奥伊安娜·拉切雷（Oïhana Latchere）、伊莎贝尔·梅泰（Isabelle Métais）、哈娜娜·佩兰-埃塔贾尼（Hanane Perrein-Ettajani）、玛格丽·勒穆安（Magalie Lemoing）、阿涅斯·费尔特-马泽尔（Agnès Feurtet-Mazel）、朱利安·吉高（Julien Gigault）、穆罕默德·穆卢德（Mohammed Mouloud）、阿梅莉·沙特尔（Amélie Châtel）、玛格丽·博德里蒙（Magalie Baudrimont）
法国西部天主教大学，BIOSSE实验室，安德烈·勒罗伊广场3号，昂热
**摘要**
塑料污染日益被视为河口生态系统中的关键问题，对水生生物构成潜在威胁。尽管河口是塑料从陆地来源进入海洋的关键过渡区，但其在这些环境中的生态命运和影响仍研究不足。特别是，微塑料和纳米塑料（NPs）通过食物链的传递及其相关的健康风险仍知之甚少。本研究旨在评估河口双壳类动物Scrobicularia plana因食物链暴露于不同类型纳米塑料而产生的生态毒性后果。海洋微藻Tetraselmis suecica被暴露于环境相关浓度的纳米塑料（0.008、10和100 µg/L）中48小时。研究了两类纳米塑料：从野外收集的宏观塑料衍生出的环境纳米塑料（ENV NPs）和商业聚苯乙烯纳米颗粒（PS NPs）。藻类暴露后，Scrobicularia plana个体被喂食含有纳米塑料的藻类，并在个体和生化水平上评估了其生物反应。
**结果**
研究表明，食物链暴露于纳米塑料主要引发了氧化应激，表现为过氧化氢酶（CAT）活性增加，但条件指数、清除率或免疫反应没有统计学上的显著变化。最后，将此次食物链传递实验的结果与之前在实验室条件下直接暴露于纳米塑料的研究结果进行了比较。
**1. 引言**
日常生活中塑料的广泛使用导致了全球范围内的严重环境污染（Geyer等人，2017年）。塑料是海洋环境中最常见的垃圾，占所有海洋垃圾的至少85%（联合国环境规划署，2021年）。塑料垃圾在海洋（Andrady，2015年；Harris等人，2023年）、沿海水域（Le等人，2024年）和河口（Vermeiren等人，2016年；Wright等人，2013年；Sadri和Thompson，2014年；Pinheiro等人，2021年）中普遍存在。排放的宏观塑料由于紫外线辐射、温度波动、波浪和风的作用、沉积物磨损和/或生物降解而破碎（Kale等人，2015年；So等人，2022年；Song等人，2017年；Andrady等人，2022年）。塑料风化会产生微米级的碎片，称为微塑料（MPs），其尺寸小于5毫米（Browne等人，2007年；Fendall和Sewell，2009年），以及纳米塑料（NPs），尺寸在1到1000纳米之间（Klaine等人，2008年；Gigault等人，2018年）。许多研究调查了大型塑料和微塑料在水生生物上的积累情况（Song等人，2014年）。然而，尽管纳米塑料具有独特的化学、物理和机械特性，相关研究仍然有限。尺寸、形状、电荷和其他性质等因素影响纳米塑料的移动性、生物可利用性和生态命运（Li等人，2023年；Liu和Liu，2021年；Slaveykova和Marelja，2023年；Wang等人，2023年），通常较小颗粒在相同质量浓度下表现出更高的毒性（Santo等人，2014年）。此外，虽然有关环境微塑料存在和分布的定量数据可用，但用于量化环境样本和生物体内纳米塑料的标准可靠方法仍缺乏（Costa等人，2016年；Koelmans等人，2015年）。此外，由于纳米塑料的纳米级特性，尤其是其高比表面积，它们可能比微塑料具有更强的化学物质吸附能力（Koelmans等人，2015年；Costa等人，2016年）。在发现微塑料和纳米塑料可以在海洋生态系统中吸附和运输各种污染物后，塑料颗粒对生物体的影响引起了更多关注（Shi等人，2024年）。关于它们对水生生物的影响，现已明确纳米塑料可以轻易穿过生物屏障并在组织和器官中积累（Chae和An，2017年；Mattsson等人，2018年）。值得注意的是，纳米塑料在双壳类动物中的滞留时间比微塑料更长（Ward和Kach，2009年）。大多数研究微塑料和纳米塑料对生物体的毒性效应依赖于标准聚苯乙烯颗粒，这并不能准确反映水生环境中存在的塑料多样性（Rochman等人，2013年；Haegerbaeumer等人，2019年）。到目前为止，只有少数研究测试了从破碎塑料中获得的聚乙烯纳米塑料的毒性效应（Baudrimont等人，2020年）。北大西洋环流中收集的聚乙烯碎片产生的纳米塑料可能抑制绿色微藻Scenedesmus subspicatus的生长，并增加淡水双壳类动物Corbicula fluminea的粪便和伪粪便产量（Baudrimont等人，2020年）。此外，实验室暴露中使用的颗粒浓度通常在每升毫克到克之间，这高于环境中的实际浓度，因此不能完全代表环境情况。
纳米塑料在生态系统中的普遍存在引发了它们生物积累的问题，从而对生物体、食物网以及最终对人类健康的潜在威胁（Bakir等人，2014年）。先前的研究表明，微塑料及其相关污染物在淡水和海洋系统中的食物链传递；然而，这一现象在河口栖息地中了解不足。微塑料颗粒可以通过摄入、呼吸以及表皮渗透进入生物体（Ma等人，2021年；Watts等人，2016年）。迄今为止，许多研究报道了各种生物体摄入微塑料的情况，包括水生动物（Besseling等人，2015年；Cole等人，2013年）。在喂食了0.5微米聚苯乙烯微球的贻贝（Mytilus edulis）的螃蟹Carcinus maenas的胃、肝胰腺、卵巢和鳃中检测到了微塑料（Farrell和Nelson，2013年）。此外，Mattsson等人（2017年）证明，聚苯乙烯纳米颗粒（53纳米和180纳米）通过模拟的食物链从藻类（Scenedesmus sp.）传递到浮游动物（Daphnia magna），然后到鲤鱼（Carassius carassius），最终进入鱼脑细胞。由于生物体通过食物链暴露于纳米塑料，这些塑料颗粒可以在上层营养级的生物体内持续积累，并最终到达人类（Bergmann等人，2015年）。纳米塑料具有生物可利用性，最终可能被双壳类动物等海洋生物通过误食或摄入受污染的水而摄入（Koelmans等人，2015年；Ward等人，2019年）。此外，纳米塑料中添加剂的释放可能进一步增强其毒性（Egbeocha等人，2018年；Koelmans等人，2014年）。
