**摘要**
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**引言**
气候变化不仅加剧了平均气温，还增加了极端热事件的频率、持续时间和严重程度，尤其是热浪（Ding等人，2024年；IPCC，2023年）。这些趋势在诸如地中海盆地这样的气候变暖热点地区最为明显（IPCC，2023年），预计到本世纪中叶，热浪的频率和强度将翻倍（Lorenzo等人，2021年）。自1950年以来，该地区热浪天数已增加了2.5倍（Ding等人，2024年）。这种加剧的热极端事件对小型鸟类构成了严重的生理挑战，因为它们具有较高的代谢率、昼夜活动模式、较高的体温（Tb），以及固有的散热能力有限（Boyles等人，2011年；McKechnie等人，2021年；McKechnie & Wolf，2010年）。尽管地中海盆地被广泛认为是气候脆弱的热点地区，但该地区鸟类对反复热应激的生理适应机制仍知之甚少。当环境温度（Ta）接近或超过鸟类的正常体温（约39°C–42°C）时，在长时间或反复的热浪中，鸟类的稳态会迅速受到破坏（McKechnie等人，2023年；Nilsson等人，2016年；O'Connor等人，2024年；Tapper等人，2020年）。在这种情况下，鸟类依赖蒸发冷却机制（喘息、喉部振动、皮肤水分流失）来散发多余的热量（McKechnie & Wolf，2010年；O'Connor等人，2024年）。然而，蒸发散热在能量上代价高昂，尤其是对于那些单位体重水分周转率较高的小型物种（Cabello-Vergel等人，2022年）。选择性发热（一种短暂地将体温升高到正常体温以上的现象）提供了一种补充策略，可以延缓蒸发水分流失并保存体液（McKechnie等人，2023年；Tapper等人，2020年）。但其适用范围受到狭窄的热安全边际的限制：对于许多物种而言，核心体温超过约45°C–47°C通常是致命的，而持续的高温会改变酶活性、神经功能或繁殖能力（McKechnie等人，2023年；O'Connor等人，2024年）。理解这些权衡和阈值限制对于预测鸟类在气候变化下的热浪适应能力至关重要。虽然选择性发热通过延缓蒸发水分流失提供了即时的水分益处，但越来越多的证据表明这种策略会带来生理成本，包括氧化应激的累积、免疫功能的受损以及细胞完整性的降低（Mujahid等人，2005年；Tapper等人，2020年；Vágási等人，2018年；Zhang等人，2023年）。在鸟类中，适度的糖皮质激素升高可以通过增强抗氧化防御来暂时缓解氧化损伤（Vágási等人，2018年）。然而，长时间或强烈的热应激会破坏氧化还原平衡，最终影响生理表现和适应性（Jacobs等人，2020年；Lin等人，2008年）。跨脊椎动物类的实验研究证实了氧化应激在极端热条件下作为生存和免疫功能调节因子的作用（Jacobs等人，2021年；Ritchie & Friesen，2022年；Zhang等人，2023年）。因此，选择性发热在应对未来变暖情景中的缓冲能力，特别是在那些蒸发冷却效率有限或水源受限的物种中，可能受到严重限制（Cabello-Vergel等人，2022年；McKechnie等人，2023年）。行为调整，如在高温时段寻找阴凉处或减少活动，可以提供一定的热应激缓冲（du Plessis等人，2012年）。然而，在严重或持续的热浪期间，这些反应往往不足，这突显了内在生理机制和形态特征在维持热平衡中的重要性。在这些机制中，轮廓羽毛的结构和颜色越来越被认为是鸟类热调节性能的关键决定因素（Osváth等人，2018年；Pap等人，2020年；Sándor等人，2022年）。比较研究表明，羽毛微观结构与栖息地特定的热环境之间存在密切对应关系，这反映了进化适应和对环境温度的表型可塑性（Broggi等人，2011年；Gamero等人，2015年；Sándor等人，2021年，2022年）。例如，在城市和温暖的环境中，羽毛密度降低和羽毛结构变得更松散，有助于对流式干热流失（Gamero等人，2015年；Pap等人，2020年）。此外，羽毛颜色，特别是在紫外线范围内，对换羽期间的生理条件非常敏感，皮质酮水平升高和氧化应激与纳米结构完整性的受损及紫外线反射率的降低有关（Lattin等人，2011年；Salmón等人，2023年；Windsor等人，2019年）。这些发现表明，羽毛发育和颜色具有高度的可塑性和对环境压力（尤其是热压力）的响应性，可以在热浪期间促进短期适应。大山雀（Parus major）是研究气候变化下热脆弱性和适应潜力的理想模型。地中海地区的种群表现出接近当前夏季平均最高温度的临界温度，并且具有相对较低的蒸发冷却效率（Cabello-Vergel等人，2024年；Playà-Montmany等人，2021年）。尽管据报道地中海大山雀在热耐受性方面具有一定程度的季节性可塑性（Cabello-Vergel等人，2024年），但尚不清楚这种灵活性是否足以抵消反复的热浪事件，或者生理成本是否会随着连续暴露而累积。我们将人工饲养的大山雀暴露于一系列模拟热浪中，以复制地中海夏季的特征性热极端条件。这项实验设计旨在评估多个功能层面的短期表型可塑性，包括热调节性能、生理稳定性和羽毛发育。具体来说，我们持续监测体温（Tb），根据个体热基线特征化发热反应，并计算了异温指数（HI），该指标量化了相对于正常体温基线的体温变化，作为热调节精度的代理指标（Boyles等人，2011年）。我们还通过测量氧化平衡和羽毛皮质酮浓度（CORTf）来评估生理状态，并通过分析羽毛形态和反射率来评估外部羽毛的微观结构和光谱特征。我们假设反复的亚致死热浪会引发可测量的短期可塑性反应，同时伴随着生理和形态成本。我们预计持续的热应激会损害热调节稳定性，导致正常体温升高和体温调节的变异性增加，这体现在更强烈的热浪期间HI值的升高。我们预期不是发热的均匀增加，而是体温短暂升高的发生和表达的变化，反映了在反复热暴露下热调节控制的精确度改变。我们还预期生理压力会增加，表现为氧化平衡的改变和CORTf水平的升高，这与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的累积激活一致。同时，我们预期羽毛结构会发生变化，包括羽毛和羽枝密度的降低，这可能是为了增强干热流失的补偿性调整或由热引起的发育中断所致。最后，我们预测羽毛颜色会发生变化，特别是紫外线反射率的降低，这是热应激下羽毛发育受损的另一个后果。测试这些预测有助于全面评估鸟类对现实气候极端的脆弱性和适应能力，从而更深入地理解物种对全球变暖的反应机制。
**材料与方法**
所有程序均获得了埃斯特雷马杜拉大学的生物伦理委员会的批准（协议108/2016），并在政府许可证CN0032/18/ACA的指导下进行。我们尽一切努力减少动物痛苦并减少使用的个体数量。
**2.1 捕获、饲养和饲养**
2018年春季，从伊比利亚西南部巴达霍斯附近的五个巢箱中收集了23只7-12天大的大山雀幼鸟（38°56′N，6°56′W）。每只幼鸟都佩戴了一个独特的编码金属环，并被转移到人工巢箱中，在上午8:00到下午10:00之间每2小时人工喂食一次。饲料包括蝇幼虫、黄粉虫和商业昆虫混合物。从离巢到2018年11月分配到实验处理之前，这些鸟被饲养在埃斯特雷马杜拉大学的户外鸟舍中，每组5-6只，性别混合（详见Playà-Montmany等人，2021年）。在此期间，鸟类经历了自然的光周期、温度和湿度，没有人工气候控制或声音衰减，从而确保它们在实验操作开始前暴露于伊比利亚西南部典型的日常和季节性环境变化中。为了增加样本量，还在同一研究区域使用雾网捕获了四只额外的自由生活的离巢幼鸟，并随机将它们引入户外鸟舍（每个鸟舍一只）。
