刘博涵|南俊|何荣成|魏海阳|赵天毅|张一博|江瑞雪|吴芳敏|葛振成|叶学松|王伟|马军
中国哈尔滨工业大学环境学院城乡水资源与环境国家重点实验室，哈尔滨150090
**摘要**
由过量磷排放引起的富营养化威胁着全球水生生态系统。强化生物除磷（EBPR）是一种可持续且广泛应用的废水处理技术，但通常需要优化以满足日益严格的全球磷排放标准。传统的化学添加剂可以实现深度除磷，但它们需要过量投加，产生大量污泥，并可能抑制驱动生物处理过程的关键聚磷酸盐积累菌（PAOs）。本研究显示，低剂量、缓释的镧气凝胶（LZGA）能够激活PAOs的代谢，从而实现几乎零化学足迹的深度生物除磷。通过将La3+释放到序批反应器中，LZGA平台在最佳剂量15 mg L-1下将出水总磷从0.85 mg L-1降低到0.14 mg L-1。与传统沉淀法相比，这代表了化学消耗量减少了两个数量级，后者处理一吨废水需要0.7克镧。蛋白质组学和微生物分析表明，微量La3+可以刺激钾通道，上调关键能量代谢途径，并使核心PAO Candidatus Accumulibacter的蛋白质表达量增加一个数量级。此外，该系统还增强了胞外聚合物物质（EPS）的生成，并提高了EPS的磷吸收能力。这些发现表明，针对微生物代谢途径的微量金属激活为升级现有生物反应器提供了一种策略。这一策略为全球废水管理和先进富营养化控制提供了多方面的范例。
**1. 引言**
水体的富营养化是一个全球性的环境问题，威胁着人类社会的可持续发展[1]。富营养化会导致有害藻类大量繁殖、生物体死亡、局部生态平衡破坏以及水源水质下降[2][3][4]。地表水体的富营养化主要归因于来自生活污水和工业污水的过量磷（P）输入[5][6]。因此，许多国家对污水处理厂（WWTPs）的出水磷浓度实施了严格限制。例如，中国A级生活污水出水的磷标准低于0.5 mg L-1，某些特殊区域甚至需要达到更严格的0.3 mg L-1的标准。在美国，包括太浩湖、五大湖、奥科昆水库、切萨皮克湾和墨西哥湾北部在内的特定地区，要求更严格的磷排放标准，为0.1–0.2 mg L-1。
现有的磷去除技术难以满足这些日益严格的磷排放要求[7][8]。强化生物除磷（EBPR）由于其可持续性和低消耗量，在全球超过70%的WWTPs中被广泛使用[9][10]。然而，EBPR经常面临操作条件波动、磷去除效果有限以及生物活性较低等问题，导致出水总磷（TP）浓度约为1.0 mg L-1，无法达到相关标准[11][12]。为了解决这个问题，化学除磷方法在高级处理中得到了广泛应用，以进一步降低磷浓度[13][14][15]。然而，这种方法需要大量化学药剂，因为需要过量投加才能与低浓度的目标污染物反应[16]。此外，添加如聚合氯化铝（PAC）絮凝剂等化学药剂会对聚磷酸盐积累菌（PAOs）产生严重负面影响，使其在总细菌种群中的比例降低超过50%，并破坏Zoogloea结构。这反过来又降低了活性污泥与磷酸盐（PO43−）结合的能力约40%[17][18][19][20]。此外，使用化学药剂会产生大量过剩污泥，严重影响其后续处理[21]。因此，迫切需要开发一种有效的、低消耗的磷去除策略，主要依靠EBPR将磷浓度降低到非常低的水平（例如低于0.2 mg L-1），同时避免化学去除方法带来的不良副作用。
EBPR通过在好氧阶段通过PAOs吸收PO43−来发挥作用[22][23][24][25]。钾离子（K+）通常与P同时在PAOs中代谢，作为反离子维持细胞中性，与带负电的聚磷酸盐一起[26][27]。因此，激活PAOs中的K+通道可能是提高这些生物体内磷固定效率的关键目标。其他生物相关领域的发现可以提供有价值的想法和灵感。例如，在克隆的哺乳动物细胞中，低浓度的La3+可以通过静电相互作用与K+通道的负电荷区域相互作用，从而适度改变K+通道的蛋白质结构，调节其门控动力学[28][29]。在人体内，微量La可以增强红细胞膜中的K+-ATPase活性[30]。此外，La还可以调节肝细胞和其他细胞中特定基因的表达水平[31][32][33]。在低La3+浓度下，它可以通过改变门控平衡间接促进跨膜K+运输[34]。鉴于细菌和真核生物中K+通道在结构和功能上的高度相似性[35]，我们假设La3+也可能作用于PAOs的K+通道。通过改变门控平衡，La3+可能间接促进跨膜K+运输，从而促进K+和PO43−的协同代谢，增强细胞内磷的积累。
目前，大多数磷去除材料都是粉末形式。如果将含La的粉末材料直接加入EBPR系统，虽然La3+可能会释放出来，但这些材料难以回收，导致其在污泥中不断积累，从而容易引起污泥恶化、微生物活性降低以及出水质量下降。此外，纳米级粉末容易聚集，显著降低其化学除磷能力和生物利用度。同时，La3+从粉末材料中的释放是不可控的，导致局部La3+浓度过高，从而抑制微生物活性。因此，本研究提出将氢氧化镧（La(OH)3）负载到具有多层孔结构的毫米级气凝胶珠中，并通过控制释放量，实现连续且低剂量的La3+供应，同时确保材料的可回收性和稳定性。