内底栖双壳类动物Scrobicularia plana不仅具有生态和经济重要性，目前还被用作评估海洋生态系统健康状况的指示物种（Mouneyrac等人，2008年；2014年；Buffet等人，2014年；Châtel等人，2017年），尤其是对于纳米塑料（Labbé等人，2024年），因为它满足所有生物指示物的要求（广泛的地理分布、易于实验室采样和处理、对环境压力的高耐受性以及重要的食物来源）。与微塑料相比，很少有研究调查纳米塑料对双壳类动物的影响（Arini等人，2022年；Baudrimont等人，2020年；Chae和An，2017年；Lebordais等人，2021年；Sendra等人，2021年；Wegner等人，2012年），对Scrobicularia plana的研究更为罕见（Métais等人，2023年）。Scrobicularia plana可以从沉积物和水柱中吸收小颗粒，因此是研究这些环境中污染的重要模型（Ribeiro等人，2017年；Pequeno等人，2021年）。其定居的生活方式和滤食行为有助于纳米塑料的积累，从而能够详细评估其生物积累和潜在的毒性效应（Van Cauwenberghe等人，2015年）。此外，Scrobicularia plana广泛用于环境监测项目，提供了丰富的生理和生化数据，有助于解释实验结果（Fossi Tankoua等人，2013年）。研究表明，Scrobicularia plana可以对各种污染物产生可测量的反应，包括酶活性和免疫功能的改变，使其成为生态毒性研究的敏感指示物种（Mouneyrac等人，2008年）。因此，利用Scrobicularia plana进行纳米塑料影响研究可以提供有关这些新兴污染物生态风险的宝贵见解。然而，据我们所知，这是首次使用这种双壳类动物来评估纳米塑料在整个食物链中的潜在食物链传递（Latchere等人，2021年）。
我们假设，暴露于环境相关浓度的纳米塑料（无论是环境衍生的ENV NPs还是聚苯乙烯基PS NPs）会在Scrobicularia plana中引发可测量的生态毒性反应，且这些效应在性质或强度上不同于之前直接水传播暴露下的报告。本研究的目的是评估环境纳米塑料以及标准聚苯乙烯纳米塑料对河口双壳类动物Scrobicularia plana（鳃、消化腺）的生态毒性，这些纳米塑料通过食物链传递暴露于与环境估计浓度相关的三种不同浓度。对环境纳米塑料的尺寸和相关金属进行了表征。从亚个体（生化活性）到个体水平（条件指数、过滤率）评估了生物体的反应。使用了一个与大西洋河口相关的食物链模型，包括两种生物：微藻Tetraselmis suecica和双壳类动物Scrobicularia plana。本研究的创新之处在于将这种食物链暴露与之前使用类似纳米塑料、浓度和生物体通过水传播暴露的结果进行了比较。
**2. 材料与方法**
2.1. 环境塑料样本的收集和制备
在退潮期间，使用钳子在加龙河右岸（44°42'14.56''N，0°24'3.91''W）附近手动收集塑料碎片。选择最氧化的碎片，在实验室中用超纯水冲洗，然后在45°C下干燥48小时，以便制备纳米塑料悬浮液。
2.2. 从宏观塑料碎片中合成和表征ENV NPs
根据Blancho等人（2021年）的方法制备了从宏观塑料碎片中衍生的纳米塑料（ENV NPs）。简要来说，将最氧化的塑料碎片与去离子水以1:5（重量/重量）的比例混合在方形瓶中，并以250 rpm的速度搅拌48小时。然后将悬浮液超声处理1小时以促进颗粒从塑料表面分离。随后使用40 µm截留值的醋酸纤维素过滤器（VWR）分离微塑料。为了去除相关有机物，将悬浮液在37°C下用1% H₂O₂处理，并在254 nm的紫外线照射下处理5小时。使用1.2 µm截留值的玻璃纤维过滤器（Prat DUMAS）收集纯化的ENV NPs，并通过20 kDa分子量截留值的膜（PES，Microdyn NADIR；Amicon，Merck Millipore）超滤以去除残留的H₂O₂。使用热解耦合气相色谱-质谱（Py-GC-MS；Pyrolyzer PY-3030，Frontier Lab；5977B，Agilent Technologies）对其组成和表面化学进行表征。分析显示，这些纳米塑料主要是聚乙烯（PE，95%）（补充信息图1），并且具有高密度的羧基表面，导致Zeta电位为-36.2 mV。ENV NPs的平均尺寸为235 ± 70 nm，并显示出各向异性的形状和多分散的尺寸分布（补充信息图2）。为了比较，使用了市售的羧基化聚苯乙烯纳米珠（PS NPs，200 nm；Polysciences）作为参考材料。
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图1. 两步食物链暴露实验的示意图，其中Scrobicularia plana被喂食预先暴露于环境（ENV）和聚苯乙烯（PS）纳米塑料的Tetraselmis suecica，浓度分别为0.008、10和100 µg/L，持续21天。
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图2. Scrobicularia plana在暴露于标准聚苯乙烯纳米塑料（PS）和环境纳米塑料（ENV）21天后的清除率，浓度分别为0.008、10和100 µg/L。数据以平均值±标准差（n = 3）表示。
2.3. 纳米颗粒的优化消化和金属定量
为了实现完全消化，将100 mg纳米颗粒粉末在微波系统（MW7000，Anton-Paar）中用12 N HNO₃（次级）进行多步酸消化。该过程包括温度以6.6°C/min的速度上升至250°C，然后在140 bar压力下保持25分钟。来自三个不同试管的消化物合并，在90°C下蒸发，随后用0.37 N HNO₃重新溶解，以便进行金属定量。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS；Agilent 7700x）确定金属浓度。发现ENV NPs含有可检测浓度的多种金属（补充信息表A）。使用认证参考材料ERM-EC 680和ERM-EC 681（欧洲委员会联合研究中心，Ispra，意大利）确认了消化和分析程序的准确性和可靠性。暴露设置和采样程序
从法国吉伦特省阿卡雄湾的Pointe de l’Aiguillon地点（44°39'10.2"N，1°08'22.8"W）收集了Scrobicularia plana个体，并将其运输到实验室，容器中装有本地沉积物。到达实验室后，将这些蛤蜊放入装有27升自然海水（过滤精度为1微米）的30升水族箱中，保持温度在15°C，并在12小时光照和12小时黑暗的光周期下进行7天的适应期。每三天更换一次海水以确保水质最佳。