**2.2 实验设计和分配**
2.2.1 重复声明
推理规模
应用感兴趣因子的规模
适当规模下的重复次数
物种
应用于单个鸟类的热浪处理与对照处理
二十七只个体（13只热浪组，14只对照组）
单个鸟类（热调节生理：基于体温的指标，包括HI和发热事件）
连续模拟的热浪（四次热浪；第2-4次热浪的体温数据）
每个个体最多重复测量三次（n=27）
单个鸟类（氧化状态、羽毛皮质酮、体重）
处理组之间的前后配对采样
二十七只个体（n=50 CORTf，n=46 d-ROM，n=44 OXY，n=54 体重）
单个鸟类（羽毛结构和颜色）
处理组之间的前后配对采样
二十七只个体（n=54 毛羽特征测量）
2018年11月，当所有鸟类都达到成熟期时，它们被随机分配到模拟热浪组（n=13；9只雌性和4只雄性）或对照组（n=14；7只雌性和7只雄性）。同性的兄弟姐妹被分配到不同的处理组中，以控制可能的遗传和早期发育效应。然后，大山雀被分别关在气候控制室内的单独笼子里，根据它们被分配的组别进行饲养。每个笼子（40×30×88厘米）内包含一个木制巢箱、栖木和橡木颗粒作为垫料。鸟类可以自由获取水（用于饮用和沐浴），以及由商业昆虫饲料膏、新鲜水果和活的无脊椎动物（如Tenebrio幼虫和/或蝇蛆）组成的混合饮食。所有房间都通过窗户自然采光，确保它们能够暴露在环境光照周期中。
2.3 温度调节和实验操作
两个房间的温度调节都遵循通过可编程气候控制系统实现的预设日温度曲线。在实验操作之前，两组鸟类都处于与2018年11月至2019年6月期间在Badajoz记录的室外温度曲线非常相似的温度环境中。实验性热浪处理从2019年6月持续到7月，包括四个连续的5天热浪，每天的最高温度分别设定为39°C、40°C、41°C和42°C（见图S1）。每次热浪之间有6-10天的间隔（见图S1），在这段时间内，只有实验房间的鸟类被保持在30°C的最高日温度下，以便在每次暴露之间恢复。这些温度曲线旨在反映2017年该地区记录的最大夏季温度范围，那一年是西班牙有记录以来最热的一年，期间发生了五次官方认定的前所未有的热浪（AEMET；http://www.opendata.aemet.es）。相比之下，对照组的鸟类则处于一个较为温和的参考温度环境中，最高温度不超过35°C。这个温度曲线没有超过该种群的热中性区的估计上限临界温度（Cabello-Vergel等人，2024年；Playà-Montmany等人，2021年）。对照组鸟类没有经历恢复期或强制降低最高日温度，因为它们的温度环境没有超出参考条件。空气温度每3分钟使用MicroStation数据记录器（H21-002，Onset Computer Corporation，美国）在每个实验房间的两个位置进行测量：一个位于巢箱内部，另一个位于地面以上2米处。由于这两个位置之间的温度没有显著差异（p > 0.05），因此后续分析使用了平均温度值。相对湿度也在每个实验房间中连续监测，处理组的相对湿度最高达到57.4%，对照组为51.7%。
2.4 生理和形态测量
所有测量（Tb除外，见下文）都在热浪处理之前和之后进行。
2.4.1 体温和体重
体温（Tb）是使用温度敏感的被动集成应答器（PIT标签；BioTherm13，Biomark，美国）测量的，这些应答器按照既定协议（Nicolaus等人，2008年；Oswald等人，2018年）植入肩胛骨之间的皮下。应答器植入在热处理前1周进行，以确保完全恢复。体温的测量精度为±0.1°C，使用连接到IS1001多路复用收发系统（Biomark）的racket天线（F201F-ISO）进行记录。由于可用的天线数量不足以同时测量处理组和对照组的体温，因此体温的监测是依次进行的：在模拟热浪事件期间优先覆盖实验组鸟类，然后在时间错开的期间重新分配给对照组鸟类。这些温度曲线旨在反映2017年该地区记录的最大夏季温度范围，那一年是西班牙有记录以来最热的一年，期间发生了五次官方认定的前所未有的热浪（AEMET；http://www.opendata.aemet.es）。相比之下，对照组鸟类处于一个较为温和的参考温度环境中，最高温度不超过35°C。这个温度曲线没有超过该种群的热中性区的估计上限临界温度（Cabello-Vergel等人，2024年；Playà-Montmany等人，2021年）。对照组鸟类没有经历恢复期或强制降低最高日温度，因为它们的温度环境没有超出参考条件。空气温度每3分钟使用MicroStation数据记录器（H21-002，Onset Computer Corporation，美国）在每个实验房间的两个位置进行测量：一个位于巢箱内部，另一个位于地面以上2米处。由于这两个位置之间的温度没有显著差异（p > 0.05），因此后续分析使用了平均温度值。相对湿度也在每个实验房间中连续监测，处理组的相对湿度最高达到57.4%，对照组为51.7%。
2.4.2 羽毛皮质醇和氧化应激
CORTf作为羽毛生长期间HPA轴活动的综合指标进行测量（Bortolotti等人，2008年；Romero & Fairhurst，2016年）。在实验期之前（6月13日）采集了左翼的第二根三级羽毛样本。允许羽毛重新生长，并在实验期之后（10月11日）再次采样。采集羽毛后，去除羽轴，将羽片和羽干切成<5 mm²的碎片。提取过程是在50°C的HPLC级甲醇中通过超声波处理过夜进行，随后过滤、蒸发并重新溶解在磷酸盐缓冲盐水中。皮质醇通过酶免疫测定法（Enzo Life Sciences，ADI-901-097）进行定量，并以每毫米羽毛的pg表示，结果按羽毛长度进行标准化。测量的 intra- 和 inter-assay 变异系数（CV）分别为9.04% 和 11.76%。作为氧化状态的标志物，我们测量了血浆中的活性氧代谢物（d-ROMs，氧化损伤指数）和总抗氧化能力（OXY，非酶促血浆抗氧化防御指数；Costantini，2011年；Costantini & Dell'Omo，2006年）。2月12日（处理前）和7月29日（处理后）从臂静脉采集20 μL的血液样本，然后离心，血浆储存在-80°C。d-ROMs和OXY通过比色法（Diacron International，意大利）进行测量，吸光度在Biotek PowerWave分光光度计上读取490 nm处。浓度根据标准曲线计算；d-ROMs的 intra- 和 inter-assay CV 分别为9.79% 和 0.93%，OXY的分别为7.08% 和 11.28%。
2.4.3 轮廓羽毛的形态和颜色
轮廓羽毛（左胸，每只鸟5根）从左胸部的中央黑色条纹和肩部之间采集，在实验期之前（6月13日）和之后（10月11日）。所有处理后的样本都是在换羽结束后收集的，以确保羽毛是在实验条件下发育的。羽毛存放在黑暗环境中。对于每只鸟，随机选择两根羽毛进行形态测量。使用Nikon SMZ800立体显微镜（70倍放大，见图S2）按照Stettenheim（2000年）的方法测量羽枝和羽小枝区域的密度。从五根拔下的羽毛中选取三根用于颜色测量。将每只鸟的羽毛小心地放置在类似它们在鸟身上自然排列的方式的哑光卡纸上（即羽毛相互重叠，腹面朝上）。然后在完全黑暗的环境中使用Ocean Optics DH 2000分光光度计获取光谱数据。羽毛反射率在300–700 nm范围内进行量化，遵循鸟类羽毛着色的既定协议（Avilés & Parejo，2013年；Silva等人，2008年）。羽毛颜色通过五个描述符进行总结：（1）亮度，计算为300至700 nm之间的总反射率；（2）紫外线色度，定义为300至400 nm之间反射率的比例；（3）黄红色度，定义为300–700 nm范围内最大反射率的波长；（4）黄红色调，基于570–700 nm范围内最大反射率的波长。
