摘要
电压门控钠通道NaV1.7是人类遗传学中确定的疼痛靶点，许多化合物已被开发出来用于抑制NaV1.7，但由于其心血管副作用，在临床试验中效果不佳。由于最近的一些研究表明，在啮齿动物脊髓背角中药物抑制NaV1.7可以缓解疼痛，我们试图更好地了解人类脊髓中NaV1.7的表达情况。我们发现，NaV1.7 mRNA在人类脊髓背角的假定投射神经元（NK1R+、GPR83+）中表达，主要位于I层和II层，以及深背角神经元中。NaV1.7 mRNA也在交感神经和副交感神经的前节神经元、腹角的运动神经元以及中央管内衬的室管膜细胞中被检测到。NaV1.7蛋白主要存在于终止于I层至II层的感官神经元的中央轴突中，并部分与突触前标记物（如Bassoon和CGRP）共定位。在突触后，NaV1.7蛋白可以在运动神经元的细胞体中检测到，但由于突触前信号的丰富，其在背角神经元中的检测较为困难。然而，在一些驻留的背角神经元的轴突起始段以及进入前连合的轴突中也检测到了NaV1.7蛋白。鉴于投射神经元在将痛觉信息从背角传递到大脑中起着关键作用，这些数据支持了背角NaV1.7的表达可能在具有SCN9A基因突变的人类疼痛表型中起着未被充分认识的作用。
1 引言
编码电压门控钠通道（VGSC）NaV1.7（Baker和Nassar 2020）的SCN9A基因的功能丧失和获得突变分别导致先天性痛觉不敏感（Cox等人2006）或极端疼痛疾病，如原发性红痛症（Mann等人2019；Yang等人2004）、阵发性极端疼痛症（Fertleman等人2006；Hua等人2022）和特发性小纤维神经病变（Faber等人2012）。NaV1.7主要在外周神经系统中表达，包括交感神经元和背根神经节（DRG）及三叉神经节中的痛觉感觉神经元（Hameed 2019）。它定位于支配皮肤、肌肉和其他器官的感觉神经元的膜上，以及终止于脊髓背角的中央轴突中（Black等人2012；S. Shiers等人2020；S. I. Shiers等人2021）。作为神经元兴奋性的关键调节因子，它在膜去极化和动作电位发放过程中介导Na+电流（McDermott等人2019；Middleton等人2022），并且在啮齿动物和人类的疼痛状态下表达上调（Alvarez等人2021；Black等人2008；Hameed 2019；Li等人2018；Liu等人2021；Nascimento等人2022；Sun等人2018）。外周痛觉系统被认为是Nav1.7治疗靶向的主要作用部位（Chew等人2019）。已经开发了几种NaV1.7抑制剂，并进行了一系列临床试验，但对疼痛效果和心血管安全性的报告不一（Alles和Smith 2021；Biogen 2021；Dormer等人2023；Eagles等人2022；Kingwell 2019；McDonnell等人2018；Price等人2017）。虽然一些无效的结果可能是由于药代动力学不佳和/或对其他钠通道的选择性有限（Kraus等人2021），但最近的研究表明，抑制交感神经元上的Nav1.7会导致心血管效应，从而降低了这些直接抑制剂的安全性（Dib-Hajj等人2013；Mulcahy等人2024）。尽管在啮齿动物大脑（Allen Institute for Brain Science 2022b；Lein等人2007）和人类大脑皮层（Allen Institute for Brain Science 2022a）中几乎不存在，NaV1.7蛋白定位于啮齿动物和人类脊髓背角的突触前轴突中（Black等人2012；S. I. Shiers等人2021）。最近的研究表明，中枢神经系统中的NaV1.7通道可能对镇痛有重要作用。最近提出了一种中枢镇痛机制，即NaV1.7缺失的小鼠对疼痛不敏感，但仍保留了痛觉感受器的放电特性，但在脊髓背角的感觉神经元突触前末端表现出阿片依赖性的突触传递和神经递质释放受损（MacDonald等人2021）。也有证据表明NaV1.7在脊髓内突触后表达和功能。例如，最近的一项研究表明，背角神经元中的NaV1.7表达对脊髓损伤引起的疼痛很重要（Fu等人2023）。使用单细胞RNA测序技术在几种小鼠脊髓神经元亚群中也检测到了NaV1.7 mRNA（Russ等人2021），包括通过前外侧系统（ALS）向大脑传递疼痛、瘙痒和温度信息的Phox2a+投射神经元（Bell等人2023）。另一项使用电子显微镜的研究显示，大部分NaV1.7免疫反应性位于小鼠脊髓背角神经元的树突上，但这些作者提出该蛋白可能来源于突触前纤维，并通过尚未阐明的机制转移到突触后部位。基于上述在小鼠中的证据，我们假设SCN9A mRNA和NaV1.7蛋白可能也由人类背角神经元表达，包括投射神经元。在这里，我们使用了多种技术来证明人类背角神经元（包括假定投射神经元）中NaV1.7 mRNA和蛋白的表达。我们的发现支持应该研究背角NaV1.7在假定投射神经元中的功能作用，因为其在这些细胞中的表达可能对人类痛觉感知很重要。
