摘要
引言与假设
低强度体外冲击波疗法（LiESWT）是一种有前景的非侵入性治疗压力性尿失禁（SUI）的方法。我们评估了LiESWT是否能在阴道膨胀（VD）诱导的SUI大鼠模型中恢复尿道功能，重点关注盆底组织重塑和内质网应激途径作为潜在机制。
方法
81只雌性Sprague–Dawley大鼠接受了功能和组织分析。通过诱发打喷嚏来评估尿道压力反应。在有无切断腹下神经和阴部神经的情况下测量泄漏点压力（LPP）。使用组织学和分子表达分析来评估组织重塑和分子途径。
结果
在VD大鼠中，基线尿道压力（9.9 ± 4.3 vs 17.6 ± 3.1 cmH2O）和LPP（27.4 ± 4.7 vs 37.0 ± 7.0 cmH2O）均低于正常大鼠（p < 0.05）。LiESWT恢复了VD大鼠的基线尿道压力（16.3 ± 4.7 cmH2O）和LPP（37.5 ± 4.9 cmH2O）（p < 0.05）。值得注意的是，在双侧切断腹下神经和阴部神经后，LPP的增强效果仍然持续存在。此外，LiESWT在组织学上倾向于减少VD诱导的阴道平滑肌纤维化，而I型胶原α和弹性蛋白的mRNA表达在两组中均保持升高。Western blot检测显示，在最后一次LiESWT后96小时，蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）没有持续激活。
结论
LiESWT通过促进盆底组织重塑，从而恢复了VD诱导的SUI模型中的尿道功能，实现了尿道的被动闭合。后期没有持续的PERK激活表明LiESWT治疗SUI的安全性。
引言与假设
低强度体外冲击波疗法（LiESWT）是一种有前景的非侵入性治疗压力性尿失禁（SUI）的方法。我们评估了LiESWT是否能在阴道膨胀（VD）诱导的SUI大鼠模型中恢复尿道功能，重点关注盆底组织重塑和内质网应激途径作为潜在机制。
方法
81只雌性Sprague–Dawley大鼠接受了功能和组织分析。通过诱发打喷嚏来评估尿道压力反应。在有无切断腹下神经和阴部神经的情况下测量泄漏点压力（LPP）。使用组织学和分子表达分析来评估组织重塑和分子途径。
结果
在VD大鼠中，基线尿道压力（9.9 ± 4.3 vs 17.6 ± 3.1 cmH2O）和LPP（27.4 ± 4.7 vs 37.0 ± 7.0 cmH2O）均低于正常大鼠（p < 0.05）。LiESWT恢复了VD大鼠的基线尿道压力（16.3 ± 4.7 cmH2O）和LPP（37.5 ± 4.9 cmH2O）（p < 0.05）。值得注意的是，在双侧切断腹下神经和阴部神经后，LPP的增强效果仍然持续存在。此外，LiESWT在组织学上倾向于减少VD诱导的阴道平滑肌纤维化，而I型胶原α和弹性蛋白的mRNA表达在两组中均保持升高。Western blot检测显示，在最后一次LiESWT后96小时，蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）没有持续激活。
结论
LiESWT通过促进盆底组织重塑，从而恢复了VD诱导的SUI模型中的尿道功能，实现了尿道的被动闭合。后期没有持续的PERK激活表明LiESWT治疗SUI的安全性。
引言
压力性尿失禁（SUI）影响生活质量，尤其是在绝经后妇女中[1]。有非侵入性治疗方法，如盆底肌肉训练[2]，但它们需要较长时间才能见效，并且成功率不一[2]。此外，尽管有药物疗法（如克伦特罗尔），但其效果有限[3]。对于严重病例，网片植入手术有效但具有高度侵入性。此外，网片相关并发症导致了食品药品监督管理局的警告和更新指南[4]。因此，迫切需要开发新的微创疗法。了解SUI的病理生理学对于开发此类微创疗法至关重要。
尿道过度活动和内在括约肌缺陷是SUI的两个主要因素，其中后者是主导机制[5, 6]。当前的治疗方法主要提供机械性尿道支持，未能解决根本的病理生理问题。阴道结构恶化导致尿道压力降低和过度活动[7,8,9,10]。因此，恢复盆底组织结构和功能可能对改善SUI结果至关重要。在这方面，低强度体外冲击波疗法（LiESWT）作为一种促进组织修复的潜在治疗方法引起了关注。