2.5 数据分析
2.5.1 体温
为了评估模拟热浪对体温调节反应的影响，使用广义加性混合模型（GAMMs；mgcv包；Wood，2017年）对体温（Tb）进行了建模。选择GAMMs是因为像体温这样的体温调节变量在昼夜周期内表现出明显的非线性时间动态，这无法通过线性或多项式项很好地捕捉。这种建模框架允许使用数据驱动的平滑函数灵活地估计这种非线性关系，同时通过随机效应考虑个体内的重复测量（Baayen & Linke，2020年；Wood，2017年）。因此，GAMMs特别适合分析时间结构化的生态和生态生理数据（例如Jirinec，2024年；Nordli等人，2023年）。固定效应包括处理组（对照组 vs. 实验组）、热浪事件（第2-4波）及其交互作用。为了捕捉昼夜节律的调节，将一天中的小时（表示为连续的小数变量）作为平滑项包括进来，为每个处理×波组合分别指定，以便灵活估计潜在的非线性昼夜模式。因此，在波与波之间的恢复期间，两组之间的体温记录并非完全并行，这些期间没有包括在比较分析中。由于天线故障，第一次热浪的体温数据不可用。在第一次热浪开始前和最后一次热浪结束后，使用数字秤将体重测量到最接近的0.01克。测量在早晨（08:00 AM）进行，以最小化昼夜和餐后变化。
2.4.2 羽毛皮质醇和氧化应激
CORTf作为羽毛生长期间HPA轴活动的综合指标进行测量（Bortolotti等人，2008年；Romero & Fairhurst，2016年）。在实验期之前（6月13日）采集了左翼的第二根三级羽毛样本。允许羽毛重新生长，并在实验期之后（10月11日）再次采样。测量羽毛后，去除羽轴，并将羽片和羽干切成<5 mm²的碎片。提取过程是在HPLC级甲醇中通过超声波处理过夜进行，随后过滤、蒸发并重新溶解在磷酸盐缓冲盐水中。皮质醇通过酶免疫测定法（Enzo Life Sciences，ADI-901-097）进行定量，并以每毫米羽毛的pg表示，结果按羽毛长度进行标准化。测量的 intra- 和 inter-assay 变异系数（CV）分别为9.04% 和 11.76%。作为氧化状态的标志物，我们量化了血浆中的活性氧代谢物（d-ROMs，氧化损伤指数）和总抗氧化能力（OXY，非酶促血浆抗氧化防御指数；Costantini，2011年；Costantini & Dell'Omo，2006年）。2月12日（处理前）和7月29日（处理后）从臂静脉采集20 μL的血液样本，然后离心，血浆储存在-80°C。d-ROMs和OXY通过比色法（Diacron International，意大利）进行测量，吸光度在Biotek PowerWave分光光度计上读取490 nm处。浓度根据标准曲线计算；d-ROMs的 intra- 和 inter-assay CV 分别为9.79% 和 0.93%，OXY的分别为7.08% 和 11.28%。
2.4.3 轮廓羽毛的形态和颜色
轮廓羽毛（左胸，每只鸟5根）从左胸部的中央黑色条纹和肩部之间采集，在实验期之前（6月13日）和之后（10月11日）。所有处理后的样本都是在换羽结束后收集的，以确保羽毛是在实验条件下发育的。羽毛存放在黑暗环境中。对于每只鸟，随机选择两根羽毛进行形态测量。使用Nikon SMZ800立体显微镜（70倍放大，见图S2）按照Stettenheim（2000年）的方法测量羽枝和羽小枝区域的羽枝和羽小枝的密度。从数字图像中计算羽枝羽小枝的比例。五根拔下的羽毛中有三根用于颜色测量。将每只鸟的羽毛小心地放置在类似于它们在鸟身上自然排列的方式的哑光卡纸上（即羽毛重叠排列，腹面朝上）。然后在完全黑暗的环境中使用Ocean Optics DH 2000分光光度计获取光谱数据。羽毛反射率在300–700 nm范围内进行量化，遵循鸟类羽毛着色的既定协议（Avilés & Parejo，2013年；Silva等人，2008年）。羽毛颜色通过五个描述符进行总结：（1）亮度，计算为300至700 nm之间的总反射率；（2）紫外线色度，定义为300至400 nm之间反射率的比例；（3）黄红色度，定义为570至700 nm范围内最大反射率的波长；（4）黄红色调，基于570–700 nm范围内最大反射率的波长。
2.5 数据分析
2.5.1 体温
为了评估模拟热浪对体温调节反应的影响，使用广义加性混合模型（GAMMs；mgcv包；Wood，2017年）对体温（Tb）进行了建模。选择GAMMs是因为像体温这样的体温调节变量在昼夜周期内表现出明显的非线性时间动态，这无法通过线性或多项式项很好地捕捉。这种建模框架允许使用数据驱动的平滑函数灵活地估计这种非线性关系，同时通过随机效应考虑个体内的重复测量（Baayen & Linke，2020年；Wood，2017年）。因此，GAMMs特别适合分析时间结构化的生态和生态生理数据（例如Jirinec，2024年；Nordli等人，2023年）。固定效应包括处理组（对照组 vs. 实验组）、热浪事件（第2-4波）及其交互作用。为了捕捉昼夜节律的调节，将一天中的小时（表示为连续的小数变量）作为平滑项包括进来，为每个处理×波组合分别指定，以便灵活估计潜在的非线性昼夜模式。平滑项代表一个非参数函数，用于估计一天中时间和体温之间的关系，而不预先假设线性（Wood，2017年）。因此，允许平滑项在处理组和波特定的时间体温轨迹上变化。鸟的身份作为随机截距包括进来，以考虑重复测量。为了考虑连续观察之间的时间自相关，在个体时间序列中包括了第一阶自回归[AR(1)]相关结构，相关结构在每次热浪开始时和超过10分钟的时间间隔后重置，从而避免在不连续段之间的虚假自相关。通过基于AIC的比较评估了对AR(1)的支持，并在AR(1)不改善模型拟合时保留了更简单的结构。这种结构假设随着测量时间间隔的增加而相关性降低，通常用于高分辨率生物时间序列数据的分析（Kane等人，2020年；Socias-Martínez等人，2025年；Wood，2017年）。体温值被聚合到每只鸟的5分钟间隔内，以减少数据冗余和噪声。根据Boyles等人（2011年）的建议，将异常值（<37°C或>45°C；约6%的所有体温记录）从分析中排除，以避免极端或人为数据点的偏差，上限阈值遵循既定的耐热性协议（Cabello-Vergel等人，2022年；O'Connor等人，2021年；Whitfield等人，2015年）。分析限于白天时间（从日出到日落，基于当地时间；参见Jirinec，2024年）。最初考虑将跗骨长度作为协变量，但由于其不显著（p > 0.05）并且降低了模型支持（ΔAIC >4），因此从最终模型中排除。
2.5.2 异温指数
