**摘要**
**关键信息**
SlERF-RD1 充当分子“刹车”，导致果实成熟过程解耦，软化延迟，同时优化了植物结构和开花时间，这表明它有潜力提高番茄的保鲜期和产量。
**摘要**
番茄（Solanum lycopersicum）的果实成熟是一个复杂的发育过程，由转录因子和植物激素乙烯组成的分层网络协调控制。在这项研究中，我们鉴定并表征了 SlERF-RD1（Solyc02g077790），这是一种属于 AP2/ERF 超家族的成员，作为成熟的战略性负调控因子和植物结构的协调者。转录组元分析显示，SlERF-RD1 对乙烯高度敏感，并在果实腔组织中表现出时空富集现象，表明其在成熟级联反应中起早期作用。在番茄中稳定过表达 SlERF-RD1 会导致成熟显著延迟，其特征是成熟期乙烯产量减少了 40–47%，以及组织特异性类胡萝卜素积累发生变化。分子分析表明，这些表型是由主要调控因子 SlRIN 和限速类胡萝卜素基因 SlPSY1 的转录下调驱动的。值得注意的是，SlERF-RD1 过表达的果实 在成熟后期保持了更好的硬度，这与细胞壁修饰基因 SlPG2A 和 SlEXP1 的显著抑制有关。此外，我们鉴定出 Solyc01g108880 作为一个新的共表达靶标，在果实完全成熟阶段其表达显著增加，这表明存在一个晚期的细胞壁强化机制。除了果实特性外，SlERF-RD1 过表达还使植物结构更加紧凑，并通过上调 SlSFT 加速了开花转变。我们的发现表明，SlERF-RD1 促进了异步、坚实成熟的果实表型，同时支持了优化的营养生长。这项研究突显了 SlERF-RD1 作为遗传策略的高潜力靶标，旨在同时增强作物结构和采后保鲜期。
**引言**
番茄（Solanum lycopersicum L.）是研究成熟果实发育的主要模型，这一过程的特点是自催化乙烯产量显著增加，称为系统 II 乙烯合成（Alba 等，2005）。这一转变由关键生物合成基因（主要是 SlACS2、SlACS4 和 SlACO1）的转录激活启动，从而触发一系列与成熟相关的生理变化（Giovannoni 等，2017）。乙烯信号通过膜结合受体（如 SlETR1–7）检测，并通过一个保守的途径传递，在该途径中 SlCTR1 作为负调控因子，SlEIN2 作为正向转导因子，最终使 EIN3/EIL 转录因子在细胞核中稳定（Mata 等，2018）。作为乙烯信号通路的末端组分，APETALA2/乙烯响应因子（AP2/ERF）超家族的成员作为下游效应器，将激素信号转化为特定的成熟结果。最近的研究强调了 ERFs 在调节“主要调控因子”（如 MADS-RIN、NAC-NOR 和 CNR）表达中的作用，形成了一个精细调节成熟速率的复杂反馈回路（Deng 等，2022）。虽然许多 ERFs 促进成熟，但负调控因子（如 SlERF-RD1 和 SlLBD33）的发现揭示了一种重要的“分子制动”机制，防止过早成熟并确保养分合理分配（Liu 等，2020；Deng 等，2022）。番茄果实成熟的启动和进展需要成熟期乙烯产生与不断演变的主要转录因子层次结构之间的高度协调，特别是 MADS-RIN、NAC-NOR 和 NOR-like1（Huang 等，2025；Aprilyanto 等，2025）。这一调控网络的最关键结果之一是初级细胞壁和中层膜的修饰。多聚半乳糖醛酸酶（PGs）、果胶甲基酯酶（PMEs）和膨胀素（EXPs）等酶的协同作用导致果胶-纤维素-半纤维素网络的逐步分解，从而引起果实软化（Smith 等，1988；Brummell 等，1999）。尽管软化对口感至关重要，但过度的细胞壁降解会显著限制采后保鲜期并增加对机会性病原体的敏感性。尽管已经鉴定出许多成熟调控因子，但将软化与其他成熟特征区分开来并产生“坚实成熟”表型的确切转录机制仍不清楚。
**材料与方法**
**基于计算的分析和候选基因鉴定**
为了鉴定 AP2/ERF 超家族中的高优先级成熟调控因子，使用 Genevestigator 数据库进行了转录组元分析（Hruz 等，2008）。Genevestigator 广泛用于整合多个植物物种的公开可用表达数据集的转录组元分析平台（Zimmermann 等，2004；Hruz 等，2008）。尽管该平台已不再维护，但它仍然是挖掘历史上有序数据集的宝贵资源。在这项研究中，Genevestigator 被用作初步筛选工具，根据发育阶段和实验扰动中的一致表达模式来鉴定候选基因。为了确保可靠性和可重复性，通过番茄表达图谱（Fernandez-Pozo 等，2017）中的独立数据集对所有通过 Genevestigator 识别的表达趋势进行了交叉验证。转录组数据来自 Genevestigator 平台（Hruz 等，2008），使用实验 SL-00038，该实验整合了公开的番茄果实发育 RNA-seq 数据集。所示的扰动对应于 Genevestigator 分析框架内基于阶段的比较（例如，1 cm、2–3 cm、成熟绿色、破色和完全成熟）。这些数据来自多个公开的转录组研究，包括番茄表达图谱（Fernandez-Pozo 等，2017），并使用 3D Expression Cube 进行可视化。为了功能分类，使用 clusterProfiler R 包（Wu 等，2021）对鉴定出的共表达模块进行了基因本体（GO）和 KEGG 通路富集分析，显著性阈值设为 FDR < 0.05。共表达关系是基于 Genevestigator 数据集中发育阶段基因表达谱的成对 Pearson 相关性分析推断的。选择与 SlERF-RD1 相关系数（r ≥ 0.85）较高的基因来构建共表达模块。使用 R 中实现的层次聚类（欧几里得距离，完全链接）对结果基因集进行可视化，生成热图表示。