LiESWT促进血管生成[11]，减少纤维化[12]，并增强受损组织中的神经再生[13]。LiESWT在多种大鼠模型中改善了尿功能，包括脂多糖诱导的膀胱炎[14]、脊髓损伤[12]和母子分离压力[15]。此外，它在动物模型和临床试验中都通过促进组织再生而有益于SUI[13, 16, 17]。LiESWT激活了海绵组织中的蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）/激活转录因子4（ATF4）信号通路[18]。该通路是内质网（ER）应激反应的主要介质，其激活与脑源性神经营养因子（BDNF）表达的增加有关[18]。然而，持续的PERK激活可能促进细胞凋亡并损害组织修复[19]。LiESWT是在泌尿生殖组织中诱导短暂的有益ER应激反应还是持续的有害激活尚不清楚。
为了解决这个问题，我们使用了阴道膨胀（VD）模型，该模型模拟了怀孕和分娩期间阴道组织所经历的机械应力和缺血，广泛用于研究SUI[20,21,22]。在腹压增加期间，有两种不同的机制维持尿失禁：被动机制通过平滑肌张力和尿道周围组织支持维持基线尿道压力[6]；主动机制涉及通过躯体神经快速收缩外部尿道括约肌和盆底横纹肌[5]。这两种机制在VD大鼠中都受损[23, 24]。我们之前建立了一个可以测量打喷嚏诱导的尿道闭合机制的大鼠模型[23]。在VD模型中，LiESWT提高了泄漏点压力（LPP）并促进了组织修复[22]。然而，尚不清楚LiESWT是否通过被动、主动或两种机制在打喷嚏等应激事件中增强尿失禁控制。
因此，在本研究中，我们使用打喷嚏诱导的尿道压力测量和LPP评估来评估LiESWT对尿道功能的影响。此外，我们还检查了阴道和尿道组织中的组织重塑和ER应激相关基因表达，以评估VD大鼠模型中功能恢复的机制。
材料与方法
动物
使用了81只9周大的雌性Sprague–Dawley大鼠。本研究获得了我们机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循ARRIVE指南（批准编号A2021041）。
阴道膨胀（VD）
大鼠用2%异氟醚麻醉。腹腔内注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）[23]。15分钟后，通过尾刺无退缩反射确认了足够的镇静效果。将一根润滑的10-Fr球囊导管插入阴道，并用4-0缝合线固定。球囊充入4 mL蒸馏水。VD持续3小时，整个过程中监测导管位置。
LiESWT方案
在2%异氟醚麻醉下，使用ED-1000®设备（Medispec，Yehud，以色列）经会阴部传递LiESWT（0.12 mJ/mm2，2 Hz，每次300次冲击）。调整换能器至最佳焦点深度以瞄准尿道中部区域。治疗在VD后24小时和72小时进行（图1a）。使用凝胶垫确保焦点区域对齐（图1b）。
图1
低强度体外冲击波疗法（LiESWT）的实验设置。(a) 实验时间线。第0天进行阴道膨胀（VD），第1天和第3天进行LiESWT。第7天进行尿道压力（UP）、泄漏点压力（LPP）和组织采集，用于组织学、Western blotting（WB）和聚合酶链反应（PCR）。(b) LiESWT方案的示意图。换能器放置在会阴部，并使用耦合凝胶确保焦点区域对齐（焦点距离6 cm）。冲击波（0.12 mJ/mm2，2 Hz，每次300次冲击）朝向尿道和阴道。
尿动力学测量
打喷嚏诱导的微尖端尿道测量
24只大鼠（8只正常大鼠和16只VD大鼠，包括来自实验1的大鼠）参与了这项实验。大鼠用2%异氟醚麻醉。将PE-10导管插入颈静脉注射乌拉坦。结扎两侧输尿管以防止膀胱收缩并减少自然排尿反射的干扰。从直肠清除粪便。将自制球囊导管（直径1 cm）经直肠插入腹腔，并连接到压力换能器以记录打喷嚏时的腹压。手术后停止异氟醚麻醉。腹腔内注射乌拉坦（0.5 g/kg），根据需要追加静脉剂量（每次2.5 mg），总剂量范围为1.0至1.2 g/kg。保持适当的麻醉深度以保留反射反应，同时确保动物福利。将带有侧装换能器（SPR-524；Millar Instruments，Houston，TX）的3.5-Fr微尖端导管插入尿道中部。导管位置距尿道口约12.5 mm。通过轻轻机械刺激鼻孔诱发打喷嚏（使用修剪的大鼠胡须）[23]。连续收集16次打喷嚏，间隔30秒。连续记录基线尿道压力、打喷嚏时的峰值尿道压力和同时的腹压。打喷嚏时的主动尿道反应（AUR）定义为最大尿道压力（MUP）与基线尿道压力之间的差值。数据采集使用PowerLab系统进行。排除压力反应超出±2标准差（SD）的打喷嚏。此外，低于3 cmH2O的打喷嚏也被排除在分析之外。