营养转移实验设计为两步暴露方案（图1）。第一步中，使用微藻Tetraselmis suecica作为受污染的食物来源，通过饮食摄入将纳米塑料传递给S. plana。藻类在含有聚苯乙烯（PS NPs）或环境纳米塑料（ENV NPs）的培养基中孵育48小时，浓度分别为0.008、10或100微克/升。本研究使用的暴露浓度是基于有限的但不断增长的海洋系统中纳米塑料的环境数据选定的。特别是Hietbrink等人（2025年）报告称，北大西洋水柱中的纳米塑料浓度范围为1.5至32.0毫克/立方米，这表明基于质量的纳米塑料量化变得越来越可行。这些值对应于1.5–32.0微克/升，表明在开放海域中已经可以检测到纳米塑料。然而，这类数据集仍然非常稀缺，尤其是在河口生态系统中。纳米塑料的行为高度依赖于其大小，因为不同大小的颗粒对离子强度和有机物含量的反应不同，导致不同生态区域的暴露条件差异很大（Lins等人，2022年）。此外，潮汐作用和淡水排放等水动力条件可以将超过90%的颗粒滞留在河口中（Li等人，2024年）。因此，目前缺乏代表河口环境中纳米塑料暴露的可靠参考浓度。
在这种情况下，实验浓度被选为涵盖一个相关的暴露梯度。包括了一个非常低的浓度（0.008微克/升），以模拟低污染环境的暴露条件。选择一个中间浓度（10微克/升），该浓度在已报告的海洋值范围内，并被认为具有环境相关性。较高的浓度（100微克/升）用于模拟高暴露情景，可能代表受污染严重的河口区域或局部污染热点。
孵育期间允许纳米颗粒吸附在藻类细胞表面，然后再提供给蛤蜊。第二步中，每48小时给S. plana个体喂食一次含有70,000个细胞/升的受污染或未受污染的微藻，总共持续21天，从而模拟通过食物链的饮食暴露途径。所有程序都在无塑料条件下进行，以防止污染。在结果部分，每种处理方式通过组合纳米颗粒类型及其暴露浓度来缩写。例如，“ENV NPs 10”表示暴露于10微克/升环境纳米塑料的蛤蜊。
暴露7天和21天后，采集了五只蛤蜊进行生化生物标志物分析。在21天的暴露期结束时，额外采集了一些个体以评估生理指标：三个用于清除率测量，十五个用于确定条件指数。解剖后，小心地取出鳃和消化腺，并立即储存在-80°C下，直到后续的生化分析。
由于目前生产的环境来源纳米塑料（ENV NPs）的数量有限且特征不明确，无法为每种处理方式建立多个独立的暴露水族箱。因此，每种实验条件都在一个水族箱中进行。在解释统计分析时应考虑这一限制。
2.5. 条件指数
测量了每种条件下10个个体的软组织总重量和湿重。条件指数根据以下公式计算（Kanduč等人，2018年）：
CI = （软组织湿重）/ （整个双壳类动物重量）× 100
2.6. 清除率
清除率（CR）定义为单位时间内清除的悬浮颗粒体积，是在之前暴露于清洁海水（阴性对照）或预先暴露于0.008、10或100微克/升PS或ENV NPs的微藻中的蛤蜊中确定的。测量前，将个体转移到600毫升玻璃烧杯中并让其适应1小时。每种条件下分别测量三个个体，每个个体单独放置在一个600毫升的玻璃烧杯中（每种条件重复三次）。然后向每个烧杯中加入初始浓度为300,000个细胞/毫升的Tetraselmis suecica。轻轻搅拌以确保混合均匀，同时将蛤蜊放在金属网格上以限制粪便物质的重新悬浮。通过监测实验开始后15分钟（T15）、30分钟（T30）和45分钟（T45）的藻类浓度下降来间接量化清除率，遵循标准的藻类细胞计数程序（Utermöhl，1958年）。每次采样时，用一滴卢戈尔溶液固定10毫升的藻类悬浮液，并使用Malassez计数室在光学显微镜下计数藻类细胞。
2.7. 生化生物标志物的评估
在鳃和消化腺组织中评估了过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和酸性磷酸酶（AcP）的酶活性。解冻后，组织在含有蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液（pH 7.4）中匀浆，所得上清液用于生化分析。总蛋白含量根据Bradford方法（Bradford，1976年）进行定量。CAT活性通过过氧化氢（H2O2）的还原来光谱测定（Claiborne，1985年），而GST活性基于Habig等人（1974年）描述的还原型谷胱甘肽与1-氯-2,4-二硝基苯的结合来测量。酸性磷酸酶活性根据制造商的说明（Sigma®试剂盒CS0740）使用对硝基苯磷酸盐水解法进行评估。酶活性根据总蛋白含量进行标准化，并表示为特定活性（微摩尔或纳摩尔每分钟每毫克蛋白）。
2.8. 统计分析
所有统计分析均使用XLSTAT软件（版本2024.4.2）进行。数据正态性和方差同质性分别用Shapiro–Wilk检验和Bartlett检验验证。由于生化生物标志物和清除率数据的参数假设不成立，因此应用非参数Kruskal–Wallis检验来评估处理效应。当检测到显著差异时，使用Dunn的事后检验进行成对比较。所有分析的显著性阈值采用p ≤ 0.05。此外，使用XLSTAT对暴露21天后获得的数据集进行了主成分分析（PCA），分别针对鳃和消化腺组织。
需要注意的是，实验设计中每种处理条件只有一个水族箱。因此，每个水族箱内采样的个体不能被视为完全独立的重复样本，统计分析应谨慎解释。这种单水族箱设计是本研究的局限性，未来的实验应包含每种处理的多个独立水族箱，以建立更稳健的统计框架。
2.9. 综合生物响应指数（IBR v2）以及水传播和营养传播暴露途径的比较
为了定量比较营养传播和直接水传播暴露途径引起的生物学效应，根据Sanchez等人（2013年）描述的方法计算了综合生物响应指数版本2（IBR v2），并对参考条件进行了修改。虽然原始方法将生物标志物值标准化为参考地点，但在这里每个生物标志物都标准化为实验的对照条件。该指数将多个生物标志物响应整合为一个分数，反映与参考条件的偏差，从而能够在共同尺度上进行跨研究和跨条件比较。对于每个生物标志物，测量值与对照值的比率进行了对数转换。然后将得到的值除以该生物标志物所有实验条件下的标准差。计算出这个标准化分数的绝对值，最后通过平均每种条件下的三个生物标志物的分数得到最终指数。较高的IBR v2分数表示与参考条件的总体偏差更大，反映了与对照相比测量到的生物标志物响应的更大差异。分别对鳃和消化腺组织在暴露7天和21天时的三个生化终点（过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和酸性磷酸酶（AcP）活性）计算得分。
