对外膜囊泡进行温度依赖性的蛋白质组学分析后发现，Pseudomonas plecoglossicida中与毒力相关的蛋白质含量较高

刘月江波|姜敏|奚霞|张超正|谢建军|王伟|王庚申|徐文军

浙江海洋大学渔业学院，舟山316022，中国

摘要

Pseudomonas plecoglossicida是一种对温度敏感的鱼类病原体，对水产养殖构成了严重威胁，但温度如何影响其外膜囊泡（OMVs）中的蛋白质成分仍不清楚。在此，我们使用基于DIA的LC-MS/MS技术比较了在18°C和28°C下产生的OMV蛋白质组。共鉴定出1471种差异表达蛋白质（DAPs），其中18°C时659种蛋白质上调，812种蛋白质下调。功能富集分析显示，18°C时上调的蛋白质主要与DNA修复、信号传导和代谢途径相关，而下调的蛋白质则主要与运输和膜结构有关。几种与OMV相关的蛋白质在18°C时明显上调，包括III型和VI型分泌系统的组分、一种AMP结合蛋白、一种patatin样磷酸脂酶家族蛋白（PNPLA3283）、一种TauD/TfdA家族双加氧酶、一种AraC家族转录调节因子（AraC2016）以及一种T3SS顶端蛋白LcrV。删除PNPLA3283、AraC2016或lcrV会降低P. plecoglossicida对大黄鱼的毒力。值得注意的是，删除lcrV显著提高了宿主的存活率并减少了脾脏结节。这些结果表明，低温改变了OMV的蛋白质组成，使其更倾向于与宿主相互作用和环境适应相关，并确定LcrV是一个重要的决定因素。本研究为P. plecoglossicida的OMV蛋白质组在温度依赖性变化方面提供了新的见解。

引言

Pseudomonas plecoglossicida是一种革兰氏阴性细菌病原体，最初被确定为日本纯黄鱼（Plecoglossus altivelis）细菌性出血性腹水病的病原体（Nishimori等人，2000年）。随后，它被发现是影响全球多种鱼类的主要病原体，特别是导致大黄鱼（Larimichthys crocea）“内脏白斑病”，其特征是内部器官上形成白色结节（Zhang等人，2014年）。P. plecoglossicida已被证明是一种温度依赖性病原体（Huang等人，2018年；Huang等人，2019年），感染和疾病爆发主要发生在12°C至20°C的低温范围内（Li等人，2020年；Tao等人，2016年）。在大黄鱼养殖过程中，由P. plecoglossicida引起的内脏白斑病是最严重的细菌感染之一，通常导致高死亡率和经济损失。

温度是影响P. plecoglossicida毒力的关键环境因素。多项研究表明，P. plecoglossicida的致病性依赖于温度，在较低温度下毒力明显增强（Huang等人，2018年；Tao等人，2016年）。例如，Tao等人（Tao等人，2016年）报告称，溶血素共调节蛋白（Hcp）——VI型分泌系统（T6SS）的关键组分，在20°C时高度上调，与细菌毒力的增加相关。进一步的比较转录组学和蛋白质组学分析表明，在较低温度下，多种与毒力相关的基因和蛋白质显著上调，从而增强了病原体的感染性。值得注意的是，关键T6SS组分如hcp、dotU和icmF在18°C时的表达明显增加（Huang等人，2018年），这有助于增强细菌的毒力。此外，在较低温度下，参与吡咯哆呤生物合成的基因也上调。吡咯哆呤是Pseudomonas中的主要铁载体，在宿主铁限制条件下发挥关键作用（Huang等人，2018年）。此外，替代sigma因子RpoE作为一种温度响应调节因子，在控制P. plecoglossicida中的T6SS表达、生物膜形成和巨噬细胞内的复制中起重要作用（Zhang等人，2023年）。这些结果表明，分泌系统、铁获取和全局应激响应调节因子在P. plecoglossicida的温度依赖性致病性中起着关键作用。

尽管已经对这些较低温度下的转录和蛋白质组学反应有了了解，但细胞外毒力传递系统（特别是外膜囊泡（OMVs）在温度依赖性致病性中的作用仍知之甚少。近年来，细菌膜囊泡（包括OMVs）越来越被认为是通过介导毒力因子运输和宿主-病原体相互作用来促进细菌致病性的关键因素（Xiu等人，2024年）。细菌会自然释放纳米级细胞外囊泡（EVs），直径通常在20到400纳米之间（Toyofuku等人，2019年）。来自革兰氏阴性细菌的EVs通常被称为OMVs，OMVs从母细胞中选择性包装特定的分子货物，包括蛋白质、DNA、RNA、脂多糖（LPS）和多种代谢产物（Schwechheimer和Kuehn，2015年；Tulkens等人，2020年）。OMVs含有多种生物活性货物，如毒素、RNA、分泌系统组分、酶和信号分子。这些囊泡是一种重要的非经典分泌途径，参与多种与毒力相关的过程，包括宿主免疫调节、细胞间通讯、促进生物膜形成以及在感染期间传递毒力因子（Guerrero-Mandujano等人，2017年；Lee等人，2016年；Toyofuku等人，2019年；Xiu等人，2025年）。