使用HI量化个体体温调节的变异性，HI定义为相对于每个个体正常体温基线（Tbmod）的每小时标准差，遵循Boyles等人（2011年）和Thompson等人（2018年）的定义：其中Tbi代表该小时内的每次体温测量值，Tbmod是个体特定的正常体温（根据清晨活跃阶段的记录，07:00–10:00 AM估计），n是观察次数。因为每次模拟热浪跨越多个连续的日子，HI是在个体小时分辨率上计算的，由个体身份（ID）、日期、一天中的小时、热浪事件（Wave）和处理组合定义。这种方法确保了同一热浪内不同天的体温每小时变异性不会混淆，这特别重要，因为热浪事件具有多天的结构。使用GAMMs分析HI的时间变化，将一天中的小时作为平滑项包括进来，以捕捉异温的昼夜模式，以及处理、波及其交互作用作为固定效应。鸟的身份作为随机效应包括进来，以考虑重复测量。为了考虑连续观察之间的时间自相关，在个体时间序列中包括了第一阶自回归[AR(1)]相关结构，相关结构在每次热浪开始时和超过10分钟的时间间隔后重置，从而避免不连续段之间的虚假自相关。通过基于AIC的比较评估了对AR(1)的支持，并在AR(1)不改善模型拟合时保留了更简单的结构。这种结构假设随着测量时间间隔的增加而相关性降低，通常用于高分辨率生物时间序列数据的分析（Kane等人，2020年；Socias-Martínez等人，2025年；Wood，2017年）。体温值被聚合到每只鸟的5分钟间隔内，以减少数据冗余和噪声。根据Boyles等人（2011年）的建议，将异常值（<37°C或>45°C；约6%的所有体温记录）从分析中排除，以避免极端或人为数据点的偏差，上限阈值遵循既定的耐热性协议（Cabello-Vergel等人，2022年；O'Connor等人，2021年；Whitfield等人，2015年）。分析限于白天时间（从日出到日落，基于当地时间；参见Jirinec，2024年）。最初考虑将跗骨长度作为协变量，但由于其不显著（p > 0.05）并且降低了模型支持（ΔAIC >4），因此从最终模型中排除。
2.5.2 异温指数
个体体温调节的变异性使用HI量化，HI定义为相对于每个个体正常体温基线（Tbmod）的每小时标准差，遵循Boyles等人（2011年）和Thompson等人（2018年）的定义：其中Tbi代表该小时内的每次体温测量值，Tbmod是个体特定的正常体温（根据清晨活跃阶段的记录，07:00–10:00 AM估计），n是观察次数。因为每次模拟热浪跨越多个连续的日子，HI是在个体小时分辨率上计算的，由个体身份（ID）、日期、一天中的小时、热浪事件（Wave）和处理组合定义。这种方法确保了同一热浪内不同天的每小时体温变异性不会混淆，这特别重要，因为热浪事件具有多天的结构。使用GAMMs分析HI的时间变化，将一天中的小时作为平滑项包括进来，以捕捉异温的昼夜模式，以及处理、波及其交互作用作为固定效应。鸟的身份作为随机效应包括进来，使用AR(1)相关结构来考虑个体内的时间自相关。
2.5.3 高热的发生和表达
为了识别体温接近潜在危险水平的事件，在个体小时级别定义了高热事件。具体来说，当该小时内的最大体温超过个体特定的阈值（Threshold = Tbmod + HI）时，将个体小时间隔分类为高热。因此，每个个体小时间隔被赋予一个二元结果（1 = 高热，0 = 正常体温）。因为这个定义基于小时内的最大值，所以该指标对小时内短暂升高的体温敏感。此外，我们使用一个固定阈值（Tb ≥ 43°C）量化了绝对高热的发生，这代表了在大山雀中高于正常体温的生理意义上的升高，同时保持在接近临界限值以下（Cabello-Vergel等人，2024年）。高热在两个互补的层面上进行分析。首先，我们量化了在给定个体小时间隔内发生高热事件的概率。这项分析使用带有logit链接的二项GAMM进行。固定效应包括处理、波及其交互作用；一天中的小时作为平滑项，为每个处理×波组合分别指定。鸟的身份作为随机截距包括进来，以考虑重复测量。时间自相关使用上述方法一致处理，仅在模型比较支持时保留AR(1)结构。这项分析使用了个体特定的阈值（相对高热发生）和固定阈值（绝对高热发生）进行。其次，在高热发生的条件下，我们检查了高热在小时内的表达强度。具体来说，对于至少发生一次高热观察的个体小时间隔，我们量化了高热观察相对于该小时内总体温测量次数的比例。这项分析使我们能够评估当高热发生时，其在小时内的表达是否在不同处理之间有所不同。高热观察的比例被建模为二项响应，处理、波及其交互作用作为固定效应，一天中的小时作为处理×波特定的平滑项。这种公式考虑了响应的有界性质（0–1）和每小时体温观察次数的变化。ID作为随机截距包括进来。为了考虑环境温度条件，并同时最小化与一天中时间的共线性，平均每小时温度（Ta）被作为残差协变量包含在每个数据波中，从而在最小化与昼夜时间的共线性的同时，分离出每个数据波内的温度变化。时间自相关性是使用上述方法一致处理的。
2.5.4 体重
体重变化使用线性混合效应模型（LMMs；lme4包；Bates等人，2015年）进行分析，时间（处理前与处理后）、处理方式及其交互作用作为固定效应，鸟类身份作为随机截距。
2.5.5 羽毛皮质酮（CORTf）和氧化应激
CORTf和氧化应激指标（d-ROMs和OXY）分别使用LMMs进行分析，时间、处理方式及其交互作用作为固定效应，鸟类身份作为随机截距。
2.5.6 羽毛形态和颜色
使用适合变量分布的混合效应模型分析处理方式对羽毛结构和颜色特征的影响。正态分布的特征使用LMMs分析，而非正态变量（羽枝和羽小枝密度）则通过Gamma误差分布使用广义线性混合效应模型（GLMMs）进行建模。比例数据通过Beta分布使用GLMMs分析。所有模型都包括时间、处理方式及其交互作用作为固定效应，鸟类身份作为随机效应。使用Tukey调整的p值通过‘emmeans’包（Lenth，2023年）进行事后成对比较，以便在适当的情况下解释显著的交互效应。使用rptR包（Stoffel等人，2017年）估计处理前和处理后测量结果的重复性（类内相关系数）。羽毛特征的重复性通常很高（R = 0.36–0.72，p < 0.05，在热浪之前；R = 0.44–0.76，p < 0.05，在热浪之后），除了暴露前的羽毛面积（R = 0.24，p = 0.11）。颜色特征的重复性为中等到高（R = 0.15–0.82，p < 0.001，在热浪之前；R = 0.28–0.82，p < 0.05，在热浪之后；见表S1）。为了总结羽毛颜色特征的多元变化，我们对五个标准化光谱变量进行了主成分分析（PCA；表S2）：亮度（300至700纳米的总反射率）、紫外线（300–400纳米）和黄-红（570–700纳米）范围内的色度和色调，以及一个综合色调指数（HUE）。PC1和PC2得分使用LMMs进行分析，时间（处理前与处理后）、处理方式及其交互作用作为固定效应。鸟类身份作为随机效应包括在内。所有统计分析均使用R版本4.4.2（R Core Team，2024年；www.r-project.org）进行。模型残差被检查是否具有正态性和同方差性。所有报告的p值都是双尾的，统计显著性设定为α = 0.05。
3 结果
3.1 体温
实验鸟类在模拟的热浪事件中保持了显著更高的体温（Δ = 0.20°C；表1；表S3；图1a），表明在反复的热暴露下平均体温有轻微但一致的升高。体温在不同热浪事件中也存在显著差异，第3波和第4波的平均值相对于第2波更高。处理方式对体温的影响受到热浪强度的有限调节，在第3波检测到显著的处理方式×波的交互作用，但在第4波没有（表1）。昼夜体温模式在所有处理方式×波的组合中表现出明显且高度显著的非线性变化（表1），表明体温调节反应有强烈的昼夜调节。表1. 描述了大山雀对模拟热浪的体温调节反应的广义加性混合模型（GAMM）结果，包括体温（Tb）、异温性指数（HI）和高温（被分类为高温的个别小时间隔）。固定效应是处理方式（对照组与实验组）、热浪强度（第2至4波）及其交互作用。昼夜变化使用平滑函数建模，这些函数是根据每个处理方式-波的组合分别拟合的。模型包括个体身份（ID）的随机截距；参考水平是对照组和第2波。估计值、标准误差（SE）、检验统计量和p值被报告（高斯模型的t和F；二项模型的z和Χ2）。