泄漏点压力（LPP）测量
30只大鼠（10只正常大鼠、10只VD大鼠和10只VD+LiESWT大鼠）专门用于这项实验。大鼠用2%异氟醚麻醉。通过腹部切口切断两侧盆神经。通过膀胱造口插入PE-50导管。在伤口闭合前皮下注射乌拉坦（1.2 g/kg）。稳定2小时后，将大鼠垂直放置。通过连接到无活塞注射器的膀胱造口导管向膀胱内注入含Evans blue（100 μg/mL）的生理盐水。持续监测膀胱内压力。逐渐增加生理盐水容量，直到尿液从尿道口泄漏。LPP记录为泄漏开始时膀胱与液体水平之间的高度差（cmH2O）。每只大鼠平均记录三次测量值。每次测量后排空膀胱。
在初次LPP测量后，在相同的麻醉下切断两侧腹下神经和阴部神经，以区分被动尿道闭合机制和神经张力的贡献。稳定2小时后，使用相同的方案重复LPP测量。
组织学分析
将膀胱、尿道和阴道整体切除，固定在10%甲醛中最多24小时，然后包埋在石蜡中。制作4 µm厚的矢状切片，并用Masson三色染色。对于每个样本，在围绕外部尿道括约肌的三个区域（阴道平滑肌、尿道平滑肌和外部尿道括约肌）以400倍放大率捕获三个随机视野。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）量化胶原（蓝色）和肌肉（红色）区域。分离红色、绿色和蓝色通道，并使用颜色阈值识别胶原和肌肉区域。计算纤维化比率（胶原面积/（胶原+肌肉面积）。
Western Blot分析
蛋白质分离和Western Blot分析
在单独的大鼠组（正常组，n = 3；VD组，n = 4；VD+LiESWT组，n = 4）中，采集阴道和尿道组织样本进行蛋白质分析。这些动物未接受LPP或打喷嚏测试，以避免重复机械应力对蛋白质表达水平的影响。组织样本立即放入含有1% Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠的放射免疫沉淀测定缓冲液中，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（β-甘油磷酸盐、orthovanadate和氟化钠），然后手动匀浆。进一步使用超声匀浆器匀浆并离心（12,000 rpm，10分钟，4°C）。收集上清液进行分析。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PERK用6%，β-actin用10%）分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。使用Blocking One（Nacalai Tesque）封闭膜。使用的 primary 抗体是抗PERK（C33E10，1:1500，兔单克隆；Cell Signaling Technology）和抗β-actin（MAB1501，1:8000，鼠单克隆；Merck）。secondary 抗体是抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP）（A0545，1:5000，羊多克隆；Sigma-Aldrich）用于PERK，以及抗鼠IgG-HRP（AP160P，1:5000，兔多克隆；Millipore）用于β-actin。由于即使在阳性对照中也与磷酸化PERK抗体无反应，因此通过电泳迁移率变化评估PERK磷酸化。蛋白质条带是通过Chemi-Lumi One Ultra（Nacalai Tesque）检测PERK的，以及使用ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（Cytiva）检测β-actin的。实时聚合酶链反应（PCR）分析用于RNA提取。在另外几组大鼠中（每组n=5），收集了阴道和尿道组织样本进行mRNA分析。这些动物没有接受LPP或喷嚏测试，以避免重复机械应力对转录水平的影响。组织样本立即放入1.5 mL试管中，并在液氮中快速冷冻。使用Trizol试剂（Invitrogen）从冷冻组织中提取总RNA，然后使用NucleoSpin RNA试剂盒（Macherey–Nagel，德国）进行纯化，并储存在-80°C。在cDNA合成之前，通过1.0%琼脂糖凝胶上的电泳和500 bp标记物来评估RNA的质量。