为了研究 SlERF-RD1 及其靶基因之间的潜在分子相互作用，从 Phytozome v14 中检索了 SlRIN（Solyc05g012020）、SlEXP1（Solyc06g051800）、SlPSY1（Solyc03g031860）和 SlPG2A（Solyc10g080210）的 2000 bp 上游区域，以及 SlERF-RD1（Solyc02g077790）启动子本身。这些序列使用 PLACE（Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements）数据库系统地扫描了顺式作用调控元件。搜索特别针对 AP2/ERF 家族成员的高置信度结合基序，包括 GCC-boxes（AGCCGCC；AGCBOXNPGLB）和 W-boxes（TGACY/TTGAC；WBOXNTERF3 和 WBOXATNPR1）。此外，分析还包括识别脱水响应元件（DRE/CRT；RCCGAC）、乙烯响应元件（ERELEE4；AWTTCAAA）和发育调控因子（如 DOF-core 动机（AAAG；DOFCOREZM）。这些元件相对于转录起始位点（TSS）的空间分布和确切基因组坐标被绘制出来，为观察到的 SlERF-RD1-OE 线中的转录抑制提供了理论框架。
**植物材料与生长条件**
所有实验均使用番茄（Solanum lycopersicum L. cv. Crocker）作为生物材料，包括遗传转化和生理分析。种子经过表面灭菌后，在半浓度的 Murashige 和 Skoog（MS）培养基上发芽。幼苗随后移植到有机土壤中，并在 Ondokuz Mayıs 大学的农业生物技术系的气候控制温室中生长。生长条件保持在 25°C 白天/20°C 夜间温度循环，光照时间为 16 小时/8 小时黑暗，相对湿度为 60%。植物栽培、灌溉和施肥按照我们之前的研究方案进行（Gökdemir 等，2022；Aydin 等，2025）。在三个不同的发育阶段采集果实样本：成熟绿色（MG，约开花后 35 天）、破色（BR，颜色变化开始）和完全成熟（RR，破色后 7 天），并立即处理或快速冷冻在液氮中以进行后续分子分析（Giovannoni 2004）。
**载体构建和番茄转化**
使用从 S. lycopersicum cv. Crocker 中提取的总 RNA 通过 RT-PCR 扩增了 Solyc02g077790（SlERF-RD1）的全长编码序列（CDS）。RNA 分离使用 RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）进行，然后通过柱上 DNase I 处理以消除基因组 DNA 污染。根据制造商的说明，使用 iScript™ cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）从总 RNA 合成 cDNA。
**结论**
SlERF-RD1 作为一种分子“刹车”，导致果实成熟过程解耦，软化延迟，同时优化了植物结构和开花时间，这表明它有潜力提高番茄的保鲜期和产量。为了获得T1种子，正性的T0品系在温室中培育至成熟。通过分离分析鉴定出纯合的T2品系（#4、#5和#7），并通过qRT-PCR确认目标基因的过表达（图S1c），然后用于进一步的表型和生理特性研究。
**表型和形态特征分析**
系统评估了植株的营养生长和生殖生长参数，以评估SlERF-RD1过表达的多效性效应。在发芽后30天（DAG），测量了植株高度（从土壤表面到顶端分生组织）和冠层直径。为了量化冠层结构，使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）捕获植株的顶视图照片，并根据Abràmoff等人（2004年）的方法分析表面积覆盖情况。
**生殖特性分析**
包括确定花期转换期（从发芽到首次开花的天数）以及前三个花序上的总花朵数量。使用高分辨率平板扫描仪量化花瓣和萼片的总面积（mm²），随后在ImageJ中进行图像处理。这些形态学评估遵循Shinozaki等人（2018年）以及我们之前的研究（Gökdemir等人2022年；Aydin等人2025年）建立的番茄表型描述标准。
**生理果实分析：硬度、颜色和乙烯产生**
为了研究SlERF-RD1-OE品系的成熟问题，在MG、BR和RR阶段测量了生理参数。使用配备5毫米直径活塞的数字穿刺仪（Lutron FG-5020）测量果实硬度。在每个果实的赤道平面上三个等距点进行测量，结果以牛顿（N）表示，方法参考Liu等人（2020年）的描述。
**外部果实颜色评估**
使用Minolta Chromameter（CR-400，柯尼卡美能达，日本）评估果实颜色。颜色用CIELAB色度系统记录，其中L*表示亮度，a*表示红度/绿色，b*表示黄度/蓝色。根据McGuire（1992年）的方法计算色度（C*）和色调角（h0）。
**乙烯产生**
将已知重量的单个果实放入密封的1升玻璃罐中，在25°C下放置3小时。使用注射器从顶部空间抽取1毫升气体样本，注入配备火焰离子化检测器（FID）和毛细管柱的气相色谱仪（Shimadzu GC–MS-QP2010S）中。根据Alba等人（2005年）的方法，将乙烯浓度计算为μL.kg−1.h−1。
**可溶性固形物和维生素C含量测定**
在RR阶段评估果实的内部生化质量。使用数字折射仪（Atago PAL-1，东京，日本）测量可溶性固形物含量（SSC），以°Brix表示。将代表性果实样本匀浆，过滤后置于25°C的恒定温度下的折射仪棱镜上，方法参考Beckles（2012年）的描述。
**维生素C（抗坏血酸）含量测定**
使用2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）滴定法测定维生素C（抗坏血酸）含量。简要来说，将5克果实组织在5%（w/v）的偏磷酸溶液中匀浆以防止抗坏血酸氧化。提取物离心后，用标准化的DCPIP溶液滴定，直到观察到持续的粉红色。结果根据Stevens等人（2007年）的方法计算为每100克鲜重（FW）中的抗坏血酸毫克数。
**RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）**
在MG、BR和RR阶段，使用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，德国希伦登）从各种番茄组织（包括营养器官和果实样本）中提取总RNA。为了防止基因组DNA污染，在提取方案中加入了柱上DNase I（Qiagen）处理。使用NanoDrop™ One分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）评估RNA的纯度和浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。
**第一链cDNA合成**
使用iScript™ cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯）从1微克总RNA合成第一链cDNA。在Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统上进行qRT-PCR，使用SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix（Bio-Rad）。热循环条件和反应设置根据制造商的建议进行调整。相对转录本丰度使用Livak和Schmittgen（2001年）描述的2−ΔΔCT方法计算。番茄SlActin（Solyc03g078400）基因被用作内部组成参考基因进行标准化（Expósito-Rodríguez等人2008年）。本研究中用于克隆和qRT-PCR分析的所有寡核苷酸引物列在表S1中。所有实验均进行三次生物学重复和三次技术重复。
**统计分析**
所有实验均采用完全随机设计，至少有三个生物学重复。为了评估SlERF-RD1过表达的效果，使用Student’s t检验确定WT与每个独立转基因品系（OE）之间的统计显著性。对于涉及多个成熟阶段或组织类型的分析，数据先进行单因素方差分析（ANOVA），然后进行事后比较。差异在P<0.05（*）、P<0.01（**）或P<0.001（***）时被认为是统计学上显著的。计算Pearson相关系数（r）以评估SlERF-RD1与其共表达伙伴之间的转录协同作用。所有统计计算和高分辨率数据可视化（包括条形图和热图）均使用GraphPad Prism（版本9.0）和R软件（R Core Team 2021）生成。
**结果**
SlERF-RD1作为多效性发育协调者：多层次生物信息学优先级和时空特征分析
为了识别控制番茄果实成熟的主要转录节点，我们实施了一个整合发现流程，利用大规模转录组数据集。这一系统筛选突出了SlERF-RD1，它是AP2/ERF超家族的成员，因其与成熟诱导信号的强关联而被认为是高置信度的候选基因。使用Genevestigator平台对转录组变化的详细分析显示，SlERF-RD1的表达对成熟触发机制高度敏感（图1a）。分析Genevestigator SL-00038数据集在五个不同的果实发育阶段（从1厘米到红熟）显示SlERF-RD1的一致上调，证实了其在核心成熟网络中的位置。为了细化SlERF-RD1的时空活性，我们使用了Tomato Expression Atlas（TEA）的高分辨率数据（图1b；图S2）。通过3D表达立方体可视化的表达图谱显示，在从成熟绿色（MG）到红熟（RR）阶段的转变过程中，转录本主要定位于果皮、隔膜和子房组织中（图1b；图S2a和S2b）。值得注意的是，子房中的表达强度在RR阶段达到峰值，与胎座组织表现出强烈的转录相关性（图1b；图S2c；Pearson r=0.91）。
**SlERF-RD1作为多效性发育协调者的综合发现和时空特征分析**
a. 热图展示了SlERF-RD1在Genevestigator实验SL-00038中五个发育扰动下的转录响应，代表了番茄果实发育过程中的阶段特异性比较。
b. 高分辨率可视化显示了SlERF-RD1在成熟绿色（MG）、破裂期（BR）和红熟（RR）阶段在番茄果实中的转录分布，突出了果皮、隔膜和子房组织中的组织特异性富集。
c. 共表达热图：识别出一个同步成熟的关联基因模块。热图显示了与SlERF-RD1具有高转录塑性和协同作用的顶级基因，包括与细胞壁相关的候选基因Solyc01g108880。
d. 成熟诱导表达的实证验证：在MG、BR和RR阶段对SlERF-RD1转录本丰度进行qRT-PCR分析。相对表达水平相对于SlActin进行标准化，MG阶段被用作计算成熟阶段变化的校准器。
e. 功能富集分析：GO和KEGG通路富集显示SlERF-RD1共表达模块，主要与苯丙素生物合成和细胞壁修饰相关（FDR=1.2e-4）。数据（D）代表三个生物学重复的平均值±标准差。星号表示基于Student’s t检验的显著差异（**P<0.01；***P<0.001）。