3.1 体温
实验鸟类在模拟的热浪事件中保持了显著更高的体温（Δ = 0.20°C；表1；表S3；图1a），表明在反复的热暴露下平均体温有轻微但一致的升高。体温在不同热浪事件中也存在显著差异，第3波和第4波的平均值相对于第2波更高。处理方式对体温的影响受到热浪强度的有限调节，在第3波检测到显著的处理方式×波的交互作用，但在第4波没有（表1）。昼夜体温模式在所有处理方式×波的组合中表现出明显且高度显著的非线性变化（表1），表明体温调节反应有强烈的昼夜调节。
3.2 异温性指数
异温性指数（HI）在不同处理组之间没有显著差异，这由处理方式的主效应不显著以及处理方式×波的交互作用不存在所表明（表1；表S3）。相比之下，异温性指数在连续的热浪事件中存在显著差异，第3波和第4波的值相对于第2波更高（表1）。尽管其强度和统计支持在不同热浪和处理方式-波的组合中有所不同，但昼夜变化被检测到（表1）。在第3波中，两种处理组的昼夜变化都表现出明显的非线性模式（表1），表明体温调节反应有强烈的昼夜调节。
3.3 高温的发生
使用个体特定的阈值（相对高温发生），一个小时间隔被分类为高温的概率在不同模拟的热浪中有所不同，并且以处理方式特定的方式依赖于处理方式（表1；图1c）。总体而言，处理组之间的差异没有通过处理方式的主效应得到支持；相反，在最强烈的热浪（第4波）中出现了强烈的处理方式×波的交互作用（表1）。在第2波中，对照组和实验组的鸟类的高温概率大致相似（69.3% vs 60.2%），这种差异在第3波中仍然较小（76.2% vs 71.0%）。相比之下，在第4波中，对照组鸟类的高温概率显著增加，几乎有4个小时处于高温状态（79.5%），而实验组鸟类的高温时间不到三分之二（58.5%；表1）。高温发生的昼夜调节在不同热浪和处理方式-波的组合中有所不同（表1）。在实验组鸟类中，第2波和第3波检测到强烈的昼夜变化，而在第4波中没有明显的昼夜模式。相比之下，对照组鸟类在第2波中表现出弱或没有昼夜调节，在第3波中昼夜变化微弱，在第4波中昼夜变化显著（图1c）。当使用固定阈值（绝对高温发生；Tb ≥ 43°C）定义高温时，没有检测到处理方式、波或其交互作用的显著效应（p > 0.05；表1）。尽管实验组鸟类在不同热浪中的高温概率倾向于更高，但这些差异没有得到统计支持。高温发生的昼夜调节在不同热浪和处理方式中有所不同，在对照组鸟类中第2波和第3波检测到明显的昼夜模式，而在实验组鸟类中第3波也是如此，通常在中午时分达到峰值，而在第4波中两种处理组都没有明显的昼夜变化（表1）。因此，当使用个体特定的阈值（相对高温发生）评估高温时，处理组之间的差异并不明显。
3.4 高温的表达
当将分析限制在发生高温的小时内时，不同处理方式之间以及在不同模拟的热浪中，高温的表达也有所不同（表S4；图1d）。总体而言，实验组鸟类在一个小时内的高温观察比例低于对照组鸟类，表明一旦发生高温，其表达较弱（表S4）。这种处理组差异在第2波最为明显，当时对照组鸟类在一个小时内的高温观察占61.3%，而实验组鸟类仅为43.9%。在第3波中，两种处理组的高温表达相似（对照组为53.5%，实验组为55.9%），而在第4波中，处理组再次显著分化，对照组鸟类的高温表达达到64.5%，而实验组鸟类仅为33.1%（表S4）。此外，无论处理方式如何，较高的体温（Ta）都与一个小时内的更高比例的高温观察相关（表S4）。
3.5 体重
在实验过程中，体重显著下降，对照组和热浪处理组的个体平均减少了3%。这种下降与处理组无关，因为处理方式的主效应和时间×处理的交互作用都没有统计学意义（表2；表S5）。表2. 线性混合效应模型（LMM）结果描述了作为处理组（对照组和实验组）、时间点（处理前与处理后）及其交互作用的函数的身体重量变化。模型包括个体的随机截距。报告了估计值、标准误差（SE）、自由度（DF）、t值和p值。效应
估计值
标准误差
自由度
t值
p值
截距
16.57
0.36
26.97
46.55
<0.01
TimeAfter
−0.45
0.14
25.00
−3.25
<0.01
TreatmentE
−0.1
0.51
26.97
−0.19
0.85
TimeAfter:TreatmentE
−0.01
0.2
25.00
−0.02
0.98
观测数量（n）
54
注：粗体值表示p值<0.05时的显著效应。
3.6 羽毛皮质酮和氧化状态
CORTf在不同处理组或采样时间之间没有显著差异（表3；表S5）。未检测到主要效应或交互作用。CORTf的平均值范围为6.92至36.5 pg mm−1，在所有条件下都存在显著的个体间变异。表3. 线性混合效应模型（LMM）结果描述了羽毛皮质酮浓度（CORTf）随时间（Before, After）、处理组（Control, Experimental）及其交互作用的变化。该模型包括一个个体（ID）的随机截距。
羽毛皮质酮浓度（CORTf）
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
截距
18.85
1.75
10.77
37.9
<0.01
TimeAfter
0.83
1.85
0.45
22.85
0.66
TreatmentE
3.37
2.48
1.36
37.9
0.18
TimeAfter:TreatmentE
−4.45
2.61
−1.7
22.85
0.10
观测数量（n）
50
4. 反应性氧代谢物（d-ROMs）
截距
175.99
17.6
10
40.36
<0.01
TimeAfter
16.54
22.24
0.74
21
TreatmentE
−31.68
26.7
−1.19
40.36
TimeAfter:TreatmentE
75.7
33.73
2.24
21
抗氧化能力（OXY）
截距
252.12
15.5
16.27
26.78
<0.01
TimeAfter
−26.43
11.95
−2.21
20
TreatmentE
9.82
24.23
0.41
26.78
TimeAfter:TreatmentE
−26.71
18.68
−1.43
注：粗体值表示p值<0.05时的显著效应。使用d-ROMs评估的氧化损伤显示了时间×处理的显著交互作用（表3）。暴露于模拟热浪的鸟类在处理后d-ROMs显著增加（64.6%），而对照组鸟类仅显示出轻微变化（9.7%）（图2）。相比之下，OXY在两组中都随时间显著下降（表3；表S5）。对照组下降了10.3%，实验组下降了20.2%，但时间×处理的交互作用不存在，表明这种下降与热浪暴露无关。
3.7 羽毛结构和着色