将当前营养暴露实验的IBR v2分数与在同一实验室使用相同类型的纳米颗粒（PS NPs和ENV NPs）和浓度（0.008、10和100微克/升）进行的先前直接水传播暴露研究的结果进行了比较（Métais等人，2023年）。两项实验使用相同的温度（15°C）、纳米颗粒类型、浓度、暴露时间、组织和生化终点，主要区别在于暴露途径、盐度（25 PSU人工海水 vs. 自然海水）和生物体的采集地点。
为了便于解释，直接水传播暴露研究和当前营养暴露研究的主要实验条件总结在表1中。
表1. 直接水传播暴露研究（Métais等人，2023年）和当前营养暴露研究的实验条件总结
参数
直接水传播暴露（Métais等人，2023年）
营养暴露（当前研究）
暴露途径
直接水传播
通过受污染的微藻（Tetraselmis suecica）的营养传递
采集地点
Bourgneuf湾，法国大西洋海岸（47°01'48"N；1°59'02.8"W）
Pointe de l’Aiguillon，阿卡雄湾（44°39'10.2"N；−1°08'22.8"W）
纳米颗粒类型
PS NPs（200纳米，羧基化）；ENV NPs（约235纳米，PE基）
PS NPs（200纳米，羧基化）；ENV NPs（约235纳米，PE基）
测试浓度（微克/升）
0.008、10、100
0.008、10、100
温度（°C）
15
15
盐度（PSU）
25（人工海水，Tropic Marine）
自然海水，阿卡雄湾（约30）
暴露时间
7天和21天
7天和21天
分析组织
鳃和消化腺
鳃和消化腺
生化终点
CAT、GST、AcP
3. 结果
3.1. 条件指数（CI）
在所有处理条件下未观察到统计学上可检测到的差异。CI值范围为19.35 ± 3.80–23.45 ± 4.06，对照值为20.28 ± 3.56。PS NPs处理在0.008、10和100微克/升时的平均CI值分别为21.52 ± 4.25、20.56 ± 6.63和19.35 ± 3.80，而ENV NPs处理在相同浓度下的平均CI值分别为21.70 ± 3.64、20.33 ± 3.21和23.45 ± 4.06（表2）。
表2. 条件指数（平均值和标准差）
3.2. 清除率
无论考虑的时间间隔如何，ENV和PS NPs的污染对蛤蜊的清除率均无统计学上可检测到的影响（图2）。
3.3. 氧化应激和解毒
在鳃中，暴露于0.008 PS的生物体的CAT活性显著低于对照组（72.17 ± 0.28微摩尔每分钟每毫克蛋白），而在暴露于PS 10和ENV 10的生物体中则更高（图3A）。21天后，出现明显不同的模式：暴露于PS 100的生物体的CAT活性显著高于所有ENV暴露的生物体（93.93 ± 6.44），但与对照组（49.06 ± 0.70）无统计学差异。PS 0.008和PS 10的活性介于两者之间，与对照组无统计学差异（图3B）。
3.4. 氧化应激和解毒
在鳃中，暴露于0.008 PS的生物体的CAT活性在7天后显著低于对照组（70.98 ± 1.09微摩尔每分钟每毫克蛋白），而在暴露于ENV 0.008、PS 0.008和ENV 10的生物体中显著高于对照组（图3C）。21天后，PS 100暴露的生物体的CAT活性显著高于所有ENV暴露的生物体（93.93 ± 6.44），但与对照组无统计学差异（图3D）。
3.5. 生化标志物的评估
在鳃和消化腺组织中评估了过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和酸性磷酸酶（AcP）的酶活性。解冻后，组织在含有蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液（pH 7.4）中匀浆，所得上清液用于生化分析。总蛋白含量根据Bradford方法（Bradford，1976年）进行定量。CAT活性通过过氧化氢（H2O2）的还原来光谱测定（Claiborne，1985年），而GST活性基于Habig等人（1974年）描述的还原型谷胱甘肽与1-氯-2,4-二硝基苯的结合进行测量。酸性磷酸酶活性根据制造商的说明（Sigma®试剂盒CS0740）使用对硝基苯磷酸盐水解法进行评估。酶活性根据总蛋白含量进行标准化，并表示为特定活性（微摩尔或纳摩尔每分钟每毫克蛋白）。Scrobicularia plana的鳃（A, B）和内脏团（C, D）中GST的酶活性在暴露于标准聚苯乙烯纳米塑料（PS）和环境纳米塑料（ENV）7天（A, C）和21天（B, D）后，浓度分别为0.008、10和100 μg.L-1。数据以平均值±标准差（n=5）表示。3.4. 免疫系统：Clam暴露于PS和ENV纳米塑料对酸性磷酸酶（AcP）活性没有统计学上可检测到的影响，无论组织（鳃或消化腺）和暴露时间如何（图5）。在鳃中，暴露7天后的AcP活性范围为3.60±0.96–6.88 nmol min⁻¹ mg protein⁻¹，而对照组为4.38±0.92；暴露21天后的活性范围为1.67±0.15–5.09±0.70，对照组为2.83±0.54。在消化腺中，暴露7天后的AcP活性范围为1.46±0.27–3.56±0.70，对照组为1.34±0.14；暴露21天后的活性范围为3.17±0.98–8.39±0.75，对照组为2.98±0.92。尽管存在这种变异性，但在任何处理组与对照组之间未检测到统计学上的显著差异。下载：下载高分辨率图像（243KB）下载：下载全尺寸图像图5. Scrobicularia plana的鳃（A, B）和消化腺（C, D）在暴露于标准聚苯乙烯纳米塑料（PS NPs）和环境纳米塑料（ENV NPs）7天（A, C）和21天（B, D）后的AcP酶活性，浓度分别为0.008、10和100 μg.L-1。数据以平均值±标准差（n=5）表示。不同字母表示处理组之间的显著差异（Kruskal–Wallis检验后进行Dunn的事后检验，p<0.05）。3.5. 主成分分析3.5.1. 鳃：前两个主成分轴几乎捕获了所有变异的70%，其中PC1解释了约45%，PC2解释了约25%（图5）。PC1根据微塑料类型清晰地分离了处理组。暴露于PS微塑料的双壳类动物，尤其是在高浓度（PS 100）下，位于轴的右侧，而暴露于ENV微塑料的则位于左侧。对照组位于中间稍偏左的位置，表明其生理状态与低ENV暴露相似。沿第一个主成分（PC1）的变量投影显示，抗氧化酶和免疫相关酶GST、CAT和AcP在暴露于聚苯乙烯纳米塑料的蛤蜊中趋于增加，尤其是在中等和高浓度（PS 10和PS 100）下。