2 材料与方法
2.1 人类组织采集
所有人类组织采集程序均获得了德克萨斯大学达拉斯分校机构审查委员会（协议Legacy-MR-15-237）的批准。所有组织都是通过与Southwest Transplant Alliance（STA）的合作，从神经学确定的死亡器官捐赠者处获取的。STA从捐赠者家属处获得了研究组织捐赠的知情同意。使用腹侧方法（Valtcheva等人2016）在器官捐赠者交叉夹闭后4小时内获取人类脊髓（腰椎至骶椎水平），立即在干冰中冷冻，并储存在-80°C的冷冻柜中。关于采集过程和组织处理的详细信息可以在protocols.io上找到（S. Shiers等人2024）。性别不被视为生物学变量，因为多项研究发现DRG中的Nav1.7表达没有差异（Chang等人2018；Ghovanloo等人2024），所有实验都包含了男女混合数据。捐赠者的人口统计信息和样本信息见表1。
表1. 捐赠者人口统计信息。
| 捐赠者ID | 年龄 | 性别 | COD | 脊柱水平 | 实验 |
|---------|------|------|------|------|
| UTD-DN0042 | 44 | 女性 | CVA/中风 | 腰椎4 | SCN9A/TACR1 |
| UTD-DN0087 | 56 | 男性 | 头部创伤/GSW | 腰椎5/骶椎1 | SCN9A/TACR1 |
| UTD-DN0077 | 40 | 女性 | CVA/中风 | 腰椎1 | SCN9A/TACR1 |
| UTD-DN0044 | 45 | 女性 | CVA/中风 | 腰椎3 | SCN9A/TACR1 |
| UTD-DN0023 | 18 | 女性 | 缺氧/癫痫 | 骶椎1 | NaV1.7/CGRP/Bassoon |
| UTD-DN0014 | 24 | 男性 | 头部创伤/MVA | 腰椎4 | NaV1.7/CGRP/Bassoon |
| UTD-DN0011 | 53 | 女性 | CVA/中风 | 腰椎5/骶椎1 | NaV1.7/CGRP/Bassoon |
| UTD-DN0037 | 69 | 男性 | CVA/中风 | 腰椎5 | NaV1.7/CGRP/Bassoon |
| UTD-DN0091 | 22 | 男性 | 过量/心血管 | 腰椎5 | NaV1.7/MAP2 |
2.2 RNAscope原位杂交
冷冻的人类脊髓（约1.5厘米长段）通过向干冰中添加少量OCT逐渐嵌入OCT冷冻模具中，以避免组织解冻。人类脊髓在SuperFrost Plus带电切片上切成20微米厚（Fisher Scientific；Cat 12-550-15）。切片仅短暂解冻以便粘附在切片上，然后立即返回-20°C的冷冻箱中直到切片完成。每个实验中每个捐赠者有三个切片被染色，每个实验使用了三到四个捐赠者的样本。切片从冷冻箱中取出，在37°C下解冻1分钟，然后立即转移到10%甲醛（Fisher Scientific；Cat 23–245684）中在室温下浸泡15分钟。切片随后在50%乙醇（5分钟；Fisher Scientific；Cat 04-355-223）、70%乙醇（5分钟）和两次100%乙醇（每次5分钟）中依次脱水，在室温下进行。切片短暂风干后，使用疏水性笔（ImmEdge PAP pen；Vector Labs）在每个切片周围绘制边界。一旦疏水性边界干燥，切片立即进行RNAscope原位杂交。使用ACD提供的新鲜冷冻协议（acdbio；手动编号323100-USM，修订日期：02272019）对人类脊髓切片进行RNAscope原位杂交多通道版本2（Advanced Cell Diagnostics；Cat 323100）处理。将过氧化氢（ACD；Cat 322381）应用于每个切片直至完全覆盖，并在室温下孵育10分钟。切片然后在蒸馏水中洗涤，然后在室温下依次在蛋白酶III试剂（ACD；Cat 322381）中孵育10秒。每个脊髓的单个切片都进行了阳性和阴性对照实验。由于人类神经组织中的脂褐素含量高和自荧光强，每次只染色两种感兴趣的mRNA（SCN9A [ACD；Cat 562251]与TACR1 [ACD；Cat 310701]和SCN9A与GPR83 [ACD；Cat 1082151]（在Cy3和Cy5通道中），第三个通道（488通道）保持未染色以显示背景信号。