诱导的热浪暴露导致轮廓羽毛的微观结构发生显著变化。时间×处理的交互作用对羽枝和羽小枝的长度和密度有显著影响（表4；表S5）。在实验鸟类中，羽枝的长度分别减少了24.7%，羽小枝的长度减少了27.3%，而羽小枝的密度在羽枝区域减少了15.5%，在羽状区域减少了21.2%（图3）。未检测到处理效应或交互作用对总羽毛长度、羽毛面积、羽毛区域的比例或羽枝比例的影响（表4）。表4. 用于评估大山雀轮廓羽毛结构变化的混合效应模型总结。线性混合效应模型（LMMs）用于羽毛长度特征；广义线性混合效应模型（GLMMs）与Gamma分布用于羽枝和羽小枝密度；GLMM与Beta分布用于羽枝比例。所有模型都包括时间（Before, After）、处理（Control, Experimental）及其交互作用的固定效应，以及个体的随机截距。报告了估计值、标准误差（SE）、检验统计量（Stat）和p值。
羽枝长度
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽小枝长度区域
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽状羽枝长度区域
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽毛长度
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽毛面积
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽枝密度（每毫米）
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽小枝密度（每毫米）
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽小枝密度（每0.1毫米）
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
羽枝比例（%）
估计值
标准误差
t值
自由度
p值
注：LMMs通过t统计量进行评估，自由度使用Satterthwaite近似。GLMMs通过最大似然法拟合并通过z统计量进行评估。Gamma分布应用于正偏态密度变量。Beta分布用于羽枝比例（%），这是一个有界连续变量。所有模型都包括个体身份的随机截距。n=54。粗体值表示p值<0.05时的显著效应。图3显示了热暴露前后大山雀的反应性氧代谢物（d-ROMs）分布。箱形图显示了中位数和四分位数范围，数据范围用须表示，个别观察结果以点显示。对照组（C，蓝色）和实验组（E，橙色）在热暴露前后进行了测量。
4. 讨论
通过结合物种热生理学的多个方面，可以更好地评估它们对极端热事件的脆弱性。我们的发现表明，反复暴露于模拟热浪会引发快速但代价高昂的体温调节和皮肤调整，但这并没有导致地中海大山雀出现明显的体温调节失败。暴露于热浪的个体表现出持续升高的平均体温（Tb），日间体温调节的情境依赖性变化以及夏季换羽后的羽毛微观结构显著变化。尽管这些反应表明了短期的适应性可塑性，但它们伴随着氧化损伤的增加和羽毛着色的改变，突显了即时生理灵活性与维持功能稳态之间的权衡。总体而言，我们的结果强调了小型鸣禽在应对反复热浪的累积影响方面的表型可塑性的内在限制。
4.1 在反复热应力下的短期可塑性
我们的实验热浪协议导致暴露于热浪的鸟类的体温（Tb）出现了适度但一致的提升。尽管这种增加的幅度很小，但它在整个热浪暴露期间持续存在，并且没有随着连续事件而加剧，这表明这是一种受调控的体温调节调整，而不是体温稳态的逐渐崩溃。使用皮下植入的PIT标签测量体温（Tb），这些标签已被证明能够准确反映小型鸟类的核心体温（O'Connor等人，2021；Oswald等人，2018），但仍代表了一个受核心和周围温度影响的综合信号。热诱导的外周血管扩张是一种公认的促进鸟类散热的机制（McKechnie & Wolf，2010；Soravia等人，2022），可能有助于观察到的体温升高，这意味着实际的核心体温升高可能比记录的值要小。这种模式更符合一种受调控的、适度的体温升高，与兼性高热的机制相一致。这种策略在干旱地区的鸟类中已有充分记录，它通过调节Tb–Ta梯度来减少蒸发水分损失：当Ta超过Tb时最小化热量吸收，当Tb超过Ta时改善干热散失（McKechnie & Wolf，2010；Tieleman & Williams，1999）。由于Tb整合了内源性热量产生和环境热量负荷（Boyles等人，2011；Muñoz-Garcia等人，2014），这里观察到的持续升高可能反映了积极的体温生理反应，而不是被动的热失稳。值得注意的是，尽管平均体温有所上升，但在最强烈的热浪期间，日节律性在很大程度上得以保持，表明时间调节得以保留，而不是昼夜节律的破坏。类似的反应也在适应沙漠的物种（如白眉麻雀织布鸟（Smit等人，2013）和暴露于慢性热的热带食虫鸟类（Jirinec，2024）中有所报告，这进一步证实了兼性高热是应对极端热量的关键策略。
4.2 变温性和体温调节精度的时间变化
Tb调节的可变性和时间结构的变化是显而易见的，这一点通过HI和高温症动态得到了体现。尽管处理组之间的平均HI没有差异，但从第二波到第四波HI有所增加，表明Tb在一天内的分散度增加。这种增加与实验处理无关，因此反映了与实验热暴露无关的时间效应。日间HI的调节是情境依赖的，在某些但不是所有处理-波组合中检测到了显著的非线性模式。特别是，在第二波期间对照组鸟类的日间调节较弱或不存在，在第四波期间实验鸟类中不存在。然而，后期波次中平均HI的增加反映了Tb围绕个体正常体温设定点的更广泛分散，而不是昼夜组织的崩溃。重要的是，这些变化尽管平均体温只有适度增加，但在两个处理组中都观察到了，表明HI的增加不能归因于实验热暴露。这种变温性的增加与随着时间的推移体温调节精度的降低是一致的，即使时间结构部分得以保留，也不能仅通过平均体温的变化来解释。在这个框架内，变温性和选择性高体温可以被视为一个动态连续体的组成部分，其中最初的适应性调整可能会随着热挑战的累积而产生越来越高的生理成本（Boyles等人，2011年；McKechnie等人，2023年）。在类似的环境挑战下，白眉麻雀织布鸟也表现出变温性的增加（Smit等人，2013年）。因此，本研究中HI（高体温）随时间的增加表明体温调节精度的逐渐下降，这与实验处理无关。更广泛地说，这种模式可能与一般的生理限制或内部或环境的变化一致，可能涉及氧化失衡、细胞压力或生理缓冲能力下降等过程，正如先前的研究所建议的（Hensley等人，2024年；Nilsson等人，2016年）。
4.3 高体温的发生和表达