在本研究中，我们开发了一种基于La激活的策略来增强废水处理中的生物除磷效果。专门设计了含La的气凝胶珠（LZGA）作为La的来源，以提高序批反应器（SBR）的性能。LZGA具有高度选择性的磷去除能力和强大的抗干扰能力，适用于污水处理。作为La库，LZGA还可以缓慢释放La3+，增强生物除磷能力。基于上述描述，本研究提出了一种新的La增强磷去除策略，旨在通过精确靶向和调节少量La3+来实现高效、低消耗的深度磷去除。通过对SBR中磷去除效率的详细研究，评估了LZGA在EBPR系统中的长期稳定性。利用16S rRNA和蛋白质组学分析，我们确定了La-EBPR系统中微生物群落结构和关键蛋白质途径的变化，为LZGA的生化协同除磷机制提供了分子层面的解释。这一发展为废水处理中的磷去除提供了一种新颖且高效的策略。
**2. 材料与方法**
**2.1. 将La组分加载到微胶囊中**
我们通过原位交联反应方法合成了LZGA珠。首先，将氧化石墨烯（GO）加入100 mL蒸馏水中，并超声处理15分钟，确保GO在去离子水中完全分散，形成浓度为3 g L-1的GO分散液。然后，分别向50 mL蒸馏水中加入2 g海藻酸钠（SA）和6 g氢氧化镧（La(OH)3）。这三种溶液在室温下机械搅拌24小时，得到均匀混合物。将所得混合液用10 mL注射器注入含有1%乙醇和3%氧化锆（ZrOCl2·8H2O）（w/v）的1000 mL交联溶液中。在交联溶液中形成的球形水凝胶珠浸泡24小时，确保完全交联反应。随后，用水清洗水凝胶珠3–5次，去除未反应的金属离子。最后，将水凝胶珠冷冻干燥24小时，制备LZGA材料。本研究中使用的所有化学品均为高纯度，符合分析试剂标准（更多细节见补充信息）。
**2.2. 反应器设置和操作条件**
在本研究中，我们构建了配备机械搅拌器的有机玻璃SBRs，如图S1所示。SBRs每天运行四个6小时周期。每个周期开始时加入1 L未经处理的原污水，周期结束时排放1 L处理后的出水。每个周期包括5分钟进水阶段、85分钟缺氧反应阶段、210分钟好氧反应阶段、45分钟沉淀阶段和15分钟出水阶段。在缺氧和好氧阶段，机械搅拌器的转速为150 rpm。好氧阶段通过电磁空气压缩机驱动的曝气装置向SBRs供气，保持溶解氧浓度约为4.0 mg L-1。反应器接种了来自中国哈尔滨太平污水处理厂的活性污泥，初始混合液悬浮固体浓度约为3500 mg L-1。污泥停留时间为18天。反应器的进水为市政常规生活污水，进水化学需氧量（COD）、总氮（TN）和总磷（TP）浓度分别约为400、20和5 mg L-1。LZGA珠装载在特氟龙网（1 mm × 2 mm）上，便于将其与泥水混合物分离。这些装载好的珠子在反应的好氧阶段被引入SBRs中。LZGA珠可以轻松从特氟龙笼中取出并重新激活以供重复使用。整个操作在温度控制在25 °C的房间内进行。
**2.3. 分析方法**
使用3D测量激光显微镜（OLS5000，Olympus Corporation，东京，日本）、数字显微镜（DSX1000，Olympus Corporation，东京，日本）和HeliosNanolab600i（FEI Company，Hillsboro，俄勒冈州，美国）场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）检查LZGA和活性污泥的表面形态。使用溴化钾作为参考，通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析LZGA在磷捕获前后的官能团。使用X射线衍射（XRD）评估LZGA的结构特性。此外，通过X射线光电子能谱（XPS）研究磷捕获前后元素的结合能。使用STA449C仪器（NETZSCH，Bayern，德国）在氮气氛下从室温到800 °C以10 °C min-1的加热速率获得热分析数据（TGA）。使用电感耦合等离子体-光学发射光谱（ICP-OES）检测水中的溶解La离子。
在本研究中，我们根据标准程序分析了常规废水污染物如COD、NH4+-N、TN和TP，以及活性污泥的特性[36]。通过热处理从污泥混合物中提取胞外聚合物物质（EPS），并分析其蛋白质和多糖（PS）浓度[37]。蛋白质浓度使用改良的Lowry方法测定[38]，而PS含量则通过硫酸-蒽酮比色法测定[39]。