阳性对照探针和阴性对照探针的混合物包含三种mRNA探针的预混组合（ACD；Cat 320861），这些探针存在于所有细胞中（泛素C > 肽基丙氨酰-顺式-反式异构酶B > DNA导向的RNA聚合酶II亚基RPB1），允许我们评估组织质量和实验条件。所有组织对所有三种阳性对照探针都显示出强烈的信号。使用针对细菌DapB基因的阴性对照探针混合物（ACD；Cat 320871）来检查背景标记。然后将每个切片放入预热的湿度控制托盘（ACD；Cat 321710）中，其中含有湿润的滤纸（ThermoFisher Scientific；Cat 84784），并将探针滴加到每个切片上直至完全覆盖。为了避免液体蒸发和切片干燥，每次只处理一个切片。湿度控制托盘放置在HybEZ烤箱（ACD；Cat 321710）中，温度为40°C，时间为2小时。探针孵育后，切片在1x RNAscope洗涤缓冲液（ACD；Cat 310091）中洗涤两次，然后在室温下放入5x SSC缓冲液（Sigma；Cat S6639）中过夜。第二天早上，切片在1x RNAscope洗涤缓冲液（ACD；Cat 310091）中洗涤两次，然后放入40°C的烤箱中30分钟。接下来使用AMP-2和AMP-3试剂进行洗涤和扩增，孵育时间分别为30分钟和15分钟。将HRP-C1试剂应用于所有切片，然后在40°C的烤箱中孵育15分钟。切片在1x RNAscope洗涤缓冲液（ACD；Cat 310091）中洗涤，然后用TSA Plus Akoya染料（Akoya；NEL741001KT，NEL744001KT，NEL745001KT）以1:1000的比例在TSA缓冲液（ACD；Cat 322809）中制备。将分配给通道1的染料应用于每个切片直至完全覆盖，并在40°C的烤箱中孵育30分钟。切片再次洗涤，然后用HRP-C2和HRP-C3试剂及其对应的Akoya染料重复上述步骤。DAPI（Cayman Chemical；Cat 14285）在RNAscope洗涤缓冲液中以1:5000的比例制备，并在室温下应用于每个切片1分钟。切片再次洗涤，然后用RNAscope洗涤缓冲液冲洗，风干，并用Globe Scientific；Cat 1415-15的Prolong Gold Antifade mounting medium覆盖。
2.3 RNAscope原位杂交成像与分析
每个脊髓切片的一侧（每个捐赠者三个切片，总共三到四个捐赠者）在FV4000共聚焦显微镜（Evident Scientific）上进行马赛克成像，该显微镜具有自动对焦和自动拼接功能。所有马赛克图像都是自动拼接的20倍共聚焦xy图像，没有进行z轴堆叠。采集参数基于Evident Scientific提供的FV4000指南设置。原始图像文件在CellSens（Olympus；v1.18）中进行分析。True black脂褐素淬灭剂（用于免疫荧光）与RNAscope不兼容。大型球状结构和/或在所有通道中自动荧光的信号，在未染色的488通道中也可见，这些被认为是背景中的脂褐素，并不视为mRNA信号。除了调整亮度/对比度外，我们没有进行任何数字图像处理来去除背景。倾斜的切片图像被旋转，以便更清晰地分辨出层状边界。DAPI共染有助于定义白质与灰质的边界，并可视化胶状物质（substantia gelatinosa）。每个切片的脊髓水平是通过与人类脊髓图谱（Sengul等人，2013年）进行比较来确定的，并在表1中标示。人类脊髓图谱（Sengul等人，2013年）中的层状边界是用尺子测量的，并使用图谱的刻度尺转换为微米。马赛克图像在CellSens软件中打开，使用多段线工具为图谱中确定的每个层状边界绘制了微米刻度线。唯一的例外是第二层（lamina II）的边界，这些边界由胶状物质的轮廓清晰地界定，但并不总是与图谱完全对齐。每个层的边界是用闭合多边形工具追踪的。计算了每个层中每个mRNA靶标阳性的DAPI+细胞的数量。表2显示了SCN9A、TACR1和/或GPR83阳性细胞的总数。需要注意的是，DAPI对较大神经元细胞的染色较弱，这是我们在处理人类神经组织的许多实验中经常观察到的现象。在看到强烈的mRNA信号但细胞信号较弱或减弱的情况下，会增强图像以确认细胞的存在。图表是使用GraphPad Prism版本8.4.3（GraphPad Software, Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥）生成的。
2.4 免疫荧光和成像