相比之下，生理指标如状况指数（CI）和清除率（CR T15–T30）与PC1呈负相关，更接近对照组和环境来源的纳米塑料处理组，表明在这些条件下生理干扰相对较低。3.5.2. 消化腺：PCA分析解释了总方差的63.05%，其中第一个主成分（PC1）占39.35%，第二个成分（PC2）占24.70%（图6）。环境条件在负PC1空间形成了一个独立的簇，其中ENV 100在PC1轴上的分离最为明显。PS暴露显示了不同的位置，PS 10在正PC2区域明显分离。下载：下载高分辨率图像（77KB）下载：下载全尺寸图像图6. Scrobicularia plana在暴露于聚苯乙烯和环境纳米塑料21天后的鳃反应的主成分分析。生化反应显示出明显的模式，反映了不同的暴露条件。特别是CAT、AcP和GST酶的活性向量主要朝向暴露于环境纳米塑料的组，表明这些生物标志物对这种类型的颗粒具有特定的生理敏感性。各种清除率区间（CR T0–T15、T15–T30和T30–T45）在分析中紧密聚集，并位于对照组和暴露组之间。这种模式表明过滤活性在不同处理组之间的变化仅是适度的。相比之下，状况指数（CI）遵循了一条不同的轨迹，表明其变化在很大程度上独立于其他测量的生理和生化参数。下载：下载高分辨率图像（75KB）下载：下载全尺寸图像图7. Scrobicularia plana在暴露于聚苯乙烯和环境纳米塑料21天后的消化腺反应的主成分分析。3.6. 综合生物反应指数（IBR v2）：从暴露7天和21天后鳃和消化腺中测量的生化参数计算出的综合生物反应指数（IBR v2）值在表4中呈现。这些结果涉及当前的营养暴露研究和之前关于直接水传播暴露的研究（Métais等人，2023年）。对于直接水传播暴露，鳃中的IBR v2得分范围从0.35（PS 10，21天后）到1.68（ENV 100，7天后）。根据IBR v2得分，无论是PS还是ENV纳米塑料，都没有观察到明显的剂量依赖性趋势。7天后的最高值为ENV 100（1.68），而21天后的最高值为ENV 0.008（1.53）。在营养暴露途径中，7天后的得分适中（介于0.58和1.49之间），21天后仍保持相似范围（0.53–1.24），没有明显的剂量-反应模式。鳃中的最高营养得分出现在ENV 100（7天，1.49），而PS 0.008在21天时最低（0.53）。总体而言，两种暴露途径在鳃得分方面没有系统差异。相比之下，消化腺中的IBR v2得分通常更高且变化更大，根据条件和持续时间从0.62到2.47不等。对于直接暴露，两个时间点的ENV纳米塑料得分特别高，分别在2.47（ENV 10，21天）和2.16（ENV 100，21天），表明暴露时间越长，反应越强烈。对于PS，直接暴露的得分也在7天（0.62–0.98）和21天（0.85–1.73）之间增加，可能反映了生物效应的逐渐积累。通过营养暴露，ENVs在7天时就已经显示出最高的得分（2.24（ENV 0.008）和2.21（ENV 10），表明这种环境来源的纳米塑料在该组织中引起了显著的生物反应。4. 讨论：本研究的目的是评估纳米颗粒（NPs）通过营养传递对双壳类动物S. plana的影响。研究采用了两层营养传递实验，从海洋藻类到双壳类动物，使用了PS NPs和从环境中收集的氧化大塑料衍生的NPs。选择河口蛤S. plana是因为其广泛存在和易于获取，使其成为海洋生态毒性研究的理想指示物种（Fossi Tankoua等人，2020年；Scola等人，2021年）。该研究填补了理解NPs沿水生食物链毒性的空白，这对于评估这些颗粒在水生生态系统中的风险至关重要。纳米颗粒在水生环境中的行为受多种因素影响，如形状、大小、化学组成、表面电荷、涂层和颗粒状态。这些颗粒可以与配体相互作用、聚集、与溶解有机物（DOC）和天然颗粒反应、释放离子或保持纳米颗粒状态。这些化学组成的变化改变了它们对生物系统的物理化学性质和反应性，从而影响其毒性（Bergami等人，2017年；Corsi等人，2020年；Ferreira等人，2019年）。研究表明，纳米塑料可以吸附在藻类细胞壁上并穿透生物膜，导致生长、光合作用和氧化应激反应的不利影响，有时甚至导致死亡（Nolte等人，2022年）。初级生产者是首先接触到这些聚合物的生物，而在不同营养级的生物中观察到了生物累积。例如，在食用了被PS微球污染的贻贝后，在Carcinus maenas的各种组织中检测到了MPs（Farrell和Nelson，2013年）。其他研究展示了NPs的营养传递，其中给予藻类的纳米颗粒后来通过中间生物如Daphnia magna出现在鱼的大脑中（Mattsson等人，2017年）。在本研究中，评估了纳米塑料对Scrobicularia plana在营养暴露下的影响，涵盖了不同的生物组织水平和两种不同的暴露持续时间。此外，本研究的创新之处在于，所获得的结果允许将这种营养暴露与之前研究直接暴露（水传播暴露）对同一物种的类似NPs和浓度的影响进行比较（Métais等人，2023年）。暴露方法在确定MNPs对各种物种的影响方面起着关键作用。虽然一些研究探讨了水生食物链中MPs的营养传递，但在直接暴露和营养传递之间评估双壳类动物在分子和细胞水平上的比较毒性效应方面仍存在空白。进行这样的比较有助于识别关键相似性或差异。例如，Kim等人（2022年）表明，通过Dunaliella salina的营养暴露后，Artemia franciscana对氨基功能化聚苯乙烯纳米颗粒（PS-NH2 NPs）的吸收显著减少。4.1. 状况指数和清除率：在双壳类动物中，呼吸和过滤是重要的生理功能，分别提供氧气和食物。这些速率的下降可能导致由于营养不足和缺氧而引起的压力甚至死亡。可以使用状况指数（CI）来评估双壳类动物的生理和生长（Filgueira等人，2013年；Zeng和Yang，2020年）。本研究表明，21天暴露后，不同NPs对CI没有影响。这一结果与之前的研究一致，这些研究显示暴露于不同类型塑料颗粒的双壳类动物的CI没有改变，尽管在细胞水平观察到了毒性效应（Bour等人，2018年；Latchere等人，2023年；Métais等人，2023年；Ribeiro等人，2017年；Von Moos等人，2012年）。根据Bour等人（2018年）的说法，CI可能不是评估塑料颗粒毒性的敏感生物标志物，相比之下能量储备更为重要。暴露于PS MPs的牡蛎将能量分配从繁殖转向生长可以解释状况指数没有变化的原因（Sussarellu等人，2016年）。双壳类动物的清除率（CR）对压力非常敏感（Chandurvelan等人，2013年），使其成为压力条件和污染环境的最佳指标之一（Widdows等人，1981年）。