**发现阶段的一个关键发现是识别出一个与SlERF-RD1高度同步的共表达基因模块**。热图分析显示了一组在发育阶段和生理障碍中表现出几乎相同转录模式的基因（图1c）。该模块基于发育阶段之间的高Pearson相关系数（r≥0.85）定义，表明强烈的转录共调节而非直接的功能相互作用。在相关性最强的伙伴中，我们识别出Solyc01g108880，这是一个共表达候选基因，其表达谱表明可能与细胞壁相关过程和次级代谢有关。该模块内的高转录协同作用表明SlERF-RD1作为一个中心枢纽，协调下游效应基因的表达，这些基因对于成熟转变是必需的。通过qRT-PCR在三个典型成熟阶段对这种计算机预测进行了实证验证。与我们的计算预测一致，SlERF-RD1的相对表达随着成熟的进展而逐渐上调。具体来说，以MG阶段为基线（赋值为1），SlERF-RD1的转录水平在破裂期（BR）显著增加了约1.5倍，随后在RR阶段达到2.1倍的峰值（图1d；P<0.01）。尽管诱导幅度适中，但从MG到RR的稳定增加强化了SlERF-RD1作为成熟相关转录程序的组成成分的作用。为了阐明这种成熟相关诱导的功能意义，我们对SlERF-RD1共表达模块进行了GO和KEGG富集分析。分析显示了参与苯丙素生物合成和细胞壁修饰的基因的高度特异性富集，特别是那些针对半纤维素和果胶代谢途径的基因（FDR=1.2e-4）。这些多层次的生物信息学和实证特征共同确立了SlERF-RD1作为协调番茄果实成熟和乙烯信号下游结构完整性的关键调控节点。需要注意的是，这种关联基于共表达分析，并不意味着直接的功能或调控关系。
**SlERF-RD1过表达系的生成和分子验证**
为了研究SlERF-RD1在番茄果实发育和成熟中的功能作用，我们开发了在组成型CaMV35S启动子控制下过表达SlERF-RD1全长CDS的稳定转基因系（图S3a）。通过使用载体特异性引物进行基因组PCR，在五个独立的T0转化体（品系#2、#4、#5、#6和#7）中确认了T-DNA的稳定整合，得到了预期的634 bp扩增子（图S3b）。为了评估过表达的程度，我们通过qRT-PCR量化了转录本丰度。三个独立品系（#4、#5和#7）显示出SlERF-RD1的显著上调，表达水平相对于野生型（WT）植物增加了4到11倍（图S3c）。特别是，品系#5和#7表现出最高的转录积累（P<0.001），而品系#4的过表达水平虽然显著但相对较低（P<0.001）。基于这些分子特征，选择了这三个品系进行进一步的表型和生理特性研究。
**SlERF-RD1重新配置植物结构并加速花期转换**
为了评估SlERF-RD1的更广泛发育影响，我们首先表征了过表达（OE）系的营养和生殖生长模式。发芽后30天（DAG）的表型监测显示，SlERF-RD1的组成型过表达显著重新配置了番茄植物的结构，导致更紧凑和强健的生长习性（图2a）。定量分析确认OE系的植株高度比野生型（WT）植物减少了20-26%（P<0.01；图2b）。值得注意的是，这种垂直伸长的减少伴随着横向扩展的显著增加；OE系的预计冠层覆盖面积比WT大10-22%（图2c和d），表明生物量分配向横向发育的战略性转变。
**SlERF-RD1过表达加速了向生殖发育的转变**
与观察到的结构变化平行，SlERF-RD1-OE系表现出显著加速的生殖发育，比野生型（WT）提前4-7天达到开花期（P<0.05；图3a）。这种早熟开花伴随着生殖输出的显著增强；前三个花序上的花朵数量显著增加，OE系平均每个花序有26.3-28.7朵花，而WT为20.2±2.3朵（P<0.05；图3b）。有趣的是，虽然总花朵数量增加，但OE系的单个花朵面积显著减小（WT：195.7±22.1 mm² vs.OE：66.2–86.3 mm²；P < 0.001；图3c），这种权衡在更紧凑的花形态中得到了视觉上的体现。为了阐明这种异时性变化的转录基础，我们量化了顶端分生组织中的关键调控标记物（14–18 DAG）。编码开花基因SINGLE FLOWER TRUSS (SFT) 在所有OE品系中显著上调（P < 0.05；图3d），而花萼发育调节基因MACROCALYX (MC) 则受到强烈抑制，其转录水平降低了多达39%（P < 0.05；图3d）。总体而言，这些发现表明SlERF-RD1通过调节SFT-MC调控轴来促进早期开花并增加花密度，同时限制器官扩展。图3 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像 SlERF-RD1促进早期开花转变并提高繁殖生产力，同时限制花器官的大小。a WT和SlERF-RD1-OE品系（#4、#5和#7）之间花形态和开花时间的视觉比较，显示转基因植物的花结构更为紧凑。b 对前三个花序上产生的花朵总数进行定量分析，突出OE品系中繁殖产量的显著增加。c 通过qRT-PCR测定顶端分生组织（14–18 DAG）中开花基因SFT和花萼发育调节基因MC的相对mRNA丰度。数据代表平均值±标准差（n = 10用于表型测量；n = 3个生物学重复用于基因表达分析）。星号表示基于Student’s t检验的统计显著性（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001）。SlERF-RD1过表达会推迟成熟进程并调节果实品质属性。为了评估SlERF-RD1对番茄成熟生理特征的影响，我们进行了多参数成熟动态分析。SlERF-RD1过表达最显著的影响是外部颜色转变的显著延迟；虽然野生型（WT）果实达到了红熟（RR）阶段的特征性深红色，但所有转基因品系都表现出持续的黄橙色，表明成熟过程不同步（图4a）。与此表型一致，成熟期的乙烯爆发在过表达品系中显著受到抑制。RR阶段定义为破壳后7天，特别评估了SlERF-RD1的抑制效应是仅仅是成熟高峰的暂时延迟还是对成熟过程的持续抑制。此时，WT果实的乙烯产生量为29.1 ± 1.3 nL g⁻¹ h⁻¹，而SlERF-RD1-OE品系的乙烯产生量减少了40–47%，范围为15.3 ± 0.9至17.8 ± 1.1 nL g⁻¹ h⁻¹（P < 0.001；图4b）。乙烯产生的显著减少可能是成熟过程整体减缓的主要驱动因素。此外，转基因品系的果实结构完整性显著增强。对成熟阶段果实硬度的定量评估显示，虽然WT果实迅速软化，但SlERF-RD1-OE品系的抗穿透性明显更高（图4c）。即使在RR阶段，OE果实也显著比WT更硬（P < 0.001），表明SlERF-RD1可能作为细胞壁分解机制的负调节因子。使用CIELAB色度参数进一步量化了色素变化。