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）在20 µL反应体积中从2 µg的总RNA（样本<200 ng/µL时最多10 µL）合成cDNA。逆转录过程在25°C下进行10分钟，在37°C下进行120分钟，在85°C下进行5分钟，随后在4°C下孵育。定量实时PCR（RT-qPCR）使用StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）和TB Green® Premix Ex Taq™ II（Takara Bio）按照制造商的协议进行，以分析与细胞外基质重塑、肌肉分化、缺氧反应、纤维化、内质网应激和细胞衰老相关的基因表达。分析的基因、引物序列及其原始参考文献列在补充表1中。热循环条件如下：初始变性在95°C下进行10分钟，然后是40个循环，每个循环包括95°C 15秒、55°C 1分钟和72°C 30秒。所有样本都重复运行两次。在确认GAPDH在实验条件下的表达稳定后，使用GAPDH作为内部参考基因。初步实验确认所有目标基因的扩增效率与GAPDH相当。相对基因表达使用标准曲线方法计算。数据以平均值±标准差（SD）或中位数（四分位数范围）表示，视情况而定。使用Shapiro–Wilk检验评估分布的正态性。对于正态分布的数据，使用Bartlett检验评估方差的同质性。满足这两个假设的数据使用单因素方差分析，然后进行Tukey–Kramer诚实显著差异检验。非参数数据或方差不等的数据使用Kruskal–Wallis检验，然后进行Steel–Dwass检验。统计显著性设定为p<0.05。统计分析使用JMP Student’s Edition（版本19；JMP Statistical Discovery LLC，美国北卡罗来纳州卡里）进行。图表使用GraphPad Prism（版本8；GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）创建。
蛋白质条带使用Chemi-Lumi One Ultra（Nacalai Tesque）检测PERK，使用ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（Cytiva）检测β-actin。实时聚合酶链反应（PCR）分析用于RNA提取。在额外的独立大鼠组中（每组n=5），收集了阴道和尿道组织样本进行mRNA分析。这些动物没有接受LPP或喷嚏测试，以避免重复机械应力对转录水平的影响。组织样本立即放入1.5 mL试管中，并在液氮中快速冷冻。使用Trizol试剂（Invitrogen）从冷冻组织中提取总RNA，然后使用NucleoSpin RNA试剂盒（Macherey–Nagel，德国）进行纯化，并储存在-80°C。在cDNA合成之前，通过1.0%琼脂糖凝胶上的电泳和500 bp标记物评估RNA的质量。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）从2 µg的总RNA（样本<200 ng/µL时最多10 µL）合成cDNA，在20 µL反应体积中。逆转录过程在25°C下进行10分钟，在37°C下进行120分钟，在85°C下进行5分钟，随后在4°C下孵育。定量实时PCR（RT-qPCR）使用StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）和TB Green® Premix Ex Taq™ II（Takara Bio）按照制造商的协议进行，以分析与细胞外基质重塑、肌肉分化、缺氧反应、纤维化、内质网应激和细胞衰老相关的基因表达。分析的基因、引物序列及其原始参考文献列在补充表1中。热循环条件如下：初始变性在95°C下进行10分钟，然后是40个循环，每个循环包括95°C 15秒、55°C 1分钟和72°C 30秒。所有样本都重复运行两次。在确认GAPDH在实验条件下的表达稳定后，使用GAPDH作为内部参考基因。初步实验确认所有目标基因的扩增效率与GAPDH相当。相对基因表达使用标准曲线方法计算。