**2.4. 微生物群落分析**
我们使用高通量测序技术研究了含有LZGA的活性污泥系统中的微生物群落组成。在运行80天后收集了六个样本，LZGA气凝胶珠的浓度分别为0、5、10、15、20和30 mg L-1。根据制造商说明，使用E.Z.N.A.®土壤DNA试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美国）从活性污泥中提取基因组DNA。使用1%琼脂糖凝胶和NanoDrop 2000 UV-vis分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，美国）评估提取的DNA的质量和数量。使用Applied Biosystems GeneAmp® 9700 PCR热循环仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，美国）和341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）及805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）引物对扩增16S rRNA基因（V3-V4区域）。序列分析按照Gao等人[40]的方法进行。2.5. 蛋白组学在第80天收集了含有LZGA气凝胶珠浓度为0（对照）和15 mg L−1的污泥样本。蛋白质鉴定进行了三次重复实验。蛋白质浓度使用BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，上海，中国）进行测定。蛋白质消化按照标准程序[41]进行。随后进行了酶解和LC-MS/MS蛋白质分析。原始MS/MS光谱文件被导入ProteomeDiscoverer™软件（版本2.4）进行分析。肽鉴定的假发现率≤0.01，并且鉴定出的蛋白质至少包含一个特定肽。从数据库获得的蛋白质丰度数据经过统计分析以识别差异表达蛋白（DEPs）。P值使用学生t检验计算（P < 0.05），并且倍数变化超过1.2倍的蛋白质被识别为DEPs。所有鉴定出的蛋白质的注释使用了基因本体（http://geneontology.org/）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路（http://www.genome.jp/kegg/）。DEPs进一步进行了基因本体和KEGG富集分析。3. 结果与讨论3.1. 将La组分加载到气凝胶珠中并表征为了应对从废水中回收粉末材料所带来的挑战，这些问题可能包括La的过度积累、长时间运行过程中微生物群落结构的变化以及水处理剂的浪费，我们设计了一种策略，将La结合到具有宏观-微观-多级结构的气凝胶珠中。简而言之，我们将商业化的La(OH)3粉末（补充图S2）与SA和GO在水溶液中混合。然后，将混合物注入含有乙醇和ZrOCl2的交联溶液中以形成球形水凝胶珠。经过冷冻干燥后，我们得到了嵌入La的LZGA，其中La(OH)3作为功能组分，Zr(IV)和SA通过阳离子和羧基之间的交联反应作为骨架，GO提供了机械增强（图1a）。如激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）图像（图1b）和补充图S3中的光学照片所示，制备的LZGA表现出平均直径约为3毫米的均匀球形颗粒。检查横截面（图1c）时，发现珠子具有大约200微米的蜂窝状网状结构（图1d），这可能是由于与GO层相关的范德华力和π-π堆叠效应[42]。这种高度多孔的结构促进了废水的质量传递和La组分向废水中的传递。LZGA的表面形态使用LSCM和FE-SEM在多个尺度上进行了表征。LSCM图像（图1b）显示微球表面具有明显的非均匀纹理和波动。为了进一步分析微观结构，FE-SEM图像（图1e）显示表面有皱纹，这与LSCM观察到的宏观特征一致。此外，大多数没有GO的传统水凝胶珠在冷冻干燥后会破裂。相比之下，加入GO后，LZGA的机械性能显著提高，冷冻干燥后LZGA保持完整且不会破裂。LZGA珠的XRD图案（图1f）证实了其晶体结构。XRD谱中的衍射峰归因于La(OH)3晶体相（JCPDS编号36-1481）[(100), (110), (101), (200), (111), (201), (210), (002), (300), (211), (102), (112), (220), (202), (310), (311), (212), (400), (302)]，表明La(OH)3成功加载到了SA-GO框架上并保持了六方晶体结构。LZGA的化学组成还通过TGA（补充图S4）和ICP-OES进行了表征。LZGA中La的负载比例约为4.62%。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图1. 含La的气凝胶（LZGA）的表征。a，LZGA结构的示意图。b，LZGA表面的三维激光扫描共聚焦显微镜地形图。c，LZGA横截面的光学显微照片。d，LZGA的X射线衍射图案。e–f，LZGA表面（e）和横截面（f）的扫描电子显微镜图像。3.2. 提高污水中磷的去除效率制备的LZGA被用作增强SBRs中污水处理的La来源。我们使用了六个SBRs，每个SBR都含有活性污泥，为微生物的生长提供了必要的环境。