改变的体温调节控制的生理后果在离散的高体温事件动态中得到了进一步证实。尽管保持了较高的平均体温（Tb），但暴露在高温下的鸟类超过个体化高体温阈值的概率低于对照组鸟类，尤其是在最强烈的第4波热浪期间。高体温被定义为体温短暂升高超过个体化阈值（Tbmod + HI），因此超过阈值反映了个体正常体温设定点的偏离，而不仅仅是体温的升高。在这个框架内，高体温概率的降低并不意味着热负荷的减少，而是围绕已经升高的设定点的短期偏差减少。重要的是，当使用固定阈值（Tb ≥ 43°C）定义高体温时，处理组之间高体温发生的差异不再明显，这表明在个体化阈值下观察到的模式反映了相对于个体体温设定点的调节，而不是绝对热风险的差异。在后续的热浪中，对照组鸟类的高体温概率表现出明显的昼夜变化，而暴露在高温下的鸟类则显示出相对平坦的昼夜变化。因为高体温事件是根据体温（Tb）相对于个体化阈值的小时最大值来识别的，所以概率估计对可能由活动增加（如进食或移动）引起的短暂体温升高敏感。高体温事件通常在一天中较温暖的时间达到峰值，这表明高体温概率整合了环境热负荷和短期生理或行为波动。与这一解释一致，先前的研究表明，反复的热挑战可以改变调节后的体温和短期热偏差之间的平衡，揭示了体温调节精度的情境依赖性限制，而不仅仅是简单的稳态丧失（Smith等人，2015年；Tapper等人，2020年；van Jaarsveld等人，2021年）。因此，对照组鸟类中更强的昼夜波动可以通过围绕较低模式设定点的体温短期变化来更简洁地解释，这可能与昼夜活动模式有关，而不是体温调节能力本身的损害。相比之下，暴露在高温下的鸟类较平坦的昼夜变化可能反映了行为调整，例如全天活动量的减少或重新分配，尽管在这项研究中没有直接量化活动量，因此无法明确测试这一机制。重要的是，通过对高体温表达的补充分析加强了这一解释。当分析仅限于高体温发生的小时时，暴露在高温下的鸟类在一个小时内表现出较低的高体温观察比例，尤其是在第2波和第4波热浪期间。因此，处理相关的差异主要体现在高体温状态的强度和持续时间上，而不是跨越高体温阈值的可能性上。平均体温的升高、HI的增加、情境依赖的高体温概率以及暴露在高温下的鸟类小时内高体温表达的减少共同表明，体温调节控制发生了重组，限制了围绕升高设定点的短期体温变化，而不仅仅是简单的稳态丧失。这种模式表明，个体可能更接近于体温的上限，尽管没有检测到绝对高体温发生的显著差异。从生态学的角度来看，这些发现强调，不能仅从平均体温推断出对极端高温的脆弱性，而是由热浪变得更加频繁和强烈时，体温设定点、日内变化和行为背景之间的相互作用所决定的（Cabello-Vergel等人，2022年；Gerson等人，2019年；McKechnie等人，2023年）。
4.4 反复热暴露的生理后果
尽管在实验期间体重显著下降，但处理效应的缺失表明模拟的热浪并没有给暴露在高温下的鸟类带来额外的净能量成本。这一模式与适应沙漠环境的物种（如斑胸草雀（Taeniopygia guttata）的研究一致，在这些物种中，长时间暴露在高温下引起的体温调节或水分失调最小（Cooper等人，2020年）。在我们的研究中，持续的食物和水源供应，加上间歇性的热缓解期，可能有助于部分恢复体重，正如Jacky winters（Microeca fascinans）在经历间歇性热应激时所报告的（Sharpe等人，2019年）。这些结果表明，在资源不受限制的实验条件下，大山雀能够在急性热暴露期间缓冲短期体重损失。处理效应的缺失可能反映了鸟类在热浪间隔期间恢复水分和能量预算的能力，这些间隔期的温度适度升高但不会致命，而不是表明内在的生理灵活性增强。与我们的预期相反，CORTf（皮质醇）浓度在处理组之间保持稳定，这表明在羽毛生长期间没有持续的HPA轴激活或有效的内分泌缓冲。鉴于CORTf反映了羽毛生长期间的累积糖皮质激素分泌（Bortolotti等人，2008年；Romero & Fairhurst，2016年），并且考虑到大山雀的尾羽大约需要30天才能完全再生（Brodin & Watson，2023年），20天的热浪暴露可能与羽毛生长期有相当大的重叠。然而，如果皮质酮的升高是短暂的、间歇性的或与活跃的角蛋白沉积时期时间不对齐（这可能是由于热浪结束后羽毛才开始生长），它们可能没有可靠地整合到羽毛组织中（Strochlic & Romero，2008年）。这种解释与关于鸟类对慢性或亚致死热应激的糖皮质激素反应减弱或短暂的报告一致（Moagi等人，2021年；Nhlapo等人，2025年；Xie等人，2017年），表明在长时间热暴露下存在一定程度的内分泌韧性。然而，实验鸟类中CORTf稳定与氧化应激增加之间的明显不匹配加强了越来越多的证据，表明糖皮质激素水平本身可能无法完全捕捉到生理紊乱的全部程度（Costantini等人，2011年；Lattin等人，2011年），特别是当应激因素是持续但亚致死的。另一方面，暴露在高温下的鸟类较平坦的昼夜变化可能反映了行为调整，例如全天活动量的减少或重新分配，这叠加在升高的体温设定点上，尽管在这项研究中没有直接量化活动量，因此无法明确测试这一机制。至关重要的是，这种解释通过高体温表达的补充分析得到了加强。当分析仅限于高体温发生的小时时，暴露在高温下的鸟类在一个小时内表现出较低的高体温观察比例，尤其是在第2波和第4波热浪期间。因此，处理相关的差异主要体现在高体温状态的强度和持续时间上，而不是跨越高体温阈值的可能性上。总的来说，暴露在高温下的鸟类平均体温的升高、HI的增加、情境依赖的高体温概率以及小时内高体温表达的减少表明，体温调节控制发生了重组，限制了围绕升高设定点的短期体温变化，而不仅仅是简单的稳态丧失。这种模式表明，个体可能更接近于体温的上限，尽管没有检测到绝对高体温发生的显著差异。从生态学的角度来看，这些发现强调，对极端高温的脆弱性不能仅从平均体温推断出来，而是由热浪变得更加频繁和强烈时，体温设定点、日内变化和行为背景之间的相互作用所决定的（Cabello-Vergel等人，2022年；Gerson等人，2019年；McKechnie等人，2023年）。
4.4 反复热暴露的生理后果
尽管在实验期间体重显著下降，但处理效应的缺失表明模拟的热浪并没有给暴露在高温下的鸟类带来额外的净能量成本。这一模式与适应沙漠环境的物种（如斑胸草雀（Taeniopygia guttata）的研究一致，在这些物种中，长时间暴露在高温下引起的体温调节或水分失调最小（Cooper等人，2020年）。在我们的研究中，持续的食物和水源供应，加上间歇性的热缓解期，可能有助于部分恢复体重，正如Jacky winters（Microeca fascinans）在经历间歇性热应激时所报告的（Sharpe等人，2019年）。这些结果表明，在资源不受限制的实验条件下，大山雀能够在急性热暴露期间缓冲短期体重损失。处理效应的缺失可能反映了鸟类在热浪间隔期间恢复水分和能量预算的能力，这些间隔期的温度适度升高但不会致命，而不是表明内在的生理灵活性增强。与我们的预期相反，CORTf（皮质醇）浓度在处理组之间保持稳定，这表明在羽毛合成期间没有持续的HPA轴激活或有效的内分泌缓冲。鉴于CORTf反映了羽毛生长期间的累积糖皮质激素分泌（Bortolotti等人，2008年；Romero & Fairhurst，2016年），并且考虑到大山雀的尾羽大约需要30天才能完全再生（Brodin & Watson，2023年），20天的热浪暴露可能与羽毛生长期有相当大的重叠。然而，如果皮质酮的升高是短暂的、间歇性的或与活跃的角蛋白沉积时期时间不对齐（这可能是由于热浪结束后羽毛才开始生长），它们可能没有可靠地整合到羽毛组织中（Strochlic & Romero，2008年）。这种解释与关于鸟类对慢性或亚致死热应激的糖皮质激素反应减弱或短暂的报告一致（Moagi等人，2021年；Nhlapo等人，2025年；Xie等人，2017年），表明在长时间热暴露下存在一定程度的内分泌韧性。然而，实验鸟类中CORTf稳定与氧化应激增加之间的明显不匹配加强了越来越多的证据，表明糖皮质激素水平本身可能无法完全捕捉到生理紊乱的全部程度（Costantini等人，2011年；Lattin等人，2011年），特别是当应激因素是持续但亚致死的。另一方面，氧化系统对反复的热暴露反应敏感。暴露在高温下的鸟类显示出d-ROMs（脱氧核糖核酸）的显著增加，而总OXY（氧自由基）在两组中都减少了，实验个体的减少更为明显。这些模式与变温脊椎动物的研究结果一致，其中热应激通过提高代谢率和线粒体ROS（活性氧）的过度产生促进了系统性的氧化还原失衡（Zhang等人，2023年）。