尿动力学发现：VD大鼠的基线尿道压力显著低于正常对照组（9.9 ± 4.3 cmH2O vs 17.6 ± 3.1 cmH2O，p < 0.05）。LiESWT将基线压力恢复到与正常对照组相当的水平（16.3 ± 4.7 cmH2O）（表1）。VD组和LiESWT组之间的MUP没有显著差异（p = 0.157）。由于基线压力得到恢复，而AUR在VD组（4.8 [2.0–7.2] cmH2O）和LiESWT组（4.3 [2.7–6.5] cmH2O）中仍然显著受损，与正常对照组（44.4 [31.9–54.5] cmH2O）相比，LiESWT组MUP的轻微增加主要归因于基线压力的恢复。这些发现表明LiESWT主要恢复了基线尿道张力，而不是对喷嚏刺激的动态收缩反应。表1 喷嚏实验。完整表格。使用完整的下腹神经和阴部神经进行的LPP测量在不同组间显示出显著差异（表2）。对照组大鼠的LPP保持在37.0 ± 7.0 cmH2O。VD组将LPP降低到27.4 ± 4.7 cmH2O。LiESWT将LPP增强到37.5 ± 4.9 cmH2O，完全恢复到对照组水平。在下腹神经和阴部神经切断后，LiESWT的保护作用仍然存在。LiESWT处理的大鼠表现出显著更高的LPP（31.0 ± 5.8 cmH2O），与VD大鼠（20.2 ± 2.8 cmH2O）相比，p < 0.05，这表明尽管骨盆神经、下腹神经和阴部神经被切断，治疗效果仍然存在（表2）。表2 泄漏点压力测量。完整表格。组织学发现：定量组织学分析显示，VD大鼠阴道平滑肌层的纤维化比率显著高于正常对照组（37.1 ± 4.5% vs 29.1 ± 5.9%，p = 0.077）。LiESWT处理的大鼠的纤维化比率（28.4 ± 5.3%）低于单独VD组（p = 0.055），LiESWT处理组和正常大鼠之间没有显著差异（p = 0.979）（图2j）。相比之下，各组之间的尿道平滑肌或外部尿道括约肌没有显著差异（图2k, l）。这些发现表明LiESWT主要影响阴道壁组织的细胞外基质重塑。在VD大鼠的尿道组织中观察到微血管充血（图2e，星号）。图2 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像。阴道和尿道组织的组织学分析。Masson三色染色的代表性图像（蓝色胶原，红色肌纤维）。(a–c) 尿道和阴道组织的矢状切片，放大40倍（上尿道，下阴道；右侧颅侧，左侧尾侧）：(a) 正常，(b) 阴道膨胀（VD），(c) VD + 低强度体外冲击波治疗（LiESWT）。(d–f) 尿道平滑肌，放大400倍：(d) 正常，(e) VD，(f) VD + LiESWT。(g–i) 阴道平滑肌，放大400倍：(g) 正常，(H) VD，(I) VD + LiESWT。星号表示VD大鼠的微血管变化（e）。刻度尺=300 µm (a–c) 和 30 µm (d–i)。(j–l) 纤维化比率（胶原面积/[胶原 + 肌肉面积]）的定量分析：(j) 阴道平滑肌，(k) 尿道平滑肌，(l) 外部尿道括约肌（横纹肌）。数据以平均值±标准差（SD）表示（每组n=5）。使用单因素方差分析，然后进行Tukey–Kramer诚实显著差异检验。Western Blot发现：分析了所有三组尿道和阴道组织中的PERK表达。在所有组（正常、VD和LiESWT）中都检测到一个大约140 kDa的单一条带，没有条带移动表明PERK磷酸化（图3）。使用λ蛋白磷酸酶处理确认了移动性变化，消除了阳性对照样本中的上移条带（补充图1）。这些结果表明，在最后一次LiESWT治疗后96小时内，PERK磷酸化没有持续。图3 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像。Western blot分析蛋白质激酶R样内质网激酶（PERK）的表达。代表性Western blot图像显示了最后一次LiESWT治疗后96小时，正常组（n=3）、阴道膨胀组（VD）（n=4）和VD + 低强度体外冲击波治疗组（LiESWT）（n=4）尿道和阴道组织中的PERK（约140 kDa）和β-actin表达。在所有组中都只检测到一个大约140 kDa的单一条带，没有条带移动表明PERK磷酸化。β-actin水平在所有样本中一致。定量实时PCR（RT-qPCR）发现：图4显示了阴道组织中的mRNA表达水平。VD大鼠的I型胶原α链（Col1a）表达显著高于正常对照组（p < 0.05）（图4a）。