每个SBR每天处理4升污水。在最初的20天内，没有添加LZGA（第一阶段）。在此期间，使用16S rRNA分析来评估活性污泥中微生物群落的稳定性。所有六个SBR都达到了稳态，平均出水COD和TN浓度符合中国一级生活污水的标准。然而，六个传统SBR的出水TP浓度仍约为1.0 mg L−1（补充图S5）。从第21天（第二阶段）开始，在接下来的60天内向SBRs中添加了不同浓度的LZGA珠（0, 5, 10, 15, 20, 和30 mg L−1），以建立La-EBPR系统。与对照组（不含LZGA的传统SBR）相比，实验组的出水TP浓度显著降低（图2a）。当向活性污泥SBR系统引入15 mg L−1的LZGA时，平均TP浓度降至非常低的0.19 mg L−1。此外，从第60天开始，该系统的TP浓度降至异常低的0.14 mg L−1，表明具有长期稳定性和高效率。La-EBPR系统将出水TP减少了大约6倍，而传统EBPR为0.85 mg L−1。还研究了LZGA剂量对磷去除性能的影响（图2b）。去除效率随剂量增加而提高，但当剂量超过15 mg L−1时，出水TP浓度仅略有下降。因此，我们得出结论，该系统中LZGA的最佳剂量为15 mg L−1。下载：下载高分辨率图像（587KB）下载：下载全尺寸图像图2. 含镧的生物磷去除（La-EBPR）系统的出水性能。a，传统EBPR和添加了15 mg L−1含La气凝胶（LZGA）的La-EBPR系统中出水总磷（TP）的时间依赖性变化。误差条表示n次独立测量的标准偏差（n = 3）。b，不同LZGA浓度下的平均出水TP。误差条表示n次独立测量的标准偏差（n = 3），红色数据线表示平均值。c，不同方法下的出水TP。误差条表示n次独立测量的标准偏差（n = 3），圆形数据点表示平均值。散点表示独立测量样本。d，La-EBPR系统与其他方法中化学添加水平的比较。e–f，不同LZGA浓度下出水化学需氧量（COD，e）和总氮（TN，f）的时间依赖性变化。为了确定LZGA在激活EBPR中的作用，我们设计了额外的对照实验。TP浓度设定为0.85 mg L−1，这与引入LZGA之前的传统EBPR的出水TP浓度相匹配。当向不含活性污泥的PO43−溶液中引入15 mg L−1的LZGA珠时，剩余的P浓度为0.67 mg L−1（图2c），导致去除效率仅为21.1%。相比之下，在含有活性污泥的SBR中加入15 mg L−1的LZGA后，出水TP浓度降至0.14 mg L−1。这表明尽管LZGA具有化学捕获P的活性位点（补充图S6），但仅此低剂量的LZGA本身无法有效将P降低到显著低的水平。LZGA自身的P捕获量仅占约25%（化学捕获），而大部分P去除效率（75%）归因于LZGA促进的EBPR增强作用。此外，为了验证LZGA中除La以外的物质是否影响PO43−的去除，我们还研究了未加载La(OH)3气凝胶珠对活性污泥系统的影响。我们的发现证实这些未加载的珠子对P去除没有显著贡献（补充图S7）。因此，基于这些比较实验，我们得出结论，La是LZGA的功能组分，并显著增强了活性污泥系统中的P去除。为了强调La-EBPR系统的优势，我们将其P去除性能与几种传统的化学去除技术进行了比较（图2d）。最常用的技术是使用PAC或铁盐作为混凝剂进行混凝。然而，即使与聚丙烯酰胺[43], [44]结合使用，通常也需要超过300 mg L−1的PAC浓度才能将出水P浓度降低到0.20 mg L−1以下。铁盐在废水处理中无法将出水P浓度降低到接近0.10 mg L−1[45]。除了混凝技术外，吸附是另一种有前景的化学去除P的方法。然而，它需要大量的吸附剂（图2d），通常需要数十甚至数百克的含La组分才能将P降低到0.1–0.2 mg L−1[46], [47], [48]。在La-EBPR系统中，由于LZGA中功能组分的La含量为46.2 mg g−1，只需0.7克La就可以净化1吨废水，将TP浓度从0.85降低到0.14 mg L−1。换句话说，La-EBPR系统在化学消耗方面几乎比传统的化学沉淀和吸附方法降低了两个数量级。除了研究P去除外，我们还研究了La-EBPR系统中的其他典型水处理参数。在这项研究中，我们观察到LZGA对其他营养物质的去除没有显著影响（图2e–f）。因此，LZGA的引入特别增强了La-EBPR系统中PO43−的去除，而对其他营养物质没有明显影响。3.3. 激活P的释放我们的发现表明，活性La组分从LZGA珠中缓慢且持续地向外迁移。在pH范围为6–8的溶液中，La3+的释放能力几乎保持恒定，约为18 mg g−1（补充图S8）。然而，当pH增加到9时，La3+的释放能力显著下降，在24小时内仅达到13 mg g−1。这可以归因于大部分嵌入LZGA的La(OH)3被ZrOCl2交联溶液的微酸性环境激活，激活的La与藻酸盐配体的-OH形成了动态配位键。