MPs暴露被发现会导致壳闭合并降低虹吸率（Fu等人，2022年）。将CR结果与先前的研究进行比较具有挑战性，因为过滤的生理功能强烈依赖于生物（物种、鳃的类型、体重和大小）和非生物条件（温度、盐度、颗粒类型和大小、浊度或水流速度）（参见Gatenby等人，2013年的综述；Ward和Shumway，2004年）。在我们的研究中，没有观察到Clam S. plana的CR有统计学上可检测到的影响，C. gigas（Revel等人，2020年，2019年）和Perna viridis贻贝（Joyce和Falkenberg，2022年）也是如此，它们都暴露于环境相关的MPs浓度；同样，淡水蛤C. fluminea暴露于环境相关的NPs浓度时也是如此（Baudrimont等人，2020年）。与其他研究表明双壳类动物在暴露后过滤活性下降的研究不同（例如Oliveira等人，2018年），在我们的研究条件下，S. plana可能通过将NPs排出体外来控制污染，而不是通过调节清除率来避免其吸收，正如Revel等人（2020年）所建议的，C. fluminea也是如此（Baudrimont等人，2020年）。4.1.1. 免疫系统：在我们的研究中，无论组织（鳃或消化腺）和暴露时间如何，暴露于PS和ENV纳米塑料对AcP活性没有统计学上可检测到的影响，表明在测试条件下蛤蜊的免疫系统没有受到干扰。齐等人（2023年）观察到，在贻贝Mytilus coruscus短暂直接暴露于纳米颗粒（MNPs，浓度分别为20 mg.L−1、100 nm和1 µm，持续2天）后，基因表达出现下调，这表明炎症反应的各个阶段已经开始。Al-Thawadi（2020年）强调了纳米颗粒与吞噬细胞之间的相互作用，突显了它们在细胞内的独特影响。值得注意的是，几种与解毒、DNA修复、细胞应激反应和先天免疫相关的基因在直接暴露于纳米颗粒的Mytilus galloprovincialis贻贝中表现出显著的变化，这与之前的研究结果一致（Auguste等人，2020年；Brandts等人，2018年）。这种机制可能是直接暴露后发生的，但在我们的研究中，通过受污染的食物进行营养级暴露后并未观察到统计学上显著的炎症反应。齐等人（2023年）提出，直接暴露于纳米颗粒可能有助于这些颗粒更容易穿透黏膜屏障，从而引发严重的炎症反应和随后的组织损伤，这可能促进塑料颗粒的摄入。在我们的研究中，在测试条件下没有观察到对免疫系统的统计学上显著影响，表明这些特定污染物可能具有潜在的抵抗力或缺乏敏感性。类似的发现也在S. plana（Labbé等人，2024年）和其他海洋生物中观察到，它们在暴露于微塑料后表现出微弱或没有显著的免疫反应（Avio等人，2015年；de Sá等人，2018年）。此外，缺乏显著的生化变化也与之前的研究结果一致，这些研究报道海洋双壳类动物在短期暴露于纳米塑料后表现出微弱或可变的生理反应（Li等人，2023年）。与食物相关的纳米颗粒可能表现得像较大的颗粒或聚集体，可以被双壳类动物捕获，但也可能通过粪便或伪粪便排出（Ward等人，2019年），从而减少在消化腺中的停留时间。这些发现强调了进一步研究的必要性，以阐明这种观察到的稳定性的机制，并探索长期或高浓度纳米颗粒暴露对海洋双壳类动物的潜在影响。
4.1.2 氧化应激和解毒
Li等人（2020年）和Zhou等人（2023年）指出，双壳类动物直接暴露于纳米颗粒后会产生过多的活性氧（ROS），其毒性效应主要由此产生，且毒性程度取决于暴露浓度。Zhou等人（2023年）观察到Ruditapes philippinarum中过氧化氢酶（CAT）活性与整体抗氧化能力之间存在相似的模式：在0.02 mg.L−1和0.2 mg.L−1的暴露浓度下，对照组与暴露组之间没有显著差异；而在更高浓度（2 mg.L−1和20 mg.L−1）下，暴露组的过氧化氢酶活性下降。在本研究中，鳃和消化腺之间观察到的CAT活性方向相反，这表明存在组织特异性的调节反应，而不是普遍的氧化应激反应。暴露于PS 0.008、PS 10和ENV 10的生物体在7天后鳃中的CAT活性下降，可能反映了抗氧化防御的抑制或早期氧化耗竭；而消化腺中CAT活性的同时增加可能表明该组织中的抗氧化能力发生了适应性上调。然而，仅凭酶活性无法区分这两种解释——生化补偿或氧化损伤。作为主要的解毒器官，消化腺可能在摄入纳米颗粒后最初上调其抗氧化防御机制，而鳃直接与水柱和悬浮颗粒接触，在过滤过程中可能会根据到达每个组织的颗粒数量而产生不同的反应。如果消化腺不能长时间维持这种补偿反应，如Li等人（2020年）所建议的，外围组织（如鳃）可能会发生氧化耗竭。需要注意的是，当前的数据集仅包含三个酶指标（CAT、GST和AcP），因此不能严格判断是否存在氧化损伤。缺乏脂质过氧化（MDA）、蛋白质羰基、DNA损伤标志物或溶酶体稳定性等终点指标意味着观察到的反应只能支持抗氧化系统轻微调节的结论。在S. plana（Labbé等人，2024年）和其他海洋生物中也观察到了类似的结果，它们在暴露于微塑料后表现出微弱或没有显著的免疫反应（Avio等人，2015年；de Sá等人，2018年）。此外，缺乏显著的生化变化也与之前的研究结果一致，这些研究报道海洋双壳类动物在短期暴露于纳米塑料后表现出微弱或可变的生理反应（Li等人，2023年）。与食物相关的纳米颗粒可能表现得像较大的颗粒或聚集体，可以被双壳类动物捕获，但也可能通过粪便或伪粪便排出（Ward等人，2019年），从而减少在消化腺中的停留时间。
这些发现强调了进一步研究的必要性，以阐明这种稳定性的机制，并探索长期或高浓度纳米颗粒暴露对海洋双壳类动物的潜在影响。
4.1.2 氧化应激和解毒
Li等人（2020年）和Zhou等人（2023年）指出，双壳类动物直接暴露于纳米颗粒后会产生过多的活性氧（ROS），其毒性效应主要由此产生，且毒性程度取决于暴露浓度。Zhou等人（2023年）观察到Ruditapes philippinarum中过氧化氢酶（CAT）活性与整体抗氧化能力之间存在相似的模式：在0.02 mg.L−1和0.2 mg.L−1的暴露浓度下，对照组与暴露组之间没有显著差异；而在更高浓度（2 mg.L−1和20 mg.L−1）下，暴露组的过氧化氢酶活性下降。在本研究中，鳃和消化腺之间观察到的CAT活性方向相反，这表明存在组织特异性的调节反应，而不是普遍的氧化应激反应。暴露于PS 0.008、PS 10和ENV 10的生物体在7天后鳃中的CAT活性下降，可能反映了抗氧化防御的抑制或早期氧化耗竭；而消化腺中CAT活性的同时增加可能表明该组织中的抗氧化能力发生了适应性上调。然而，仅凭酶活性无法区分这两种解释——生化补偿或氧化损伤。消化腺作为主要的解毒器官，可能在摄入纳米颗粒后最初上调其抗氧化防御机制，而鳃直接与水柱和悬浮颗粒接触，在过滤过程中可能会根据到达每个组织的颗粒数量产生不同的反应。如果消化腺不能长时间维持这种补偿反应，如Li等人（2020年）所建议的，外围组织（如鳃）可能会发生氧化耗竭。需要注意的是，当前的数据集仅包含三个酶指标（CAT、GST和AcP），因此不能严格判断是否存在氧化损伤。缺乏脂质过氧化（MDA）、蛋白质羰基、DNA损伤标志物或溶酶体稳定性等终点指标意味着观察到的反应只能支持抗氧化系统轻微调节的结论。未来的研究应纳入更广泛的氧化损伤生物标志物，以便更全面地解释观察到的酶反应机制。