LiESWT处理的大鼠表现出中等水平，与正常组或VD组没有显著差异。此外，VD大鼠的弹性蛋白表达显著高于正常大鼠（p < 0.05），LiESWT处理的大鼠也表现出类似的增加水平（图4c）。Col3a也表现出类似的模式，尽管差异没有达到统计显著性（图4b）。图4 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像。阴道组织中基因表达的定量实时聚合酶链反应（PCR）分析。(a) I型胶原α1（Col1a），(b) III型胶原α1（Col3a），(c) 弹性蛋白，(d) α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），(e) 缺氧诱导因子1α（HIF-1α），(g) 转化生长因子β1（TGF-β1），(h) 激活转录因子4（ATF4），(i) CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP），(j) 葡萄糖调节蛋白78（GRP78），(k) 脑源性神经营养因子（BDNF），(l) 血管内皮生长因子（VEGF）和(m) 谷氨酰胺酶-1（GLS-1）的mRNA表达水平。Col1a（a）和弹性蛋白（c）在阴道膨胀（VD）和低强度体外冲击波治疗（LiESWT）处理的VD大鼠中的表达水平显著高于正常组，VD组和LiESWT处理的VD大鼠之间没有显著差异。Col3a（b）的表达在VD组中也显著高于正常组。数据以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为基准进行标准化，并相对于正常组表达。统计分析：参数数据使用Tukey–Kramer诚实显著差异检验；非参数数据使用Steel–Dwass检验。n = 每组5。每个面板中显示达到或接近统计显著性的确切p值。α-平滑肌肌动蛋白、desmin、缺氧诱导因子-1α和转化生长因子-β1在各组之间没有显著差异（图4d–g）。此外，PERK相关标记物（激活转录因子4 [ATF4]、C/EBP同源蛋白 [CHOP] 和葡萄糖调节蛋白78 [GRP78]）在各组之间也没有显著差异（图4h–j）。BDNF、血管内皮生长因子α和谷氨酰胺酶-1在各组之间没有显著差异（图4k–m）。
讨论：本研究证明LiESWT在SUI的VD大鼠模型中恢复了尿道的被动闭合机制。基线尿道压力和LPP恢复到正常水平。值得注意的是，即使在骨盆神经、下腹神经和阴部神经被切断后，LPP的增强仍然持续。据我们所知，这是首次报告LiESWT诱导的功能增强独立于这些神经通路，表明尿道周围组织的结构恢复有助于治疗效果。在功能和组织学水平上，如喷嚏等压力事件期间的尿道控制依赖于被动和主动闭合机制[5, 6, 23]。被动机制通过交感神经支配的平滑肌张力和尿道周围组织的支持来维持基线尿道压力。被动机制对于日常活动（如站立和行走）中的持续控制至关重要。尿道周围的结缔组织，特别是前阴道壁，提供了一个支持性的“吊床”，使压力有效传递到尿道[6]。VD损伤通过机械拉伸和缺血破坏了这种结构，导致组织损伤[20, 21]。我们的功能结果表明，LiESWT主要恢复了这种被动机制，这通过上调的Col1a和弹性蛋白以及阴道平滑肌中纤维化比率的趋势降低得到证实。与VD损伤后的病理纤维化反应不同，LiESWT促进了有益的组织重组，增强了尿道周围的支持。这些发现表明，LiESWT在治疗后1周内就为尿道的被动闭合提供了早期益处。此外，即使在进一步切断下腹神经和阴部神经后，LPP的增强仍然持续，这表明治疗效果归因于尿道周围组织支持的结构恢复，而不是神经张力。在同一功能水平上，主动机制涉及通过躯体神经快速收缩外部尿道括约肌和盆底横纹肌[5, 25]。这种机制对于在突然增加的腹压（如喷嚏）期间维持控制至关重要，由Onuf核介导[23]。此外，VD会导致泌尿生殖组织的缺血和缺氧，可能影响神经功能[20]。因此，这种主动机制容易受到VD损伤的影响。我们的功能数据与之前证明LiESWT在SUI模型中有效的报告一致[13, 16, 22]。然而，喷嚏时的峰值压力反应仍然受损。先前的研究报告了LiESWT后的神经再生和神经肌肉接头形成[13]。此时AUR的持续受损表明神经再生需要比结构组织修复更长的时间。长期观察可能会揭示主动尿道闭合机制的增强。