梁晓宇|陈子怡|刘思宇|魏月|李志轩| Mou云英|刘东新|李瑶|郝晓鹏|黄璐琪|董国柱
中国中医科学院中药资源中心，北京，100700，中国
**摘要：**
**民族药理学相关性**
LingGui QiHua-3 decoction（LGQH-3）是一种用于治疗伴有液体潴留的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的临床配方。作为Zhenwu Decoction的衍生物，它体现了温“阳”、促进“气”转化以及排水以调节心肾液体失调的民族药理学原理。然而，其药理机制尚不清楚。
**研究目的**
本研究旨在确定LGQH-3是否通过恢复心肾液体代谢来预防HFpEF，并阐明参与协调心脏和肾脏液体调节的潜在分子机制。
**材料与方法**
通过高脂饮食和L-NAME给药在小鼠中诱导HFpEF。通过超声心动图、运动耐受性、组织病理学和生化检测评估小鼠模型。通过UHPLC-MS和网络药理学鉴定候选通路，并通过RT-qPCR、WB、ELISA和免疫组化进行验证。进一步在AC16心肌细胞和HK-2肾小管上皮细胞中检查机制相关性。
**结果**
LGQH-3改善了舒张功能和工作耐受性，减轻了心脏肥大/纤维化和肾脏损伤，减少了肺充血，并增加了尿量。从机制上讲，LGQH-3抑制了病理性的p38 MAPK激活，并使心脏AQP4和肾脏AQP2的表达恢复正常。同时，它恢复了PCSK6/Corin轴并重新激活了利钠肽信号通路，从而重建了液体平衡。体外发现与体内结果一致，p38 MAPK的药理抑制进一步支持了PCSK6/Corin-p38 MAPK/AQPs级联反应的关键作用。
**结论**
LGQH-3通过调节PCSK6/Corin-p38 MAPK/AQPs网络来恢复液体平衡，从而缓解HFpEF中的心肾功能障碍，为其传统应用和临床转化提供了药理学依据。
**1. 引言**
射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）已成为主要的心力衰竭（HF）类型，这主要是由于全球老龄化和代谢紊乱患病率的增加（Kapelios等人，2023年）。除了舒张功能障碍和全身炎症外，HFpEF还以神经激素激活和钠-水处理障碍为特征，这导致持续的容量超负荷和不良的心肾相互作用，进一步恶化肾功能并复杂化临床管理（Tuttle等人，2024年；Hamo等人，2024年；Noels等人，2025年）。虽然利尿剂仍然是治疗的基石（Heidenreich等人，2022年），但其疗效受到个体间差异、频繁的利尿剂抵抗以及过度使用利尿剂导致血栓形成的限制（Wu等人，2024年；Miller等人，2023年）。鉴于难治性容量超负荷的晚期HFpEF日益增多，合并症通常需要转向以症状为中心的姑息性护理（Tomasoni等人，2022年），安全地恢复体液平衡仍然是一个核心且未满足的治疗优先事项。
传统中医（TCM）提供了整体、多靶点的方法来填补这一治疗空白。在经典中医理论中，心脏与“火”相关，而肾脏与“水”相关，它们的动态平衡对于正常的“气”转化和液体平衡至关重要（Liang等人，2021年；Chen等人，2022年），这一概念与现代心肾生理学一致（Noels等人，2025年）。基于这一范式，开发了源自《伤寒杂病论》（东汉时期）的Linggui Qihua（LGQH）系列。先前的研究表明，LGQH-1和LGQH-2对早期无明显水肿的HFpEF有益（Shi等人，2023年；Liu等人，2024年；Liu等人，2025年；Qiao等人，2024年）。为了更好地应对以持续充血和全身液体失调为特征的晚期HFpEF，从传统用于温肾“阳”、恢复“气”转化和促进水分代谢的Zhenwu Decoction中开发了LGQH-3（Xu等人，2024b）。在这个优化配方中，用红芍根（Radix Paeoniae Rubra）替代了白芍根（Radix Paeoniae Alba）以促进血液循环和消除瘀血，这与中医关于慢性液体障碍中“血-水相互依赖”的概念一致。添加了肉桂（Cinnamomum cassia Presl）以温经络并帮助“阳”转化，从而促进液体流动。加入山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）以滋养肾脏并稳定“阳”的根基，支持长期的液体代谢调节。这些修改符合强调“温阳”和“调节水”的既定民族药理学原理，同时进一步结合“活血”以更好地适应伴有慢性充血和心肾参与的心力衰竭表型。药理学研究表明，这些草药中的生物活性成分具有心脏保护、抗炎和抗纤维化作用（Deng等人，2023年；Zhang等人，2019年；Tan等人，2020年），为这种民族药理学优化提供了机制支持。