在我们的研究中，与对照组相比，暴露于PS 0.008、PS 10和ENV 10的S. plana鳃中的过氧化氢酶活性下降。另一方面，我们的结果显示暴露于PS 0.008、ENV 0.008和ENV 10的S. plana消化腺中的过氧化氢酶活性增加。消化腺可能是主要的解毒器官，如果它不能因纳米颗粒暴露而补偿压力，鳃中可能会发生氧化耗竭，如Li等人（2020年）所建议的。在他们的研究中，Li等人（2020年）观察到Corbicula fluminea在短期暴露于聚苯乙烯纳米颗粒（80 nm，浓度为0.1 mg.L−1、1 mg.L−1和5 mg.L−1，持续96小时）后，消化腺、鳃和外套膜中出现了氧化应激。在我们的研究中，测试了相同浓度的聚苯乙烯（100 µg.L−1），与对照组相比，未测量到纳米颗粒对鳃和消化腺中过氧化氢酶活性的统计学上显著影响。我们使用了更大的纳米颗粒（200 nm），这些颗粒已经羧基化。纳米颗粒的属性（如大小或表面性质（电荷或化学性质）会影响它们的吸收、转运和毒性。此外，在我们的研究中，来自微藻的生物分子（如细胞外聚合物物质（DNA、蛋白质、碳水化合物）可能与纳米颗粒相互作用形成生态冠（Liu等人，2022年）。Natarajan等人（2020年）指出，生态冠的形成降低了纳米颗粒对微藻Chlorella sp.的毒性，并显著降低了氧化应激。他们还观察到PS纳米颗粒的毒性随电荷的不同而变化（Natarajan等人，2020年）。因此，将生态冠的特性纳入未来的研究可以提供有关纳米颗粒对微藻直接暴露和通过食物链传递给双壳类动物的潜在影响的宝贵见解。同样，通过电子显微镜对测试的纳米颗粒进行形态学表征可以提供额外的物理化学信息，应在未来的研究中考虑。
4.1.3 双壳类动物对微塑料暴露的鳃和消化腺反应的多变量比较
在消化腺中，主成分分析（PCA）显示实验条件沿PC1轴分离，PS处理沿着一个梯度分布，突出了剂量依赖性效应。值得注意的是，PS 100位于两个极端，抗氧化（CAT、GST）、免疫（AcP）和清除率（CR）标志物是关键区分因素。清除率与对照组呈正相关，与PS纳米颗粒（0.008和10）和所有ENV纳米颗粒暴露呈负相关，表明消化效率显著受损。环境处理在PC1的负侧聚集得更紧密，表明与PS暴露相比，生物学反应可能不那么明显。在鳃中，PS 100和PS 10与ENV和对照组明显分离，对组别区分贡献最大的生理标志物包括GST、CAT和AcP，表明该组织中的生化应激反应更为明显。相反，清除率（CR T15–T30）和条件指数（CI）在PC1上呈负加载，与环境处理和对照组相关，表明在环境现实暴露下生理性能得以保持。比较这两种组织时，鳃主要通过氧化应激和免疫相关酶途径作出反应，而消化腺则表现出清除能力的功能损伤。这表明鳃作为化学应激的初始传感器，而消化腺反映了生理效应。这些组织特异性的反应与Arini等人（2023年）的工作一致，他们通过酶生物标志物测量和基因表达分析研究了淡水双壳类动物Corbicula fluminea中纳米颗粒（NPs）的毒性。他们的主成分分析（PCA）也清楚地区分了聚苯乙烯纳米颗粒和环境纳米颗粒，其中乙酰胆碱酯酶（AchE）抑制和氧化应激标志物（如过氧化氢酶）发挥了关键作用。值得注意的是，Arini等人（2023年）报告说，在暴露于环境纳米颗粒后，消化腺中的基因调节更为明显且效应持续，而鳃的反应则更为短暂且依赖于浓度。这两项研究一致指出，PS颗粒的毒性更大，引发了鳃中的生化生物标志物反应。同时，他们的研究还强调了暴露途径的重要性，营养级暴露引发了更广泛的分子反应。这一观察结果有助于解释消化腺PCA中检测到的不同负荷。总体而言，这些发现表明，特定器官对微塑料污染的反应不仅受聚合物类型和浓度的影响，还受颗粒来源、暴露途径以及涉及组织的功能特性的影响。
4.1.4 直接暴露与营养级暴露的比较
为了比较直接暴露和营养级暴露途径引起的生物学效应，将本研究的营养级暴露结果与在同一实验室使用相同类型、浓度、暴露时间和生物标志物（Métais等人，2023年；表3）对S. plana进行的直接暴露研究进行了比较。为了获得定量和分析上稳健的综合结果，还计算了综合生物反应指数（IBR v2；Sanchez、Burgeot和Porcher，2013年），该指数基于两项研究中共同的生物标志物（鳃和消化腺中的CAT、GST和AcP）。该指数允许在共同尺度上表达与对照条件的总体偏差程度（表4）。如表3所示，直接暴露引起的统计学上显著的生化效应数量多于营养级暴露，这一趋势与之前在牡蛎中的观察结果一致（Arini等人，2022年）。然而，IBR v2分数对此解释进行了补充，表明暴露途径之间的关系取决于组织和时间。在鳃中，两种暴露途径的IBR v2分数大致相当，无论纳米颗粒的类型、浓度或暴露时间如何，都没有一种途径具有系统优势，ENV纳米颗粒和PS纳米颗粒之间也没有明显差异。这表明纳米颗粒的传递方式并不显著影响该组织中的生化反应程度。这可能是因为鳃同时暴露于水中的悬浮颗粒和通过过滤摄入的食物中的颗粒。在消化腺中，出现了更为复杂的模式。IBR v2分数显示，营养级暴露在7天后产生的反应比对照条件更强，特别是对于ENV纳米颗粒（ENV 0.008为2.24，ENV 10为2.21），与同一时间直接暴露的结果相当或更高（ENV 10为2.00，ENV 0.008为1.51）。这种早期和明显的营养级暴露反应可能反映了摄入受污染微藻后环境来源颗粒在消化上皮中的快速积累。然而，与直接暴露不同，这些升高的分数并未随时间持续或加剧。这可能表明生物反应达到了饱和状态，或者补偿机制逐渐激活，限制了随后的氧化和免疫扰动。在直接暴露下，消化腺中的IBR v2分数在7至21天内随着浓度的增加而增加，尤其是对于ENV 10（从2.00增加到2.47），ENV 100（从1.86增加到2.16），PS 10（从0.98增加到1.58），PS 100（从0.70增加到1.73）。