对于L*参数（图4d），在破壳（BR）阶段没有观察到统计学上的显著差异，如图中的“ns”所示，而在成熟绿色（MG）和红熟（RR）阶段则明显检测到差异，这与统计分析一致。有趣的是，尽管OE果实的宏观外观在RR阶段明显呈淡橙色（图4a），但色度数据显示视觉表型与仪器读数之间存在脱节。OE果实的a*值（绿色到红色轴）略高于或与WT相当（图4e）。相反，b*值（黄色度）在转基因品系中显著较低（图4f）。这种明显的视觉-色度悖论是由OE品系中不同的成熟延迟引起的。果实切片显示，虽然内部组织像WT一样积累了红色色素，但外部表皮和外果皮仍然明显较淡（图S4）。Minolta CR-400色度计的强氙气闪光穿透了浅色的外层，检测到内部的红色色素，从而得到较高的a*读数。然而，在环境光下的视觉感知主要捕捉到来自淡色表皮的表面反射，导致感知到的橙色/淡色表型。此外，显著降低的b*值可能反映了表皮黄色类黄酮的积累受损。总体而言，这些数据表明SlERF-RD1过表达导致果实色素沉着的异步、组织特异性延迟。虽然没有进行纵向储存试验，但乙烯产生量减少了40–47%，并且在破壳后7天内果实硬度显著保持，这可能是SlERF-RD1-OE品系延长保质期的潜在生理指标。除了这些生理变化外，SlERF-RD1还积极调节了果实内部品质。在RR阶段分析主要代谢物时，发现可溶性固形物含量（°Brix）在OE品系中一致增加，范围为5.2%至5.8%，而WT为4.6%。值得注意的是，抗坏血酸（维生素C）水平显著升高，OE果实积累了高达21.2 mg/100 g FW，比WT增加了约43%（P < 0.05）。总体而言，这些发现表明SlERF-RD1调控了一个优先考虑保质期和营养密度的独特成熟过程。图4 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像 SlERF-RD1-OE果实成熟过程中的生理和色度特征。a WT和OE果实的代表性表型，显示在红熟阶段外部色素沉着延迟。b RR阶段的乙烯产生率（nL g⁻¹ h⁻¹），显示OE品系中的生物合成显著减少。c 成熟绿色（MG）、破壳（BR）和红熟（RR）阶段的硬度变化。CIELAB色度坐标代表d L*（亮度）、e a*（红色度）和f b*（黄色度）。数据代表平均值±标准差。星号表示统计显著性（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001，Student’s t检验）。为了阐明SlERF-RD1-OE品系中观察到的成熟减弱和果实硬度增强的分子基础，我们量化了参与细胞壁分解、类胡萝卜素生物合成和番茄果实主要调控层次的关键基因的表达。OE品系中硬度的增强得到了主要细胞壁修饰酶显著下调的强烈支持。虽然SlPG2A在成熟绿色（MG）阶段的表达保持不变，但在破壳（BR）阶段显著降低，三个OE品系的表达水平降低了0.58–0.69倍（图5a）。这种抑制在整个红熟（RR）阶段持续存在，特别是在品系#7中降低了0.72倍，表明SlERF-RD1主要在成熟开始时限制果胶降解。同样，SlEXP1在BR（0.63–0.78倍）和RR阶段（0.53–0.61倍）也显著下调，表明在整个成熟过程中持续抑制细胞壁松弛（图5b）。延迟的色素沉着表型通过SlPSY1和主要调节因子SlRIN的减弱得到了分子验证。SlPSY1的表达从BR阶段开始显著抑制（0.55–0.64倍），并在RR阶段始终低于野生型（WT）（0.74–0.83倍）（图5c）。此外，SlRIN在所有成熟阶段都表现出系统性下调，其中在BR阶段的抑制最为显著，表达水平相对于WT降低了0.59–0.68倍（图5d）。这些发现表明SlERF-RD1通过作用于RIN介导的调控回路的上游来延迟成熟。图5 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像 WT和SlERF-RD1-OE果实中成熟相关途径的转录重编程。通过qRT-PCR确定了参与细胞壁分解（a、b）、类胡萝卜素生物合成（c）和成熟调控层次（d、e）的基因在成熟绿色（MG）、破壳（BR）和红熟（RR）阶段的相对mRNA丰度。a SlPG2A（Solyc03g111690）b SlEXP1（Solyc06g051800）c SlPSY1（Solyc03g031860）d SlRIN（Solyc05g012020）e Solyc01g108880（共表达的目标基因）。转录水平以SlActin（Solyc03g078400）作为内部对照进行标准化。对于每个发育阶段，WT的表达水平设为1.0。数据代表三个生物学重复的平均值±标准差。不同的字母表示WT和OE品系在每个阶段之间的统计显著差异（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；Student’s t检验）。有趣的是，共表达的伙伴Solyc01g108880在SlERF-RD1过表达时表现出独特的双相表达模式。在MG阶段有轻微的诱导（1.15–1.18倍），在BR阶段观察到短暂的下降（0.64–0.73倍）。然而，在RR阶段，其在所有OE品系中的表达显著上调，达到WT水平的1.32倍（图5e）。这种晚期诱导与PG2A和EXP1的抑制同时发生，表明Solyc01g108880可能与维持细胞壁的过程有关。然而，这种解释仅基于表达模式，需要进一步的功能验证。为了探索SlERF-RD1在成熟级联中的潜在调控机制，我们使用PLACE数据库对五个关键基因的2000 bp上游区域进行了全面的顺式作用元件分析：主要调节因子SlRIN、类胡萝卜素基因SlPSY1、细胞壁效应因子SlPG2A和SlEXP1以及SlERF-RD1本身。我们的分析显示，在所有五个启动子中都存在高密度的典型AP2/ERF结合基序，特别是GCC-boxes（AGCCGCC）和W-boxes（TGACY/TTGAC）（图6）。