人类脊髓被切成20微米的薄片，放置在SuperFrost Plus带电载玻片上（Fisher Scientific；目录号12-550-15）。切片仅短暂解冻以便粘附在载玻片上，然后立即返回到-20°C的冷冻室中直到切片完成。每个实验中对每个供体取三个切片，每个实验使用三到四个供体。每个脊髓的阴性对照切片暴露于所有试剂中，但不包括一抗。载玻片从冷冻室中取出后，立即转移到冷的10%甲醛（4°C；pH 7.4）中15分钟。然后组织在50%乙醇（5分钟）、70%乙醇（5分钟）、100%乙醇（5分钟）和室温下的100%乙醇（5分钟）中脱水。载玻片短暂风干后，使用疏水笔（ImmEdge PAP pen，Vector Labs）绘制每个切片的边界。当疏水边界干燥后，载玻片浸入封闭缓冲液（10%正常山羊血清，0.3% Triton-X 100在1x PBS中）中1小时，在室温下。载玻片然后用1x PBS冲洗，放入防光、控湿的托盘中，并在4°C下用封闭缓冲液稀释的一抗孵育过夜。使用的抗体列表可以在表3中找到。NaV1.7小鼠单克隆抗体已经通过在小鼠培养的DRG神经元上的免疫细胞化学和在大鼠大脑上的IHC得到敲除验证（Grubinska等人，2019年）。我们还证明这种抗体能强烈染色人类DRG，并显示出与其mRNA相似的特异性表达模式（S. Shiers等人，2020年）。
表3. 用于免疫荧光的抗体
抗体
供应商
目录号或克隆号
RRID
稀释度/浓度
小鼠抗NaV1.7
NeuroMab
N68/6
AB_2184355
2 µg/mL
兔抗NeuN
Cell Signaling
24307S
AB_2651140
1:500
兔抗CGRP
ImmunoStar
24112
AB_572217
1:1000
小鼠抗Bassoon
Enzo Life Sci
SAP7F407
AB_11181058
2 µg/mL
小鼠抗Ankyrin G
NeuroMab
N106/36
AB_10673030
2 µg/mL
鸡抗MAP2
Novus Bio
NB300-213
AB_2138178
2 µg/mL
山羊抗兔H&L 647
ThermoFisher
A21245
AB_2535813
1:2000
山羊抗鸡H&L 647
ThermoFisher
A21449
AB_2535866
1:2000
山羊抗小鼠IgG2a 555
ThermoFisher
A21137
AB_2535776
1:2000
山羊抗小鼠IgG2a 488
ThermoFisher
AB21131
AB_2535771
1:2000
山羊抗小鼠IgG1 488
ThermoFisher
A21121
AB_2535764
1:2000
山羊抗小鼠IgG1 555
ThermoFisher
A21127
AB_2535769
1:2000
第二天，载玻片在1x PBS中清洗，然后在室温下用1:2000稀释的DAPI（1:5000；Cayman Chemical；目录号14285）和封闭缓冲液中的二次抗体孵育1小时。切片在1x PBS中清洗后，覆盖上True Black（20%稀释在70%乙醇中），这是一种脂褐素的阻断剂，孵育1分钟。切片然后用水清洗，风干，并用Prolong Gold Antifade试剂（Cat P36930，Fisher Scientific）封片。每个脊髓切片的一侧（每个供体三个切片）在FV3000或FV4000共聚焦显微镜（Evident Scientific）上进行马赛克成像，该显微镜具有自动对焦和自动拼接功能。所有马赛克图像都是自动拼接的20倍共聚焦xy图像，并没有投影z堆栈。此外，还在FV3000或FV4000共聚焦显微镜上获取了10倍、20倍和40倍的xy图像。采集参数是根据Evident Scientific提供的每台显微镜的指南设置的。原始图像文件在CellSens（Olympus；v1.18）中可视化。图像在CellSens中进行了亮度和对比度调整。
3 结果
3.1 SCN9A mRNA在人类脊髓背角TACR1+假定的投射神经元中表达
P物质受体（蛋白质：Nk1r，mRNA：Tacr1）标记了一部分在啮齿动物脊髓背角中传递疼痛和瘙痒信息到脑干旁丘核的投射神经元（Blomqvist和Mackerlova 1995；Carstens等人2010；Mantyh等人1997）。这些神经元主要位于表层层（主要是第一层（Carstens等人2010；Mantyh等人1997），但也在深层背角中发现，主要是在第五层（Brown等人1995）。需要注意的是，人类投射神经元的分子身份尚不清楚，因此，我们将第一层和第五层中表达大量TACR1/Nk1r和GPR83的神经元称为假定的投射神经元。尽管Nk1r/Tacr1并不专属于投射神经元群体（Russ等人2021），但它通常用于识别背角投射神经元（Marshall等人1996）。我们使用RNAscope评估了人类脊髓背角中SCN9A（NaV1.7）和TACR1（Nk1r）mRNA的分布。我们发现SCN9A和TACR1 mRNA存在于人类脊髓背角的整个第一至第五层细胞中（图1A-F）。在背角（第一至第五层），几乎所有的TACR1+细胞都是SCN9A+（92%），但只有45%的SCN9A+细胞也是TACR1+（图1G,H）。SCN9A mRNA还检测到在中央管附近的室管膜细胞（图1I）、骶部副交感神经核中的节前副交感神经元（图1J）、腹角中的运动神经元（图1K）以及中间外侧柱中的节前交感神经元（图1L）中。