在酸性或中性条件下，活性La组分更倾向于以离子状态缓慢且持续地向外迁移。在pH 6时，LZGA的La3+释放率在第一个小时内最高（12.08 mg g−1），之后逐渐下降。24小时后，没有观察到进一步的La3+释放，总释放量为18.4 mg g−1。此外，分析了释放前后LZGA中的La组分含量，发现释放后LZGA中剩余了27.3 mg g−1的La。在La组分激活后，大部分剩余的La继续释放（补充表S1）。此外，除了La3+外，LZGA中没有释放其他金属离子。基于La组分的缓释效应，我们假设LZGA中活性La组分的持续释放可能增强了某些微生物对PO43−的去除，从而降低了P浓度。为了验证这一假设，研究了La-EBPR系统中活性污泥的变化。在反应器中接种80天后，活性污泥系统主要由球菌和杆菌组成，少量为丝状细菌（补充图S9）。与对照反应器相比，处理后的污泥表现出饱满、致密和块状结构，表明引入15 mg L−1的LZGA改善了污泥的形态（图3a）。此外，在污泥粒径分布图中也得到了类似的结果（补充图S10）。下载：下载高分辨率图像（745KB）下载：下载全尺寸图像图3. 含镧的生物磷去除（La-EBPR）系统中磷吸收的激活。a，添加了15 mg L−1含La气凝胶（LZGA）的La-EBPR系统的污泥扫描电子显微镜图像。b，LZGA浓度对细胞外聚合物物质中蛋白质（PN）和多糖（PS）产生的影响。误差条表示n次独立测量的标准偏差（n = 3）。c，在不同LZGA剂量下运行的反应器中EPS相关磷浓度的变化。d，与磷运输相关的向外K+通道的示意图。e，LZGA浓度对操作周期内K+浓度的影响。f，周期内K+和磷浓度的同步代谢。EPS是影响生物絮凝物理化学和生物特性的关键成分。先前的研究表明，EPS可以促进生物絮凝[49]、[50]、[51]。例如，EPS含有疏水分子，如脂质和蛋白质，可以使污泥表面部分疏水并增强絮凝效果。EPS的变化在不同LZGA浓度下有所不同（图3b）。EPS中的PS在SBRs之间没有显著差异，表明LZGA与PS没有直接相关性。相比之下，蛋白质浓度变化更为明显。当LZGA浓度在5到10 mg L−1之间时，蛋白质浓度从237.0 ± 4.5 mg/g MLVSS（混合液挥发性悬浮固体）增加到285.3 ± 6.8 mg/g MLVSS，然后在245.1 ± 3.8 mg/g MLVSS增加到338.1 ± 4.3 mg/g MLVSS，持续时间为60天。当LZGA剂量在15到30 mg L−1之间时，蛋白质含量在第60天达到最大值，并在接下来的20天内保持相对稳定。因此，我们得出结论，在LZGA剂量高于15 mg L−1的情况下，蛋白质浓度在40天后达到稳定状态。值得注意的是，当向反应器中添加15 mg L−1的LZGA时，蛋白质浓度增加了最多，从259.9 ± 6.4 mg/g MLVSS增加到363.6 ± 1.2 mg/g MLVSS。之后，随着剂量的增加，蛋白质浓度的增加幅度略有减小，但仍高于对照组。因此，较高的LZGA添加量并不一定会增加EPS含量。实际上，过量的LZGA可能会抑制EPS中某些蛋白质的生成，从而降低整体EPS含量。EPS中的蛋白质由于其疏水性，可以增强污泥絮体的稳定性和对外部毒素的抵抗力[52]、[53]、[54]、[55]。因此，在适当的LZGA浓度下，EPS的增加，尤其是蛋白质的增加，可能有助于生物絮凝的稳定性，这与观察到的污泥颗粒大小增加一致。然而，EPS的增加可能不利于活性污泥的絮凝和沉淀，因为EPS中的负电荷官能团可能导致污泥膨胀并降低微生物去除污染物的能力[56]、[57]。然而，在这个La-EBPR系统中，尽管EPS含量增加，污泥的沉淀性能并未恶化。事实上，在SBRs中培养活性污泥80天后，沉淀性能分别提高了35%、24%、21%、24%、18%和23%。这表明LZGA促进了活性La成分的释放，这些成分与絮体表面结合，中和了污泥表面的负电荷，从而改善了污泥的沉淀性能。因此，我们的发现表明，LZGA的添加不仅增加了EPS的生成，还改善了污泥的絮凝和沉淀性能。EBPR过程传统上通过交替厌氧和好氧条件来富集PAOs。PAOs通过代谢多磷酸盐在去除废水中的磷方面起着关键作用[22]、[23]、[24]、[25]。然而，研究表明EPS也有助于磷的去除。例如，Cloete等人报告称EPS含有27-30%的磷，可以被视为污泥絮体中的动态磷储存库[58]。Li等人也发现EPS参与了EBPR过程，并在磷去除系统中发挥重要作用[59]。LZGA的添加引起了EPS中磷含量的变化（图3c）。我们的发现表明，随着珠子的添加，EPS中的磷含量显著增加。到第80天，15 mg L−1的LZGA促进了PAOs周围的EPS基质捕获磷，使磷含量从19.4 ± 1.3 mg/g增加到26.9 ± 1.1 mg/g，比对照组高出10.6 mg/g。EPS中的蛋白质和PS都是能够通过离子力、氢键和范德华力桥接污染物并吸附多个胶体颗粒的聚合物。