图6 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像 SlERF-RD1及其主要调控因子的比较顺式作用元件景观。通过PLACE数据库在SlERF-RD1、SlRIN、SlPSY1、SlPG2A和SlEXP1的2000 bp上游区域识别的调控基序的空间分布示意图。彩色标记表示高置信度结合位点：橙色三角形代表AP2/ERF结合位点（W-box/GCC-box），紫色方块表示乙烯响应元件（ERE），绿色菱形标记发育调节因子（DOF/ARR1）。在SlRIN（Solyc05g012020）启动子中，我们在−1765 bp处识别出一个关键的干旱响应元件（DRE/CRT，RCCGAC）和多个W-box基序（例如，在−671和−1112 bp）。这些高亲和力位点的存在表明SlERF-RD1可能直接与该主要调节因子结合以抑制核心成熟层次。同样，SlPSY1（Solyc03g031860）启动子包含多个ERF结合位点，包括多个WBOXNTERF3基序（例如，在−480、−1,035和−1,908 bp），为过表达果实中观察到的类胡萝卜素流量改变和外部色素沉着延迟提供了分子解释。关于果实结构完整性，我们在SlPG2A（Solyc10g080210）启动子中检测到一个核心GCC-box（AGCBOXNPGLB），它位于转录起始位点（TSS）仅−141 bp处。这个基序与TSS的接近，加上众多的W-boxes（例如，在−813和−855 bp），支持了一种通过限制果胶降解来维持硬度的转录抑制模型。此外，在SlEXP1（Solyc06g051800）启动子中，识别出多个保守的W-box基序和乙烯响应元件（ERELEE4，例如，在−1,722和−1,984 bp），为其在OE品系中转录水平降低（高达0.53倍）提供了理论框架，突出了SlERF-RD1如何限制细胞壁松弛。此外，SlERF-RD1（Solyc02g077790）启动子本身包含多个乙烯响应元件（ERELEE4）在−843和−1,360 bp，以及发育基序（DOFCORE和ARR1AT），与其通过乙烯的强烈诱导及其在协调植物结构中的多效作用一致。总体而言，这些计算机模拟发现（图6）加强了SlERF-RD1作为战略发育协调者的作用，它通过靶向关键层次和效应节点直接微调果实成熟和软化。番茄果实成熟的协调是一个复杂的发育过程，由转录因子和植物激素乙烯的层次网络控制（Giovannoni 2004）。在这项研究中，我们鉴定并表征了SlERF-RD1（Solyc02g077790），它是AP2/ERF超家族的一个关键成员，它作为成熟的负调节因子，同时增强果实品质和结构完整性。我们对SlERF-RD1的表征进一步突出了成熟信号网络的复杂性。乙烯介导的成熟级联并不是孤立的，而是与其他多种激素信号（如细胞分裂素（Chen等人2025b）和褪黑素（Xing等人2025）深度整合的。在这种广泛的相互作用中，SlERF-RD1可能作为一个关键枢纽，微调乙烯反应，同时保持果实结构完整性和植物结构。鉴定主要调节因子是理解番茄果实成熟复杂转录景观的基石。在这项研究中，我们的多层次生物信息学流程（图1）将SlERF-RD1（Solyc02g077790）确定为成熟机制的核心组成部分。SlERF-RD1整合到乙烯依赖的信号传导中，体现在其对外源乙烯的高敏感性和在经典成熟突变体（如rin、nor和Gr）中的差异调节（图1a）。这些表达谱是关键成熟相关转录因子的特征，包括SlERF.F12（Deng等人，2022年）和SlLBD33（Hao等人，2015年），它们在成熟开始时充当转录开关。我们在计算机模拟分析中的一个关键发现是SlERF-RD1与Solyc01g108880之间的高转录协同作用（图1c）。在果腔和胎盘组织中观察到的强正相关（R = 0.91）表明SlERF-RD1可能在向红熟期过渡期间协调一个专门的调控模块。在番茄中，果腔组织和胎盘是乙烯生物合成的主要场所（Alba等人，2005年）；因此，SlERF-RD1在这些组织中的空间富集强烈暗示它参与了触发系统性成熟爆发的早期信号事件。此外，GO和KEGG富集结果突出了细胞壁修饰和次级代谢途径，为我们的生理和分子发现提供了功能路线图，这些发现后来在过表达系中得到了验证。
SlERF-RD1的过表达导致了一个独特的形态变化，其特征是冠层显著更加紧凑，植株高度降低（图2）。在番茄中，植株结构受到不定型和定型生长信号之间平衡的严格控制，这主要由AP2/ERF和MADS-box家族的成员介导（Shinozaki等人，2018年）。我们在过表达系中观察到的冠层直径减小表明SlERF-RD1可能干扰节间伸长或侧枝形成，这是现代园艺中越来越关注的一个特性，以实现高密度种植并提高光截获效率。值得注意的是，这种植株的紧凑性与花期提前有关，表现为与野生型相比，过表达系的花期更早（图3）。这种异时性发育进一步得到了SlSFT（开花基因）上调和SlMC下调的支持（图3c）。在番茄中，SINGLE FLOWER TRUSS（SFT）基因是花诱导的主要驱动因子，而MACROCALYX（MC）参与花序结构和萼片发育（Molinero-Rosales等人，2004年；Xing等人，2022年）。虽然经典的MC突变通常会导致萼片增大，但我们的过表达系却意外地表现出整体花径减小。我们认为，这种花面积的减少并非仅仅是MC抑制的直接形态后果，而是由于SFT-MC轴过早激活导致的发育权衡。高度加速的花分生组织承诺可能限制了适当细胞增殖所需的时间窗口。因此，这些核心基因的拮抗表达模式表明SlERF-RD1作为一个战略性的发育协调者，重新配置植株结构，以优先考虑快速繁殖成功和早期结果形成，而不是长期的营养扩展。其他ERF也被报道具有类似的作用，它们整合激素信号以快速调整从叶片生产到花形成的转换时间。