3.2 SCN9A mRNA在人类脊髓背角GPR83+假定的投射神经元中表达
G蛋白偶联受体83（GPR83）由第二组投射神经元表达，这些神经元位于啮齿动物脊髓背角的第一至第二层。GPR83和Tacr1投射神经元群体有很小的重叠（约20%的重叠），终止于旁丘核的不同亚核，并且共同构成了大约88%的所有ALS投射神经元（Choi等人2020）。然而，最近的一项使用新的转基因品系的报告重新证实了早期的发现（Cameron等人2015），表明Tacr1在90%的所有ALS投射神经元中表达（Ma等人2025），这表明这些群体可能并不像之前报道的那样截然不同。为了进一步研究SCN9A在投射神经元中的表达，我们结合GPR83进行了RNAscope原位杂交（图2A）。SCN9A和TACR1在所有第一至第五层的细胞中都被检测到（图2B-F）。SCN9A与大多数表达GPR83的细胞共表达（图2G），该区域的汇总数据显示89%的GPR83表达细胞也共表达SCN9A mRNA（图2H）。这种分布与最近发表的人类脊髓空间转录组数据非常相似（Yadav等人2023），其中SCN9A、TACR1和GPR83 mRNA在整个背角和腹角中都被发现（图3A）。SCN9A还通过单核RNA测序在人类脊髓的广泛兴奋性和抑制性背角神经元中检测到（Yadav等人2023），其中许多神经元同时表达TACR1和/或GPR83（图3B）。
3.3 NaV1.7蛋白位于人类脊髓的突触前区域
NaV1.7蛋白在人类脊髓中的染色非常明显，特别是在背根小节和第一、第二层中，正如我们之前报道的（S. I. Shiers等人2021）（图4A,B）。NaV1.7染色在第一至第二层的轴突和突触（神经纤维）中呈现模式（图4B）。NaV1.7在腹角的运动神经元细胞质中（图4C）、前连合的轴突中（图4D）以及中央管周围的室管膜细胞中也被检测到，这证实了其在这些细胞中的mRNA表达（图4D）。人类腰椎脊髓（第5腰椎）中NaV1.7（红色）蛋白染色的马赛克图像，与DAPI（蓝色）共染。白色轮廓标出了灰质。(B) NaV1.7蛋白在脊髓背角呈现出轴突和神经纤维（突触）的分布模式，主要位于I–II层（LI–LII）。(C) 在腹角的 large motor neurons 的细胞质中也检测到了Nav1.7蛋白，以及(D) 前连合中的轴突（白色箭头所示），还有室管膜细胞的细胞质（标出中央管的细胞）。(E) NaV1.7蛋白（红色）与痛觉突触前标记物CGRP（蓝色）、突触前活性区标记物Bassoon（绿色）和DAPI（青色）共染的代表性10倍放大共聚焦图像，位于脊髓背角的LI–LII层。(F) 负对照组的LI–LII层的叠加图像（488, 555, 647, DAPI），该对照组暴露于所有相同的试剂，只是没有使用一级抗体，并且成像和调整参数与E中的相同。(G) C中黄色轮廓区域的更高放大（100倍）共聚焦视图。(F) E中白色轮廓区域的数字放大视图，显示NaV1.7信号与CGRP和/或Bassoon（白色箭头）共定位，或靠近这些蛋白质。LI–LV，层I–V；CC，中央管。样本量：n = 4。比例尺：A = 1毫米；B–C = 500微米；D–F = 200微米；G = 20微米；H = 10微米。当用CGRP标记时，我们已经证明这种神经肽在所有人类痛觉感受器中都有表达（S. Shiers等人2020；S. I. Shiers等人2021），以及突触前活性区蛋白Bassoon（图4E），大部分NaV1.7信号似乎与这些突触前标记物共定位或在其附近（图4F）。然而，更高倍数的成像显示，并非所有表层层的NaV1.7信号都位于这些突触前蛋白质上（图4G,H），这可能表明这些蛋白质在突触前区室内的亚细胞定位存在差异，或者是尚未到达背角终止点的DRG初级传入纤维，甚至是背角神经元中的树突或轴突定位。实际上，在更深的层（LIII–LV）中也检测到了NaV1.7，其中在V层的丰度最高（图4D），以及在进入前连合的轴突中（靠近X层和中央管），那里背角投射神经元穿过中线进入对侧脊髓丘脑束。由于在猫和猕猴中的追踪研究表明，投射到脊髓丘脑束的神经元起源于I层和V层，因此表层层的非突触前信号以及深层层的轴突信号可能代表由投射神经元表达的NaV1.7蛋白（Craig 2006；Jones等人1987；Willis等人1979）。