来自LZGA的活性La成分可以增强EPS的桥接效果。特别是La3+可以连接微生物细胞表面的蛋白质和PS，减少聚合物与污染物之间的静电相互作用，从而增强磷的捕获。因此，LZGA的添加不仅可以增加EPS的量，还可以增强EPS中磷的捕获。此外，磷是维持细胞生命过程的重要元素。离子通道是细胞膜的关键组成部分，对外来物质最为敏感。K+通道是最广泛分布的离子通道[34]（图3d）。当膜电位发生变化时，K+通道蛋白会受到电刺激，导致分子构型和通道功能状态（即通道的开闭）的变化。在这项研究中，LZGA持续缓慢地释放La3+。K+通道蛋白表面含有负电荷区域，这些区域作为La3+的结合位点。当细胞膜上捕获的La3+浓度较低时，不易形成大量稳定的复合物。La3+通过非共价协调适度干扰K+通道蛋白，从而加速K+通道的切换[28]、[29]。这与我们的实验结论一致。来自LZGA的La3+加速了K+通道的切换，在好氧阶段，La-EBPR系统环境中的K+浓度显著低于对照组（图3e），表明更多的K+进入了细胞。值得注意的是，K+始终作为多磷酸盐的反离子来维持细胞的中性[26]、[27]。在EBPR系统中，K+和PO43−同时被释放和吸收（图3f）。因此，LZGA中La3+的缓慢释放改善了细胞膜的K+通道，有效增强了K+和磷的同步代谢。
3.4 LZGA对微生物群落结构的影响
为了进一步确定LZGA对微生物，特别是PAOs的影响，我们进行了16S rRNA分析以评估活性污泥中的微生物群落多样性。添加LZGA后，反应器中的操作分类单元（OTU）数量有显著差异（表1），表明珠子对活性污泥系统中的微生物多样性和丰富度有显著影响。物种丰富度使用Chao1和基于丰度的覆盖估计器（ACE）进行评估，而物种多样性则使用Shannon和Simpson指数进行评估，如前所述[60]。与对照组相比，所有含有LZGA的反应器中的ACE和Chao1指数均显著增加，表明珠子促进了活性污泥系统中的微生物群落物种丰富度。关于Shannon指数，SBRs中的微生物多样性最初增加，随后随着LZGA剂量的增加而略有下降。这些结果表明，较低水平的LZGA珠子增加了物种丰富度和微生物多样性。然而，随着La的持续释放，生态系统选择了更适合在当前条件下生存的物种，使得污泥的特异性更高。
表1. LZGA对活性污泥微生物丰富度和多样性的影响。
LZGA浓度（mg L−1） OTU数量 Shannon指数 ACE指数 Chao1指数 Simpson指数
0 1710 5.372 291.81 2184.77 0.02
5 170 85.49 2489.76 2470.53 0.02
10 1912 5.48 2662.03 2600.02 0.02
15 1745 5.42 2495.83 2400.00 0.02
20 1749 5.10 2493.17 2392.77 0.03
30 1966 5.42 2643.28 2532.34 0.03
LZGA，含La的气凝胶。OTU，操作分类单元。ACE，基于丰度的覆盖估计器。0 mg L−1处理作为对照组。
为了研究La-EBPR系统内微生物群落的变化，我们检查了不同分类水平上的相对丰度（门和纲水平的结果显示在补充图S11中）。在属水平上，主要的细菌群被鉴定为Acinetobacter（图4），这种细菌已被认为是EBPR中参与磷去除的主要微生物物种[61]、[62]。添加LZGA后，Acinetobacter的比例从12.2%增加到15.9%。此外，Dechloromonas和Hydrogenophaga被报道为能够同时反硝化和去除PO43−的脱氮多磷酸盐积累菌（DPAOs）[62]。添加15 mg L−1的LZGA后，Dechloromonas和Hydrogenophaga的比例分别从0.9%增加到2.9%和从0.1%增加到1.0%，然后在更高剂量下减少。同样，Azohydromonas的相对丰度最初增加，随后随着LZGA浓度的增加而减少，在添加15 mg L−1的LZGA时达到最大值0.2%。尽管Azohydromonas尚未被证明是典型的PAO，但它显著影响有机磷农药的降解[63]。相比之下，Zoogloea不仅是DPAOs的成员，而且对活性污泥中EPS的形成也是必需的[64]。它们的丰度从对照组的1.2%增加到添加15 mg L−1的LZGA后的3.7%，然后减少到2.9%。这些结果与之前的EPS分析一致，表明适当的La浓度促进了EPS的形成。因此，适当的LZGA浓度增加了活性污泥系统中PAOs（包括DPAOs）和EPS的含量，从而促进了磷的去除。
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图4. 含La的气凝胶（LZGA）对微生物群落结构的影响。a，传统增强生物磷去除（EBPR）和La-EBPR系统中的属水平细菌群落结构。b，传统EBPR和La-EBPR系统中功能性细菌的相对丰度。丰度以污泥样本中总有效细菌序列的百分比表示。