番茄果实成熟是一个气候成熟过程，其特征是自催化乙烯的大量产生（System II），这触发了下游的成熟效应器（Alba等人，2005年）。我们的生理数据揭示，SlERF-RD1的过表达导致乙烯排放显著减少（40-47%），并且果实颜色转变显著延迟（图4）。这种抑制效应进一步得到了SlRIN（MADS-RIN）和SlPSY1显著下调的证实（图5c，d）。SlRIN是一个在成熟层次结构中占据中心位置的 master 转录因子，直接调控参与乙烯生物合成和类胡萝卜素积累的基因（Huang等人，2022年）。在SlERF-RD1过表达系中，特别是在Breaker阶段，SlRIN转录水平的显著抑制表明SlERF-RD1作为一个上游转录抑制因子。通过减弱RIN介导的调控节点，SlERF-RD1有效地延迟了成熟程序的开始。这进一步反映在SlPSY1的表达减少上，SlPSY1是类胡萝卜素途径中的限速酶（Fray和Grierson，1993年）。PSY1水平降低与色素沉着表型延迟之间的相关性（图4a）证实SlERF-RD1通过转录控制类胡萝卜素生物合成通量来调节果实颜色。虽然SlPSY1下调表明类胡萝卜素生物合成通量减少，但我们不能排除在没有直接代谢物测量的情况下类胡萝卜素分配发生变化的可能性。因此，这些结果应被解释为类胡萝卜素代谢的改变，而不是特定色素组成的确定变化。与其他负调控因子（如SlERF.F12（Deng等人，2022年）类似，SlERF-RD1似乎作为一个精细调节机制，防止成熟相关途径的过早激活。在番茄育种中，最显著的挑战之一是将软化过程与其他成熟属性分离，以延长保质期而不损失风味。我们的结果表明，SlERF-RD1的过表达导致果实硬度显著提高（图4c），即使在完全成熟阶段也是如此。这种表型直接与两种主要细胞壁修饰酶的转录抑制有关：SlPG2A（多聚半乳糖醛酸酶）和SlEXP1（膨胀素）（图5a，b）。SlPG2A负责中间层中的果胶降解，这一过程传统上被视为组织软化的首要驱动因素（Smith等人，1988年）。同样，SlEXP1通过破坏纤维素微纤维和半纤维素之间的氢键来促进细胞壁松弛（Brummell等人，1999年）。这些效应子在过表达系中的显著下调解释了采后储存期间观察到的结构完整性。SlERF-RD1过表达表型的一个关键方面是其异步成熟程序。在几个特征明确的成熟缺陷突变体中，如rin和nor，时间进程（例如，Breaker后的天数）通常与成熟相关生理过程的显著延迟或部分停滞有关，包括乙烯产生、色素积累和软化（Giovannoni 2004年；Klee和Giovannoni 2011年；Pech等人，2012年）。相比之下，SlERF-RD1的过表达似乎分离了特定的成熟模块。虽然外部色素沉着和细胞壁解体受到显著抑制，但内部代谢成熟，如内部番茄红素的成功积累、可溶性固形物（°Brix）和抗坏血酸的积累，却进展良好。这种有针对性的分离导致了一个独特的“坚实成熟”表型，而不是均匀的发育延迟。因此，SlERF-RD1提供了一个独特的遗传工具，用于剖析番茄成熟的调控分支，成功优先考虑了采后结构完整性和营养密度，而不影响主要的代谢准备。类似的作用也被报道用于其他ERF，它们整合激素信号以快速调整从叶片生产到花形成的转换时间。
番茄果实成熟是一个气候成熟过程，其特征是自催化乙烯的大量产生（System II），这触发了下游的成熟效应器（Alba等人，2005年）。我们的生理数据揭示，SlERF-RD1的过表达导致乙烯排放显著减少（40-47%），并且果实颜色转变显著延迟（图4）。这种抑制效应进一步得到了SlRIN（MADS-RIN）和SlPSY1显著下调的证实（图5c，d）。SlRIN是一个在成熟层次结构中占据中心位置的 master 转录因子，直接调控参与乙烯生物合成和类胡萝卜素积累的基因（Huang等人，2022年）。在SlERF-RD1过表达系中，特别是在Breaker阶段，SlRIN转录水平的显著抑制表明SlERF-RD1作为一个上游转录抑制因子。通过减弱RIN介导的调控节点，SlERF-RD1有效地延迟了成熟程序的开始。这进一步反映在SlPSY1的表达减少上，SlPSY1是类胡萝卜素途径中的限速酶（Fray和Grierson，1993年）。PSY1水平降低与色素沉着表型延迟之间的相关性（图4a）证实SlERF-RD1通过转录控制类胡萝卜素生物合成通量来调节果实颜色。虽然SlPSY1下调表明类胡萝卜素生物合成通量减少，但我们不能排除在没有直接代谢物测量的情况下类胡萝卜素分配发生变化的可能性。因此，这些结果应被解释为类胡萝卜素代谢的改变，而不是特定色素组成的确定变化。与其他负调控因子（如SlERF.F12（Deng等人，2022年）类似，SlERF-RD1似乎作为一个精细调节机制，防止成熟相关途径的过早激活。在番茄育种中，最显著的挑战之一是将软化过程与其他成熟属性分离，以延长保质期而不损失风味。我们的结果表明，SlERF-RD1的过表达导致果实硬度提高（图4c），即使在完全成熟阶段也是如此。这种表型直接与两种主要细胞壁修饰酶的转录抑制有关：SlPG2A（多聚半乳糖醛酸酶）和SlEXP1（膨胀素）（图5a，b）。SlPG2A负责中间层中的果胶降解，这一过程传统上被视为组织软化的首要驱动因素（Smith等人，1988年）。同样，SlEXP1通过破坏纤维素微纤维和半纤维素之间的氢键来促进细胞壁松弛（Brummell等人，1999年）。这些效应子在过表达系中的显著下调解释了采后储存期间观察到的结构完整性。SlERF-RD1过表达表型的一个关键方面是其异步成熟程序。在几个特征明确的成熟缺陷突变体中，如rin和nor，时间进程（例如，Breaker后的天数）通常与成熟相关生理过程的显著延迟或部分停滞有关，包括乙烯产生、色素积累和软化（Giovannoni 2004年；Klee和Giovannoni 2011年；Pech等人，2012年）。相比之下，SlERF-RD1的过表达似乎分离了特定的成熟模块。虽然外部色素沉着和细胞壁解体受到显著抑制，但内部代谢成熟，如内部番茄红素的成功积累、可溶性固形物（°Brix）和抗坏血酸的积累，却进展良好。这种有针对性的分离导致了一个独特的“坚实成熟”表型，而不是均匀的发育延迟。因此，SlERF-RD1提供了一个独特的遗传工具，用于剖析番茄成熟的调控分支，成功优先考虑了采后结构完整性和营养密度，而不影响主要的代谢准备。