3.4 人类脊髓中突触后NaV1.7蛋白的证据
为了识别脊髓背角中的突触后NaV1.7免疫反应性，我们将NaV1.7与多种神经元亚细胞蛋白标记物共染。虽然Nav1.7定位于感觉神经元的细胞体及其周围和中央轴突和终末突触的细胞质和膜中，但其中枢神经系统中的表达可能有所不同。已知其他VGSC在中枢神经系统的不同细胞区室中也有表达，如突触、树突、轴突起始段（AIS）、Ranvier结以及整个脊髓和大脑的神经元轴突（Hanson等人2004；Schaller和Caldwell 2003）。首先，我们结合神经元细胞体和核标记物NeuN（图5A）评估了NaV1.7的存在，以确定是否在背角 resident neurons 的细胞体中检测到NaV1.7。然而，我们没有找到令人信服的证据表明NaV1.7在I–V层的神经元细胞体中表达（图5B–F）。接下来，我们评估了NaV1.7是否与细胞骨架标记物MAP2共表达，后者主要定位于树突（图6A）。我们评估了三名器官捐赠者的背角，但没有发现NaV1.7信号定位于背角 resident neurons 的树突区室的证据（图6B–D）。在前连合中，我们再次观察到强烈标记的NaV1.7轴突纤维穿过脊髓的另一侧（图6E），但我们无法确定这些轴突来自哪些神经元；然而，它们很可能是投射神经元，因为这是脊髓神经传递的主要枢纽。
3.4 人类脊髓中突触后NaV1.7蛋白的证据
为了识别脊髓背角中的突触后NaV1.7免疫反应性，我们将NaV1.7与多种神经元亚细胞蛋白标记物进行了共染。虽然Nav1.7定位于感觉神经元的细胞体及其周围和中央轴突和终末突触的细胞质和膜中，但其中枢神经系统中的表达可能有所不同。已知其他VGSC在中枢神经系统的不同细胞区室中也有表达，例如突触、树突、轴突起始段（AIS）、Ranvier结以及整个脊髓和大脑的神经元轴突（Hanson等人2004；Schaller和Caldwell 2003）。首先，我们结合神经元细胞体和核标记物NeuN（图5A）评估了NaV1.7的存在，以确定是否在背角 resident neurons 的细胞体中检测到NaV1.7。然而，我们没有找到NaV1.7在I–V层神经元细胞体中表达的令人信服的证据（图5B–F）。接下来，我们评估了NaV1.7是否与细胞骨架标记物MAP2共表达，后者主要定位于树突（图6A）。我们评估了三名器官捐赠者的背角，但没有发现NaV1.7信号定位于背角 resident neurons 的树突区室的证据（图6B–D）。在前连合中，我们再次观察到强烈标记的NaV1.7轴突纤维穿过脊髓的另一侧（图6E），但我们无法确定这些轴突来自哪些神经元；然而，它们很可能是投射神经元，因为这是脊髓神经传递的主要枢纽。
4. 讨论
在本研究中，我们发现了人类脊髓内在神经元中NaV1.7表达的证据，包括在背角和腹角。首先，我们发现SCN9A（蛋白质：NaV1.7）mRNA在大约90%的所有GPR83+和TACR1+（蛋白质：Nk1r）神经元中都有表达，这些神经元是已知的投射神经元标记物（Cameron等人2015；Carstens等人2010；Choi等人2020；Ma等人2025；Mantyh等人1997）。在啮齿动物中，Nk1r和GPR83由一部分大直径的投射神经元表达，这些神经元将投射到更高的脑区，如旁脑桥核，并主要位于I层和V层周围的深层背角（Brown等人1995；Choi等人2020；Marshall等人1996；Todd等人2000）。需要注意的是，并非所有啮齿动物的投射神经元都是Tacr1+（Nk1r+），中间神经元和运动神经元也表达这种基因（Russ等人2021）。单核RNA测序再现了这种表达模式，因为SCN9A、GPR83和TACR1 mRNAs在广泛的人类脊髓神经元群体中共同表达，包括运动神经元（Yadav等人2023）。SCN9A与已知的啮齿动物投射神经元标记物在LI–LII和LV中的高共表达支持了一部分SCN9A、GPR83和TACR1共表达的神经元可能是投射神经元。另一项研究使用单细胞测序在小鼠脊髓中检测到了Scn9a mRNA在多种Tacr1共表达的神经元群体中的存在（Russ等人2021）。然而，只有其运动神经元表达可以通过原位杂交得到验证（Allen脑科学研究所2022b；Alles等人2020）。尽管这些技术差异可能是由于灵敏度问题造成的，但在啮齿动物脊髓背角神经元中检测到NaV1.7 mRNA和蛋白质的结果并不确定，这可能是由于其在神经元膜中的独特亚细胞定位，可能包括细胞体、树突、Ranvier结和/或突触。