VD引起的缺血和缺氧可能导致外部尿道括约肌的神经损伤[20]。此外，VD后EUS神经肌肉回路的结构和功能恢复即使在VD后11天也不完全[26]，这表明本研究中1周的观察期不足以实现完全恢复。此外，VD引起的黏膜水肿可能进一步阻碍了压力向尿道的传递。在分子水平上，通过RT-qPCR和组织学分析评估，VD大鼠的Col1a和弹性蛋白表达显著高于正常对照组。这表明VD损伤后发生了活跃的细胞外基质重塑。盆腔支持组织中的胶原改变导致盆腔器官功能障碍[7, 8]。此外，阴道创伤改变了尿道结缔组织结构[9]。LiESWT处理的大鼠保持了类似的胶原表达水平，表明基质合成持续进行，而不仅仅是简单地抑制了纤维化反应。LiESWT调节巨噬细胞功能并促进组织愈合[11]。在本研究中，LiESWT处理的大鼠在组织学上表现出纤维化比率降低的趋势，低于VD对照组。这表明组织结构得到了改善，可能会增强尿道周部的支持作用。此外，在分子水平上，我们进行了Western blotting分析，以评估内质网（ER）应激信号通路在LiESWT（低强度冲击波疗法）诱导的组织修复中的潜在作用。如上所述，LiESWT激活了PERK/ATF4通路[18]。然而，在最后一次LiESWT治疗后的96小时内，我们并未通过Western blotting检测到PERK的磷酸化。另外，RT-qPCR也未发现PERK相关标志物（ATF4、CHOP和GRP78）或BDNF水平的显著变化。持续的PERK激活和CHOP升高会诱导细胞凋亡和组织损伤，而不是促进修复[19]。这一时间点上PERK通路激活的缺失表明，LiESWT诱导的内质网应激反应是短暂的，并且已经消退。已知LiESWT通过多种机制发挥其治疗效果，包括促进血管生成、神经再生和抗纤维化作用[11,12,13,14,15,16]，这些机制可能在不同的时间尺度上发挥作用。未来研究如果在LiESWT后的前6-48小时内进行，可能会有助于阐明这些分子通路的时间动态变化。此外，尿生殖道组织中表达有机械敏感受体，如piezo1[27]和瞬时受体电位香草酸4[28]，这些受体可能作为冲击波刺激的主要感受器，对其的评估可以揭示LiESWT的精确作用机制。总体而言，这些发现支持LiESWT的安全性，因为它不会引起持续的内质网应激。
临床研究已经证明了LiESWT对患有尿失禁（SUI）的女性患者的有效性[16, 17]。我们的结果表明，LiESWT恢复了基线尿道压力和LPP（尿道闭合压力），表明它在日常活动（如站立和行走）中对控制尿液泄漏具有临床益处，从而提高了生活质量。LiESWT的非侵入性使其成为不适合手术干预患者的一个有吸引力的选择。作为一种非侵入性疗法，LiESWT不需要手术切口，应用过程中也没有报告疼痛。PERK持续激活的缺失表明LiESWT不会引起与细胞凋亡和组织损伤相关的内质网应激。尽管这些发现强调了LiESWT的安全性，但仍需进行长期随访以完全确认其安全性。值得注意的是，LiESWT已经在临床实践中用于治疗尿失禁[16, 17]。由于其对尿道被动闭合的作用，LiESWT可能对各种尿失禁患者有益，包括前列腺切除术后出现尿失禁的男性患者。
本研究存在一些局限性。我们的尿动力学测量是在盆腔神经切断后进行的。这一操作中断了为盆底横纹肌提供补充神经支配的自主神经和躯体运动分支，而这些分支在打喷嚏时也参与尿道闭合[25]。因此，我们的结果主要反映了尿道被动闭合机制和平滑肌功能。这可能部分解释了LiESWT后打喷嚏引起的收缩压力恢复有限的原因。关于分子分析，Western blotting（每组3-4个样本）和RT-qPCR（每组3-5个样本）的样本量较小，这可能限制了统计功效。因此，尽管某些标志物未达到统计学显著性，但它们仍可能发生了生物学上的变化，正如先前的报告所建议的那样，阴性结果不应被解释为无效应。在单一时间点（96小时）的评估可能无法完全捕捉到LiESWT诱导的分子变化的时间动态。
结论：在这项大鼠尿失禁模型研究中，LiESWT将基线尿道压力和LPP恢复到接近正常水平。组织学上，LiESWT治疗后阴道纤维化有所减轻。这些功能改善在神经切断后仍然存在，表明LiESWT通过影响尿道周阴道组织恢复了尿道被动闭合机制。最后一次LiESWT治疗后的96小时内未检测到PERK的持续激活，这支持了LiESWT良好的安全性。这些结果支持进一步评估LiESWT作为尿失禁非侵入性治疗方法的潜力。