最近的蛋白质组学研究表明，细菌OMVs含有有助于水生动物病原体生存、适应性和免疫调节的毒力因子。例如，由引起弧菌病的Vibrio ordalii产生的OMVs已被证明携带RTX毒素以及促进宿主感染的铁和血红素吸收蛋白（Echeverría-Bugueño等人，2020年）。同样，由引起对虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）的Vibrio parahaemolyticus产生的OMVs已被证明携带多种与毒力相关的组分，包括毒素蛋白PirA^vp和PirB^vp以及免疫调节蛋白，这些在疾病发展中起关键作用（Wang等人，2024年）。此外，来自Photobacterium damselae亚种Piscicida（phdp）的OMVs已被鉴定为外膜蛋白和其他抗原成分的载体，这些成分有助于细菌逃避宿主的抗菌肽并引发鱼的免疫保护（Teixeira等人，2023年）。尽管取得了这些进展，但OMVs在温度依赖性致病性调节中的作用仍大部分未得到探索。P. plecoglossicida在较低温度下表现出增强的毒力。然而，P. plecoglossicida产生的OMVs及其在温度依赖性致病性中的作用尚未得到充分研究。

在这项研究中，我们证明了P. plecoglossicida在体外和宿主感染期间都会产生OMVs。为了探索它们在温度依赖性致病性中的潜在作用，我们使用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和定量LC-MS/MS蛋白质组学技术系统地分析了在18°C和28°C下分泌的OMVs。比较蛋白质组学分析显示OMV蛋白质组成存在明显的温度依赖性差异。特别是，18°C下产生的OMVs富含多种与毒力相关的蛋白质，删除编码代表性OMV相关因子的三个基因（PNPLA3283、AraC2016和lcrV）显著降低了P. plecoglossicida对大黄鱼的毒力。总的来说，我们的发现表明P. plecoglossicida的OMV蛋白质组随温度变化，且在低温下产生的OMVs含有更多与毒力和环境适应相关的蛋白质。这项研究提供了不同温度条件下P. plecoglossicida OMVs的全面蛋白质组谱，提高了我们对温度相关细菌适应性的理解。这些结果还为未来的基于OMV的水产养殖诊断和疫苗开发提供了候选标志物和靶点。

章节片段

伦理声明

本研究中的所有动物实验均获得了浙江省海洋渔业研究所（2025008）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

细菌菌株和培养条件

本研究使用了从患病的大的黄鱼中分离出的P. plecoglossicida菌株1403001。该菌株在28°C下培养于胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）培养基或TSB琼脂平板（TSA）上。对于温度依赖性实验，将过夜培养的菌液（1%，v/v）接种到新鲜的TSB培养基中

Pseudomonas plecoglossicida 1403001菌株在不同温度下在体外产生OMVs

由于P. plecoglossicida通常在低温下引起疾病爆发，因此在不同温度条件下检测了OMVs的产生情况。对在18°C和28°C下培养的P. plecoglossicida 1403001进行的TEM分析显示，细菌细胞周围有许多球形囊泡（图1A-D）。这些囊泡表现出典型的OMVs形态特征，包括双层膜结构和预期大小的直径。为了确认这一点

讨论

细菌OMVs日益被认为是细菌交流和宿主-病原体相互作用的关键媒介，它们在毒力因子的传递、免疫调节和应激适应中发挥作用（Toyofuku等人，2023年）。P. plecoglossicida是大黄鱼内脏白斑病的致病因子，在低温下主要引起疾病爆发（Huang等人，2018年；Tao等人，2016年）。然而，

CRediT作者贡献声明

刘月江波：撰写——初稿、可视化、验证、调查。姜敏：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学、资金获取、概念化。奚霞：验证、调查。张超正：可视化、资源。谢建军：监督、资源。王伟：资源、方法学。王庚申：验证、资源。徐文军：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了浙江省自然科学基金（资助编号：LQN25C190015）、国家自然科学基金（资助编号：32503050）、国家重点研发计划（资助编号：2024YFD2401704）、舟山渔业养殖与苗种培育科技创新中心专项项目（资助编号：2025Y001-6）和浙江省海洋渔业研究所科学技术计划（资助编号：HYS-CZ-202504）的支持。