高昂且热稳定性差。为了克服这些限制，引入了无酶等温核酸扩增方法，如杂交链反应（HCR）、滚环扩增（RCA）、链置换扩增（SDA）、环介导的扩增（LAMP）和基于核酸序列的扩增（NASBA）来增强信号[21,22]。HCR具有显著的优点，包括简单性、低操作要求和高灵敏度。这是通过互补发夹探针在恒定温度下自发、目标触发的聚变为长双链DNA组装来实现的，从而实现高效信号放大[23,24]。DNA酶是具有催化特性的单链DNA分子，也在生物传感中作为有效的信号转导器出现。特别是富含鸟嘌呤的DNA序列可以折叠成G-四联体结构，与血红素形成G-四联体/血红素复合物。这些DNA酶表现出类似过氧化酶的催化活性。这些构建体由于成本低、化学稳定性高和特异性结合少，被广泛用于比色、荧光和电化学测定中，用于检测金属离子、核酸、蛋白质和小分子[[25], [26], [27]]。因此，将这些元素结合到一个平台上对于灵敏和实用的miRNA检测具有巨大潜力。
虽然已经报道了多种用于多重miRNA检测的比色测定方法，但每种方法都有显著的缺点。李等人[28]使用了一种需要暗场显微镜、T4连接酶和多步骤程序（至少包括八个离散步骤：封闭、杂交、连接、洗涤和信号放大）的水凝胶微流控芯片。龚等人[29]开发了一种CRISPR/Cas12a AND门控系统，只能给出二元答案（是/否），没有单独定量，并涉及多个步骤（例如，两次磁分离、CRISPR激活和比色 Development）。阿萨多拉希等人[30]使用分离的DNA酶实现了0.43 nM的检测限，但处于信号关闭模式。李等人[31]使用EXO III酶达到了3 pM的检测限。梁等人[32]在活细胞中使用荧光成像达到了1.4-2.0 pM的检测限。即使是最近的平台（2025-2026年），仍然比较复杂：碳点传感器需要UV-Vis和荧光读数[33]；双比色DNA酶平台需要磁分离[34]；AND门控DNA酶电路提供飞摩尔灵敏度，但只有二元输出[35]；CRISPR/Cas12a系统依赖于昂贵的Cas蛋白[36]；Y形金纳米探针只能检测一个目标[37]。相比之下，当前的纳米生物传感器只需要一个4小时的孵育步骤，无需洗涤、分离或酶。读数只需要基本的UV-Vis分光光度计（甚至肉眼），而上述方法需要暗场显微镜、荧光成像系统或磁分离器。操作需要最小的培训（移液和读取吸光度），不像微流控、CRISPR处理或图像分析所需的专门技能。
与这些方法相比，纳米生物传感器在标准试管中进行——无需微流控、无需磁分离、无需酶。最重要的是，与单独的水凝胶帖子[1]、单一组合信号[2,8]或二元输出[2,8]不同，我们的平台可以在一个溶液中同时检测miR-21和miR-145，同时还能单独量化每个目标，而不会出现交叉反应。这种组合——一锅法、无酶、最少设备（仅需要UV-Vis）、低成本、操作者技能要求低以及真正的多重但可分离的检测——使纳米生物传感器特别适合于现场护理和资源有限的场合。
在这项研究中，我们提出了一种基于柠檬酸封端的AuNPs的无酶双信号比色纳米生物传感器，用于同时检测致癌miR-21和肿瘤抑制miR-145。通过结合HCR扩增、AuNPs的比色信号和DNA酶的催化活性，该平台提供了一种低成本、高灵敏度和多重的乳腺癌早期诊断策略。
**试剂和化学品**
我们从Sigma-Aldrich（美国）和Merck（德国）购买了氯金酸（HAuCl4）、柠檬酸三钠（Na3C6H5O7）、氯化铵（NH4Cl）、氯化钾（KCl）、Tris-HCl、Triton X-100、过氧化氢（H2O2，30%）、o-菲伦二胺（OPD）、二甲基亚砜（DMSO）和血红素（分析级）。合成DNA寡核苷酸从Metabion公司（德国）获得。所有水溶液均用去离子水配制。
**寡核苷酸探针的设计和合成**
在这项研究中，设计了四种DNA探针。
**工作原理**
本研究旨在开发一种纳米生物传感器，用于同时检测两种与乳腺癌相关的microRNA：miR-145（下调）和miR-21（上调）。如图1所示，该工作利用基于设计的核酸结构和两种互补的比色机制的传感平台。策略包括使用HCR的扩增方法生成催化DNA酶结构，并利用AuNPs的独特光学特性（针对miR-145）。
**结论**
使用miRNA生物标志物进行乳腺癌的早期检测，与传统临床诊断方法相比，具有更高的灵敏度和特异性。本研究开发了一种双目标传感系统，能够同时检测两种与乳腺癌相关的生物标志物：miR-145和miR-21。检测通过独立机制实现：(i) 由HCR过程中形成的G-四联体DNA酶催化的OPD氧化；(ii) 在探针杂交存在下AuNPs的聚集。
**声明**
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
**致谢**
作者衷心感谢伊朗国家科学基金会（INSF）和伊朗纳米技术创新委员会（INIC）（授权号4039824）提供的财务支持，以及德黑兰大学的管理和仪器支持。