实际上，大多数报告表明脊髓NaV1.7蛋白表达完全是突触前的，因为其在I–II层中的强烈神经纤维染色模式（Black等人2012；S. I. Shiers等人2021）。然而，免疫电子显微镜检测到小鼠背角神经元树突中的NaV1.7蛋白，但假设这些蛋白质起源于突触前区并通过未知机制转移到突触后部位（Alles等人2020）。虽然我们也在人类脊髓背角的I–II层检测到了强烈的突触前NaV1.7标记，但并非所有表达都与突触前标记物如CGRP和Bassoon共定位。NaV1.7蛋白还定位于更深层的轴突，特别是在V层，并且在进入前连合的轴突中（靠近X层和中央管），那里背角投射神经元穿过中线进入对侧脊髓丘脑束。由于在猫和猕猴中的追踪研究表明，投射到脊髓丘脑束的神经元起源于I层和V层，因此表层层的非突触前信号以及深层层和前连合中的轴突信号可能代表由投射神经元表达的NaV1.7蛋白（Craig 2006；Jones等人1987；Willis等人1979），我们通过额外的实验探讨了这一假设。
4. 讨论
在当前的研究中，我们发现了人类脊髓内在神经元中NaV1.7表达的证据，包括在背角和腹角。首先，我们确定SCN9A（蛋白质：NaV1.7）mRNA在大约90%的所有GPR83+和TACR1+（蛋白质：Nk1r）神经元中都有表达，这些神经元是已知的投射神经元标记物（Cameron等人2015；Carstens等人2010；Choi等人2020；Ma等人2025；Mantyh等人1997）。在啮齿动物中，Nk1r和GPR83由一部分大直径的投射神经元表达，这些神经元将投射到更高的脑区，如旁脑桥核，并主要位于I层和V层周围的深层背角（Brown等人1995；Choi等人2020；Marshall等人1996；Todd等人2000）。需要注意的是，并非所有啮齿动物的投射神经元都是Tacr1+（Nk1r+），中间神经元和运动神经元也表达这种基因（Russ等人2021）。单核RNA测序再次证实了这种表达模式，因为SCN9A、GPR83和TACR1 mRNAs在广泛的人类脊髓神经元群体中共同表达，包括运动神经元（Yadav等人2023）。SCN9A与已知的啮齿动物投射神经元标记物在LI–LII和LV中的高共表达支持了一部分SCN9A、GPR83和TACR1共表达的神经元可能是投射神经元。另一项研究使用单细胞测序在小鼠脊髓中检测到了Scn9a mRNA在多种Tacr1共表达的神经元群体中的存在（Russ等人2021）。然而，只有其运动神经元表达可以通过原位杂交得到验证（Allen脑科学研究所2022b；Alles等人2020）。虽然灵敏度问题可能是这些技术差异的原因，但在啮齿动物脊髓背角神经元中检测到NaV1.7 mRNA和蛋白质的结果也不确定，这可能是由于其在神经元膜中的独特亚细胞定位，可能包括细胞体、树突、Ranvier结和/或突触。实际上，大多数报告表明脊髓NaV1.7蛋白表达完全是突触前的，因为其在I–II层中的强烈神经纤维染色模式（Black等人2012；S. I. Shiers等人2021）。然而，免疫电子显微镜检测到小鼠背角神经元树突中的NaV1.7蛋白，但假设这些蛋白质起源于突触前区并通过未知机制转移到突触后部位（Alles等人2020）。虽然我们也在人类脊髓的I–II层检测到了强烈的突触前NaV1.7标记，但并非所有表达都与突触前标记物如CGRP和Bassoon共定位。NaV1.7蛋白还定位于更深层的轴突，特别是在IV层和V层，以及前连合中的轴突，前连合是连接脊髓两侧的白质束，是背角投射神经元传递痛觉信息到对侧脊髓丘脑束的重要中继（Ku和Morrison 2022）。由于轴突追踪方法不能直接应用于人类脊髓，我们无法确定这些是初级传入纤维还是内在背角神经元的轴突；然而，初级传入纤维的上升投射在背柱中上升并不穿过中线，因此这些连合轴突极不可能来自感觉神经元。有趣的是，我们不仅发现NaV1.7定位于运动神经元的细胞体，还发现它似乎也定位于它们的AIS。最近关于啮齿动物DRG中NaV1.7的研究发现，感觉神经元含有AIS，其中NaV1.7富集，其定位对神经病性疼痛的自发活动至关重要（Nascimento等人2022）。其他VGSC也已知在中枢神经系统的AIS中富集（Leterrier 2018）。为了确认我们在运动神经元中的观察结果，我们将NaV1.7与AIS标记物Ankyrin-G共染，发现NaV1.7与人类腹角运动神经元的AIS中的Ankyrin-G共定位（图6F）。在背角，我们也发现了NaV1.7定位于居民神经元AIS的证据（图6G），但这种染色很稀疏，并非所有神经元中都有。需要注意的是，由于整个区域的强烈突触前神经纤维标记，很难检测到LI–LII中的突触后NaV1.7信号。