这反映了在长时间直接接触下生物效应的逐渐积累，而在营养级暴露中并未观察到这种现象。相比之下，在最低浓度下，情况发生了逆转：21天后，通过食物链暴露产生的评分高于直接暴露，无论是对于PS 0.008（1.51 vs. 0.85）还是ENV 0.008（0.86 vs. 1.14）。这表明在相关的环境浓度下，食物链途径并不会系统性地降低生物反应，尽管这种解释需要谨慎对待，因为IBR v2仅基于三个生物标志物进行计算，可能无法完全反映整体的生物反应。这些与暴露途径相关的差异可以归因于每种情况下纳米颗粒（NP）生物利用度的不同机制。直接暴露使双壳类动物与悬浮在水柱中的纳米颗粒直接接触，从而促进快速摄入和组织积累，可能导致持续的氧化应激和免疫激活。相比之下，食物链暴露通过受污染的微藻间接传递纳米颗粒，引入了与纳米颗粒和食物来源生物基质相互作用相关的额外复杂性。可以假设，吸附在藻类表面的纳米颗粒周围形成的生态层可能会降低其生物利用度并随时间减弱其毒性（Natarajan等人，2020年），尽管这仍需通过专门的实验来证实。此外，可以推测作为纳米颗粒载体的藻类可能会形成聚集体并沉降到水族箱底部，从而降低生物可利用颗粒的浓度（Shi等人，2024年）。然而，这一假设在当前研究中并未直接测试，需要通过特定的实验来验证。最后，与食物相关的纳米颗粒可能更容易通过伪粪便排出，从而限制其在消化腺中的停留时间（Revel等人，2020年）。
表3. 在0.008、10和100 μg L−1的浓度下，直接暴露和食物链暴露7天及21天后，Scrobicularia plana对标准聚苯乙烯纳米塑料（PS NPs）和环境纳米塑料（ENV NPs）的反应比较。条件指数（CI）和生化生物标志物（过氧化氢酶 - CAT、谷胱甘肽-S-转移酶 - GST和酸性磷酸酶 - AcP）的变化用统计上显著的增加（绿色箭头）或减少（红色箭头）表示，与对照组相比。(-)表示与对照组无显著差异。
表4. 在食物链暴露（本研究）和直接水传播暴露（Métais等人，2023年）后7天和21天，Scrobicularia plana的鳃和消化腺（GD）的IBR v2评分。橙色突出显示的分数表示最高值（≥ 2.0）；绿色分数表示最低值（≤ 0.6）。
无论暴露途径如何，消化腺中ENV纳米颗粒（NPs）的IBR v2评分始终高于PS纳米颗粒，这可能反映了它们不同的物理化学性质。更复杂的表面化学、更高的金属含量和更大的聚集潜力可能导致ENV NPs与消化上皮的更强相互作用，这与传递途径无关。这些结果共同表明，食物链途径不仅仅降低了纳米颗粒的生物利用度，还从根本上改变了生物反应的时间动态和组织分布，其后果取决于纳米颗粒的类型、浓度和组织。这强调了在河口生态系统中对纳米塑料进行生态毒性风险评估时需要纳入与环境相关的食物链暴露情景。由于缺乏对蛤蜊组织中纳米塑料的定量分析，无法建立完整的外部剂量-内部剂量效应关系，这是当前研究的一个局限性。未来的工作应使用敏感的分析方法进行组织浓度测量，以加强观察到的生物反应的机制解释。除了组织定量外，进一步发展IBR方法也将加强未来的评估。扩大生物标志物的范围，包括神经毒性、内分泌干扰或DNA损伤等额外生物功能，将提供更全面的生物反应图景。此外，正如Catteau等人（2023年）所建议的，将阈值纳入IBR计算有助于过滤掉可能与生物学无关但会增加最终评分的微小偏差。这样的改进将提高该指数的敏感性和特异性，最终增强其作为河口生物中纳米塑料生态毒性评估工具的相关性。
5. 结论
本研究提供了关于纳米塑料通过食物链暴露对河口双壳类动物Scrobicularia plana的生物学影响的新见解。虽然条件指数和清除率等传统参数没有显示出统计学上的显著效应，但酶学生物标志物检测到了微妙但可量化的氧化效应。环境来源（ENV）和聚苯乙烯（PS）纳米颗粒之间的反应存在差异，其各自的毒理学特征很可能是由颗粒组成、表面化学和生物利用度的差异所解释的。ENV纳米颗粒引发的酶学反应比PS纳米颗粒更弱。这一区别进一步得到了PCA结果的支持，其中暴露于PS和ENV的处理组明显分开，PS暴露与应激相关标志物的关联更强。值得注意的是，通过受污染食物间接暴露后观察到的生物反应相对有限，比之前报道的直接水传播暴露下的反应更为有限。这表明暴露途径可能会影响毒性结果，但由于缺乏内部剂量的量化，无法对两种暴露途径的相对强度做出明确结论。总体而言，这些结果强调了使用与环境相关的颗粒进行生态毒性评估的重要性，并呼吁进一步研究纳米塑料对水生食物网的长期影响。然而，也应承认本研究的几个局限性。首先，暴露是在受控实验室条件下进行的，可能无法完全复制自然河口环境的复杂性，包括沉积物组成、温度、盐度以及共污染物的存在。其次，食物链暴露的持续时间较短，可能无法捕捉到更具有生态相关性的慢性或多代效应。第三，尽管ENV纳米颗粒更真实地代表了环境污染，但其物理化学异质性引入了复杂性，使得与特征明确的PS纳米颗粒直接比较变得复杂。最后，本研究中使用的生物标志物组合仅提供了生物体整体生理反应的部分图景；未来的研究应整合额外的终点，如组织病理学、基因表达或繁殖参数，以获得更全面的纳米塑料通过食物链传递的毒性评估。还应注意的是，由于采用单水族箱设计，结果仅为环境相关纳米颗粒的食物链转移和生物学效应提供了初步证据。在解释统计结果时，应考虑这一实验限制，未来使用完全复制的设计进行的研究将有助于确认和扩展这些发现。
作者贡献声明：
Oïhana Latchere：撰写 - 原始草稿、资源、调查、正式分析、数据管理。
Agnès Feurtet-Mazel：资源、方法学。
Magalie Lemoing：资源、方法学、正式分析。
Hanane Perrein-Ettajani：资源、调查。
Isabelle Métais：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原始草稿、资源、方法学、调查、概念化。
Magalie Baudrimont：撰写 - 审稿与编辑、资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、概念化。
Amélie Châtel：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原始草稿、资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、概念化。
Mohammed Mouloud：资源、方法学。
Julien Gigault：资源、项目管理、方法学、调查、资金获取、正式分析、概念化。