然而，一些研究没有报告鸟类在中等程度热暴露下的显著氧化效应（Jimenez等人，2020年），并且即使在没有热应激的情况下，氧化成本也与生理可塑性相关（Burraco等人，2022年）。观察到的CORTf与氧化损伤之间的解耦支持了这样的观点，即氧化还原失衡可以独立于持续的糖皮质激素升高而产生，特别是当体温调节调整（如体温升高或羽毛结构变化）直接促进ROS产生时（Beaulieu & Costantini，2014年）。重要的是，我们对抗氧化防御的评估仅限于非酶促抗氧化能力（OXY），我们没有量化特定抗氧化酶的活性。因此，这里观察到的持续氧化失调反映了ROS产生与非酶促抗氧化防御之间的不匹配，而不是抗氧化系统的普遍失败。因此，酶促抗氧化反应在幅度或时间上可能有所不同，应在未来的研究中结合抗氧化系统的两个组成部分进行探讨。在诸如产蛋鸡和鹌鹑等鸟类中也报告了类似的持续氧化失衡模式，其中氧化损伤与有限的或不足的抗氧化补偿同时增加（Lin等人，2008年；Sahin等人，2003年）。这表明氧化失衡可能代表了限制地中海鸣禽热适应能力的重要生理限制。总的来说，这些发现强调了内分泌稳定性并不一定确保氧化还原稳态，强调了在极端热条件下评估亚致死生理紊乱时需要综合的多系统框架。
4.5 生态和进化意义
此外，夏季换羽后重新生长的轮廓羽毛对模拟热浪表现出明显的敏感性，羽枝和羽小枝的密度显著减少，这与热诱导的发育限制一致。羽毛密度和羽小枝的精细结构与隔热性能和体温调节功能密切相关（Barve等人，2021年；Broggi等人，2011年；Pap等人，2020年），它们在暴露在高温下的鸟类中的减少表明，换羽期间的体温升高可能会改变角蛋白沉积或毛囊分化。在城市大山雀中也报告了类似的羽毛结构完整性下降，其中升高的温度和资源可用性的变化共同限制了羽毛质量（Sándor等人，2021年，2022年）。虽然减少的羽枝密度通常被解释为隔热方面的成本，但它也可能通过增加皮肤附近的气流来促进对流散热（Butler等人，2008年；Nord & Nilsson，2019年；Wolf & Walsberg，2000年），可能反映了热塑性调整。特别是，总羽毛长度或面积的变化表明，热应激选择性地改变了微观结构特征，这与资源充足情况下的能量限制无关。同时，暴露在热浪下的鸟类表现出羽毛反射率的变化，PC1得分较高，对应于更亮且更偏向紫外线的羽毛，与对照组相比。重要的是，PC1捕捉了亮度和光谱位置的多元变化，并不在此被解释为个体质量的指标。尽管两组中黄色-红色和紫外线波长（PC2）之间的色差随时间减少，但在实验个体中，无论是在处理前还是处理后测量中，它始终较高。与我们最初预期的热应激下紫外线反射率降低相反，羽毛反而变得更亮且更偏向紫外线。这种模式与热诱导的羽毛纳米结构修改一致，这些修改是结构着色的基础（Hausmann等人，2003年；Shawkey & Hill，2005年；Windsor等人，2019年），但其功能意义尚未解决。因此，任何潜在的紫外线反射率增加在减少热负荷或水分损失方面的作用应被视为未来工作的假设，而不是已证明的适应性反应。鉴于腹侧羽毛在隔热和视觉交流中的双重作用（Pap等人，2020年；Stettenheim，2000年），热诱导的羽毛结构和颜色变化可能具有生理和生态后果，包括对信号效率的潜在影响（Rogalla等人，2022年）。这些发现强调了羽毛颜色作为热敏感特征的重要性，揭示了在未来气候变暖情景下鸟类的额外脆弱性。
5 结论
总之，我们的研究强调了短期生理和形态可塑性在缓冲反复热应激累积效应方面的局限性。大山雀表现出选择性的体温调节调整，包括体温的持续升高、体温调节的时间组织改变以及在更强烈的热浪期间日内热变化的增加，反映了体温控制的精度降低，而不是稳态的完全崩溃。此外，对高体温动态的分析表明，暴露在高温下的鸟类相对于其个体体温设定点减少了高体温的发生和表达，但在使用固定阈值评估时并没有表现出对高绝对体温的暴露减少，表明体温调节精度与绝对热风险之间的解耦。热暴露还引起了羽毛微观结构和羽毛颜色的显著变化，表明换羽期间的热挑战可以限制隔热效率和视觉信号。这些表型变化伴随着显著的氧化失衡，强调了与反复的亚致死热浪相关的生理成本。总体而言，我们的发现表明，表型灵活性可以促进短期应对热极端，但在反复的热应激下可能不足以完全保持功能稳态。随着气候变化下热浪频率和强度的增加，评估鸟类脆弱性的预测框架应整合物种特定的生理阈值、情境依赖的灵活性及其对绝对热安全边际的后果，以及潜在的长期适应性或跨生态梯度的累积效应。
作者贡献
José A. Masero构思了想法，监督了项目并获得了资金；José A. Masero和Auxiliadora Villegas设计了方法论；José A. Masero、Auxiliadora Villegas、Erick González-Medina、Julián Cabello-Vergel和Núria Playà-Montmany收集了数据；Erick González-Medina进行了正式分析；José A. Masero、Auxiliadora Villegas、Erick González-Medina、Julián Cabello-Vergel、Marta Precioso、Núria Playà-Montmany和Deseada Parejo撰写并修订了手稿。所有作者都对草稿的撰写做出了重要贡献，并最终批准了论文的发表。致谢：
我们感谢Jose Abad以及埃斯特雷马杜拉自治区政府（Junta de Extremadura）的许可。作者们还要感谢西班牙国家气象局（AEMET）提供的气候数据。同时，作者们也承认使用了基于人工智能的写作辅助工具ChatGPT和Writefull来提升手稿的清晰度和语法表达。这些工具的使用符合英国生态学会关于人工智能使用的编辑政策。
**资金信息**：
本研究得到了埃斯特雷马杜拉自治区政府（Junta de Extremadura）项目IB16183和IB18089以及欧洲区域发展基金（European Regional Development Fund）的支持，并获得了由MICIU/AEI/10.13039/501100011033资助的PID2023-150880NB-I00项目的支持。J.C.-V.、M.P.和E.G.-M.的研究工作得到了由西班牙科学、创新与大学部（Ministry of Science, Innovation and Universities）及埃斯特雷马杜拉自治区政府共同资助的生物多样性补充计划（Complementary Plan for Biodiversity）的支持，该计划资金来源于欧盟的NextGenerationEU计划（PRTR-C17.I1）。N.P.-M.的研究工作则得到了埃斯特雷马杜拉自治区政府和欧洲社会基金（European Social Fund）提供的博士前奖学金（PD16099）的支持。
**利益冲突声明**：
作者声明，在本文的发表过程中不存在任何利益冲突。
**数据可用性声明**：
支持这些研究结果的数据可在Zenodo平台上获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.17176776（González-Medina等人，2026年）。
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