背角 resident neurons中的NaV1.7表达可能很低，或者低于检测水平。然而，增加成像参数以捕捉这种信号会导致突触前标记过饱和，使得细胞结构不再可区分。因此，我们保持较低的成像参数，以便通过神经纤维染色来观察解剖结构。这可能解释了为什么检测到的突触后NaV1.7标记低于预期。然而，鉴于我们在大多数TACR1+和GPR83+神经元中观察到强烈的NaV1.7 mRNA表达，并且在背角和腹角神经元中的AISs中发现了NaV1.7定位的证据，我们的数据支持当mRNA翻译时，它定位于内在背角轴突的膜上。这一点还得到了前连合中NaV1.7轴突标记的支持。其他Nav家族成员在AIS（轴突起始区）中高度集中，它们在该区域的定位对于将突触电流整合到动作电位的产生中至关重要（Grubb和Burrone 2010；Leterrier 2018）。重要的是，已知神经元会通过增加或减少AIS的大小来增强或抑制其兴奋性，以应对突触前输入的变化（Grubb和Burrone 2010；Grubb等人2011；Kuba等人2010）。由于感觉神经元的过度兴奋和/或自发性活动是慢性疼痛条件下异常痛觉信号传导到背角的主要驱动因素，因此Nav1.7在背角神经元中的调节可能对痛觉处理至关重要。最近的一项研究发现，在脊髓损伤后小鼠的背角神经元中存在Nav1.7的表达（Fu等人2023）。这表明，人类背角神经元中SCN9A mRNA的存在可能为损伤后的蛋白质表达上调奠定了基础。虽然SCN9A的功能丧失突变会导致啮齿动物和人类的疼痛不敏感（Gingras等人2014；Grubinska等人2019；Shields等人2018），但在小鼠中工程化设计的与导致人类疼痛障碍的功能获得突变并不完全再现人类的疼痛表型（Chen等人2021）。一个可能的解释是，功能丧失表型依赖于感觉神经元中保守表达的Nav1.7，而这种功能丧失会导致痛觉感受器的动作电位产生能力下降。另一方面，人类的功能获得性疼痛表型可能需要外周敏感化和脊髓放大作用。由于几乎没有令人信服的证据表明在无损伤的情况下小鼠脊髓内在神经元中存在Nav1.7的表达，因此有一种假设认为，小鼠中不会发生痛觉信号的脊髓放大作用，但在具有功能获得突变的人类中可能会发生，因为SCN9A在背角神经元（包括假定的投射神经元）中广泛表达。如果确实如此，SCN9A的功能获得突变可能导致投射神经元的兴奋性增加，这种增加又会因外周过度兴奋的痛觉感受器传递的痛觉输入而进一步放大。然而，这一机制假设可能并不那么简单，因为单核测序显示SCN9A mRNA存在于背角的许多神经元中，包括抑制性中间神经元（Yadav等人2023）。尽管如此，Nav1.7的功能获得突变导致的背角电路动态失调可能解释了人类和啮齿动物之间疼痛表型的差异。总之，我们提供了几个有力的证据来支持人类脊髓背角内在神经元中存在Nav1.7 mRNA和蛋白质表达：（1）通过RNAscope原位杂交、空间测序和单核测序检测到人类背角内在神经元表达SCN9A mRNA；（2）约90%的GPR83+和TACR1+人类背角内在神经元表达SCN9A，其中一部分可能是投射神经元；（3）许多同时表达SCN9A和GPR83或TACR1的神经元直径较大，并且主要分布在已知富含投射神经元的层（I层和V层）；（4）并非所有NaV1.7蛋白信号都局限于突触前区域，这一点通过与CGRP和Bassoon共标记得到证实；（5）在一些背角内在神经元的AIS中检测到NaV1.7；（6）在前连合中检测到NaV1.7+轴突。
致谢
作者感谢器官捐赠者及其家人通过器官捐赠提供的生命和研究机会。
资助
本工作得到了NIH资助（U19NS130608）和Grünenthal的研究资助。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。J.L.K.和C.L.是Eli Lilly的员工。S.H.是Grünenthal GmbH的员工。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。
同行评审
为了透明度，与本文相关的同行评审文件可在以下链接获取：https://doi.org/10.1002/cne.70168。
编辑决策信
2026/03/02
编辑1建议
2026/02/24
评审员1报告
2026/01/12
评审员1报告附件1
2026/01/12
评审员2报告
2026/01/12
评审员3报告
2026/01/03
第一轮评审
编辑决策信
2025/10/17
编辑决策信附件1
2025/10/17
评审员3报告
2025/09/25
评审员2报告
2025/09/24
评审员1报告
2025/09/09
打赏