更有趣的是，我们的研究确定了Solyc01g108880作为一个在果实成熟期间表现出明显双相表达模式的强共表达候选基因（图5e）。在MG阶段有适度诱导后，其在BR阶段的表达减少，随后在RR阶段在SlERF-RD1过表达系中上调。虽然这种表达模式表明它可能参与后期成熟过程，但重要的是要强调，仅共表达并不能建立直接的功能或调控关系。因此，SlERF-RD1和Solyc01g108880之间的关联应被解释为一个产生假设的观察结果，而不是调控相互作用的确定证据。未来需要采用功能方法（如功能丧失或获得分析）的研究来确定Solyc01g108880是否在细胞壁动态或其他成熟相关过程中起直接作用。值得注意的是，这种基于共表达的候选基因识别已被广泛用作定义植物转录组研究中调控模块的初始步骤，尽管它需要后续的实验验证。除了结构完整性之外，SlERF-RD1的过表达还积极影响了果实的内部质量参数。我们的数据显示，在红熟期，过表达系的SSC/°Brix和维生素C水平显著增加（图S3）。在许多成熟延迟的番茄突变体中，风味和营养积累通常呈负相关（Beckles 2012年）。然而，SlERF-RD1似乎绕过了这种质量权衡。识别潜在的转录靶标是理解控制果实成熟的调控网络的关键步骤。在这项研究中，我们的计算机模拟分析表明SlERF-RD1可能通过靶向几个关键成熟和软化相关基因的启动子来直接作为分子抑制因子。在SlRIN启动子内−1765 bp处存在一个高置信度的DRE/CRT元件，表明SlERF-RD1有可能在上游水平调节成熟层次结构。这种可能的相互作用可能为我们在过表达系中观察到的成熟程序的系统性减弱提供分子基础，可能反映了其他ERF家族成员对主调控因子的抑制作用。SlERF-RD1过表达系中果实硬度的维持可能进一步由SlPG2A和SlEXP1的启动子结构解释。我们在SlPG2A启动子中识别出一个核心GCC-box，位于转录起始位点非常接近的位置（−141 bp），以及SlEXP1启动子内的多个W-box基序。这些AP2/ERF特异性结合位点的接近性和密度表明SlERF-RD1可能通过直接转录抑制来限制果胶降解和细胞壁松弛。此外，在SlERF-RD1启动子中识别出的多个乙烯响应元件（ERELEE4）可能解释了它对乙烯的快速诱导，可能形成了一个调节果实软化速度的负反馈循环。总的来说，这些发现支持了一个模型，其中SlERF-RD1可能作为一个战略性的发育协调者，可能整合激素信号来精细调节果实结构完整性和成熟之间的平衡。
SlERF-RD1过表达果实的非典型橙色/苍白外部表型引发了关于色素生物合成的有趣问题。虽然宏观外观看起来延迟，但横截面显示红色色素在内部组织中成功积累。因此，外部橙色外观可能不是由类胡萝卜素通量的全局变化驱动的，而是由外层果皮和表皮的异步成熟延迟引起的。这种组织特异性的延迟伴随着表皮黄色黄酮类的明显减少，导致了这种非典型的视觉颜色。未来的组织特异性代谢分析将有必要全面绘制这种表面色素延迟的生化性质。较高的°Brix水平表明，气候成熟爆发的延迟允许果实在果实内部有更长的碳水化合物转运和积累期。此外，维生素C水平的升高表明SlERF-RD1可能调节抗氧化机制，可能是对改变的乙烯信号的响应，类似于在高质量番茄基因型中观察到的代谢变化（Stevens等人，2007年）。总之，我们提出了一个调控模型，其中SlERF-RD1作为一个发育协调者。通过作为主调控因子（如SlRIN）和细胞壁效应器（包括SlPG2A和SlEXP1）的转录抑制因子，它延迟了果实软化和色素沉着的快速阶段。虽然SlERF-RD1的过表达成功提高了果实硬度（°Brix和抗坏血酸升高），但我们承认目前存在显著的多效性权衡，这限制了其直接的商业应用。最值得注意的是，加速的花期转变和过早的分生组织承诺限制了细胞增殖，不仅导致花朵变小，也导致成熟果实相应变小。这种整体果实大小和产量的减少代表了一个关键的商业瓶颈。此外，虽然主要代谢物得到了改善，但SlERF-RD1对复杂风味挥发物生物合成的影响仍然未知，需要未来的全面代谢组学分析。因此，我们不建议将SlERF-RD1的过表达作为立即的农艺解决方案，而是认为这个转录因子作为一个关键的分子枢纽。未来的精准育种策略，如CRISPR/Cas9介导的启动子编辑，可以用来精细调节其表达水平，旨在将理想的延迟软化特性与果实大小的负面发育惩罚分离。重要的是要考虑，本研究中的SlERF-RD1的功能表征是使用Crocker遗传背景进行的。虽然这个品种非常适合稳定转化和受控的表型分析，但转录调控和发育反应可能因不同的番茄基因型而异。鉴于计算机模拟分析基于来自多个遗传背景的公开可用数据集，不能完全排除潜在的基因型特异性效应。因此，这里描述的SlERF-RD1的调控作用应在Crocker背景的背景下解释，并需要在不同品种中进行进一步验证，以评估其更广泛的适用性。虽然过表达分析提供了关于SlERF-RD1作为成熟负调控因子的调控潜力的重要见解，但它并没有完全解决其内源性功能。如CRISPR/Cas9介导的敲除或敲低策略等功能丧失方法对于验证SlERF-RD1对成熟控制和植物发育过程的直接贡献是必要的。在目前的研究中，优先考虑了过表达，以评估SlERF-RD1作为成熟网络中的调控“刹车”的潜力。未来需要整合互补的功能丧失方法的研究，以全面阐明其生物学功能并确认我们的发现所建议的因果关系。
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