尽管16S rRNA分析在分析微生物群落结构方面具有高通量优势，但在准确识别和量化具有复杂代谢功能的特定微生物群体方面存在局限性。例如，Candidatus Accumulibacter是PAO群体的关键成员。由于16S rRNA基因序列的高度保守性和与密切相关物种的相似性，它可能在这项分析中被低估了[10]。因此，16S rRNA分析主要揭示了LZGA对微生物群落整体结构的影响趋势。为了更直接和精确地揭示La对PAOs磷去除功能的激活作用，需要使用能够反映微生物实际生理状态和功能蛋白表达的分析方法。
3.5 蛋白组学和La-EBPR系统的响应机制
为了克服16S rRNA测序在功能分析方面的局限性，并直接研究LZGA对PAO活性的分子水平影响，我们对对照组和最佳处理组（15 mg L−1 LZGA）的污泥样本进行了宏蛋白质组学分析。这种方法可以直接检测微生物群落中功能蛋白的表达丰度，从而准确识别La-EBPR系统中PAO功能蛋白途径的变化。我们在三次重复实验中一致识别出4657种蛋白质。在添加15 mg L−1的LZGA后20天，蛋白质种类和表达水平的变化最为明显，1642种蛋白质表现出显著的丰度变化（图5a–d）。随着时间的推移，这些变化逐渐减小。60天后，蛋白质组成和含量与20天前相比保持相对稳定，表明La-EBPR系统达到了稳态，这与之前的发现一致。Candidatus Accumulibacter的蛋白质表达水平在添加LZGA后变化最为显著，从7.9×10^8增加到2.6×10^9。Candidatus Accumulibacter被广泛认为是污水处理中最具代表性的PAOs之一[62]，表明LZGA促进了PAO的生长并增强了蛋白质表达，从而促进了PAO介导的磷去除。此外，所有表现出显著表达变化的蛋白质都进行了无监督聚类，并根据它们对不同处理的响应相似性进行了分组。在Gene Ontology上的DEPS分类显示，与对照组相比，La-EBPR系统中与代谢过程、细胞过程、细胞解剖实体、催化活性和结合相关的蛋白质丰度显著增加（图5e）。相比之下，基于同源群集（Clusters of Orthologous Groups）的DEPs富集分析提供了更直观的解释，显示在添加LZGA后，与无机离子运输和代谢、脂质运输和代谢、氨基酸运输和代谢以及能量产生和转化相关的蛋白质在La-EBPR系统中显著增加（图5f）。下载：下载高分辨率图像（1009KB）下载：下载全尺寸图像图5. 传统增强型生物除磷（EBPR）系统与La-EBPR系统之间蛋白质丰度的变化。a–d，火山图显示了在初始阶段（a）、运行20天后（b）、40天后（c）和60天后（d）添加了15 mg L−1含La气凝胶的传统EBPR系统与La-EBPR系统之间的差异蛋白质表达水平。e，差异表达蛋白质的基因本体（GO）分类。f，差异表达蛋白质的同源群集（COG）分类。为了更好地理解LZGA对La-EBPR系统中与PAOs相关蛋白质的功能，我们识别了一个涉及4200种蛋白质及其相关途径的蛋白质途径调控网络。在La-EBPR系统中，添加LZGA上调了多种与PAOs相关的蛋白质和途径（图6）。大量直接与EBPR特征性的代谢转化相关的蛋白质被上调（蛋白质的访问信息和描述见补充表S2）。此外，我们假设如果LZGA在La-EBPR系统中起重要作用，那么与LZGA相关的蛋白质将在与P去除相关的途径中富集。引入LZGA珠子后，与乙醛酸/三羧酸（TCA）循环相关的酶在La-EBPR系统中表现出最显著的增加。TCA循环是EBPR的关键组成部分。在有氧阶段，TCA循环产生大量的三磷酸腺苷（ATP），为PAOs从环境中捕获P并合成多聚磷酸提供能量，从而促进废水中P的有效去除[65]。我们的蛋白质组学分析发现Candidatus Accumulibacter中的琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶铁硫亚基（SuccDH）增加。作为TCA循环的一部分，SuccDH的增加增强了乙酸吸收和多羟基烷酸生成的速度，从而促进了PAOs对P的吸收。另外三种与TCA循环相关的酶也高度表达，包括将TCA循环与随后的氧化磷酸化、糖酵解、糖异生以及脂质和氨基酸代谢途径联系起来的丙酮酸脱氢酶[66]。考虑到这些结果，适当的LZGA浓度可以增强La-EBPR系统中的TCA循环活性。几种参与氧化磷酸化的蛋白质也在La-EBPR系统中高度表达，这与ATP的产生有关。Dechloromonas中的多聚磷酸激酶1（PPK1）表达显著增加。PPK1是负责从ATP的末端PO43−可逆合成多聚磷酸（poly P）的主要酶[67]。微生物在有氧或厌氧条件下的P积累过程主要由PPK1催化。LZGA中活性La成分的释放促进了PPK1的产生，并直接增强了La-EBPR系统中的P释放和吸收。许多微生物的能量代谢基于糖酵解。在有氧阶段，糖酵解是能量的次要来源，大约95%的ATP产生来自TCA循环和氧化磷酸化。相比之下，厌氧阶段的PAOs几乎完全依赖糖酵解来产生ATP，因此不应忽视与糖酵解相关的酶[68]。在检查参与糖原降解和合成的特定蛋白质变化时，我们观察到磷酸甘油酸激酶、I型甘油醛-3-磷酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶以及几种其他与丙酮酸代谢相关的蛋白质显著增加。除了能量代谢的变化外，添加LZGA后参与PHA合成和PO43−运输系统的蛋白质表达也增加。PHA在PAOs的代谢和生长中起着关键作用，从而影响EBPR系统的效率[69]。蛋白质组学结果表明乙酰辅酶A乙酰转移酶显著增加，该酶可以在厌氧阶段为PHA合成提供所需的还原当量。此外，四种不同的ATP结合盒（ABC）转运蛋白与ABC型磷酸特异性运输系统（Pst）相关，显示出增加的趋势。在PAOs中，Pst运输系统将ATP水解与PO43−跨内膜的转运耦合起来，使PAOs能够主动运输和利用PO43−。PHA合成和磷酸运输系统的表达增加可以直接影响EBPR背景下PAOs的PO43−运输系统的生化和能量特性。下载：下载高分辨率图像（3MB）下载：下载全尺寸图像图6. 镧增强型生物除磷（La-EBPR）系统中的蛋白质-途径调控网络。蛋白质-途径网络连接了磷积累生物（PAO）相关属、蛋白质和La-EBPR系统中的富集代谢途径。基于上述实验结论和机制分析，我们提出了一个La-EBPR系统的P转化和运输模型（图7）。当LZGA被引入反应器后，建立了La-EBPR系统。LZGA中活性La成分的释放加速了K+通道的开放，有效增强了K+和P的同步代谢。一些活性La成分与Zoogloea结合，促进了EPS的形成。此外，LZGA促进了EPS对P的捕获，导致P的富集。当被EPS包裹的PAOs感知到P浓度增加时，它们的P代谢能力增强。先前的研究表明，细菌细胞壁的三维网络结构可以为La提供可结合位点[70]。另一部分活性La成分与PAOs和DPAOs形成复合物，显著增强了与TCA循环、氧化磷酸化和其他能量代谢过程相关的酶的生长，并加强了磷酸运输系统。此外，PAOs的数量增加，伴随着PAO相关蛋白质的显著上调，包括来自Candidatus Accumulibacter的蛋白质，从而增强了La-EBPR系统中的磷去除。此外，La可以结合到絮体表面，中和污泥表面的负电荷，从而改善污泥沉降性能。因此，在La-EBPR系统中，LZGA在PAOs和EPS的功能中起着关键作用。下载：下载高分辨率图像（654KB）下载：下载全尺寸图像图7. 镧增强型生物除磷（La-EBPR）系统中磷转化和运输的提出机制。示意图说明了含La气凝胶如何促进La-EBPR系统中的磷转化和运输，包括对磷积累生物活性、细胞外聚合物相关磷、K+通道激活、磷酸运输和细胞能量代谢的影响。PPK1，多聚磷酸激酶1；ADP，二磷酸腺苷；ATP，三磷酸腺苷；TCA循环，三羧酸循环；NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；FADH2，黄素腺嘌呤二核苷酸还原型。4. 结论在这项研究中，我们展示了一种通过增强PAO活性来提高La-EBPR系统中P去除率的策略。在向La-EBPR系统中添加15 mg L−1 LZGA后，TP浓度显著降低至0.14 mg L−1。与传统化学除磷方法相比，所提出的La-EBPR系统减少了大约两个数量级的化学消耗。此外，LZGA增加了EPS的产生，增强了P的吸收，并改善了污泥沉降性能。LZGA中活性La成分的释放改善了细胞膜上的K+通道功能，从而增强了K+和P的同步代谢。此外，LZGA可以有选择地调节La-EBPR系统中的微生物。高通量测序结果显示，最佳浓度的LZGA有利于PAO的生长。我们的研究表明，参与能量代谢和PO43−运输系统的蛋白质表达水平更高，首次直接突显了La在EBPR代谢中的重要性。这项研究有望为以La为核心成分的EBPR策略的发展提供有价值的参考。作者贡献声明Ruixue Jiang：数据整理。Fangmin Wu：概念化。Zhencheng Ge：验证。Xuesong Ye：可视化。Wei Wang：写作-审阅与编辑。Jun Ma：写作-审阅与编辑、原始草稿撰写、形式分析、概念化。Jun Nan：监督、资金获取。Rongcheng He：调查。Haiyang Wei：调查。Tianyi Zhao：方法学。Yibo Zhang：调查。利益冲突声明作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。Environmental Science and Ecotechnology的顾问委员会成员Jun Ma博士没有参与本文的编辑审查或发表决定。