在HF的分子水平上，病理性的液体潴留和心肾重塑由不同的信号网络调控。失调的p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号通路导致心肌纤维化、炎症损伤和组织水肿（Wang等人，2025年；Zheng等人，2023年）。一种机制可能涉及水通道蛋白家族（AQPs）的异常调节，这些蛋白在心脏、肾脏和其他组织中广泛表达（Bill，2024年）。在病理应激条件下，p38 MAPK激活已被证明会促进AQP失调，包括心脏AQP4和肾脏AQP2，从而加重组织水肿和器官损伤（Sun等人，2024年；Li等人，2025b）。同时，全身性内分泌利钠作用依赖于Corin，这是一种丝氨酸蛋白酶，可将前房利钠肽（pro-ANP）转化为生物活性的房利钠肽（ANP），促进利钠作用并维持血管平衡（Zhang等人，2022年）。Corin以无活性的酶原形式合成，必须通过前蛋白转化酶subtilisin/kexin-6（PCSK6）进行蛋白水解激活才能发挥这一功能（Li等人，2025a）。在HFpEF中观察到PCSK6/Corin轴下调，导致ANP激活受损、钠潴留和心脏肥大，进一步加剧心肾综合征（Yang等人，2022年；Wu和Chen，2022年；Khoury等人，2021年）。因此，越来越多的证据表明，LGQH-3可能通过调节液体代谢来改善HFpEF相关的心肾功能障碍，但其在大鼠HFpEF中的疗效及其潜在的分子基础仍不清楚。因此，我们假设LGQH-3通过两种协调机制来减轻HFpEF引起的心脏和肾脏损伤：通过PCSK6/Corin通路增强内分泌利钠肽的激活，以及通过调节p38 MAPK/AQPs轴减少局部组织水肿。为了验证这一假设，本研究系统地评估了LGQH-3在体内和体外HFpEF模型中的治疗效果。
**2. 材料与方法**
2.1. 化合物、试剂和试剂盒
本研究中使用的化合物包括作为阳性参考药物的达格列净（DAPA）、Nω-硝基L-精氨酸甲酯（L-NAME）、棕榈酸（PA）、葡萄糖（GLU）和精氨酸加压素（AVP）。这些化学品的详细信息见表S1，用于实验程序的试剂和商业可用试剂盒分别列在表S2和S3中。
2.2. LGQH-3的制备
LGQH-3配方由六种草药组成：茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf）、肉桂（Cinnamomum cassia Presl）、党参（Atractylodes macrocephala Koidz.）、红芍根（Radix Paeoniae Rubra）、附子（Radix Aconiti Lateralis Preparata）和山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）。这些草药按4:3:2:4:2:2的重量比例混合，对应于临床剂量比例。所有草药均由中国中医科学院西苑医院药房提供。草药混合物浸泡在水中30分钟，然后用120毫升沸水煎煮两次，每次2小时。两次提取的滤液合并并浓缩至最终密度为3克/毫升，储存在4°C。对于体内给药，LGQH-3的剂量为15或30克/千克体重（BW）。
2.3. 超高压液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析LGQH-3
为了表征LGQH-3的化学成分，采用了超高效液相色谱与四极杆串联质谱（UHPLC-Q Exactive，Thermo Scientific，美国）联用。色谱分离在ACQUITY UPLC BEH C18柱（100毫米×2.1毫米，1.7微米，Waters Corporation，Milford，美国）上进行，温度为40°C，流速为1毫升/分钟。流动相由2%乙腈水溶液（溶剂A）和纯乙腈（溶剂B）组成，程序梯度为：0-0.5分钟，2% B；0.5-3.5分钟，2% B；3.5-7.5分钟，25% B；7.5-11分钟，35% B；11-13分钟，50% B；13-14.4分钟，95% B；14.4-14.5分钟，95% B；14.5-16分钟，2% B。进样量为3微升。质谱在正负离子模式下采集，范围为70-1050 m/z，使用电喷雾离子源。原始数据由Progenesis QI v3.0（Waters Corporation）处理。通过精确质量测量、MS/MS碎片分析、保留时间对齐、数据库搜索和与已发表参考文献比较来鉴定化合物。
2.4. 网络药理学分析
基于UHPLC-MS分析，鉴定出35种潜在的LGQH-3活性成分。使用Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测每种化合物的潜在靶点，概率阈值>0.5。从GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://www.omim.org/）中收集与HFpEF相关的基因，关键词为“射血分数保留型心力衰竭”和“舒张性心力衰竭”。使用Jvenn（https://jvenn.toulouse.inrae.fr/）识别LGQH-3和HFpEF之间的交集靶点。使用Cytoscape 3.9.1构建并可视化组件-靶点网络。使用STRING（https://string-db.org/）对交集靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。使用CytoHubba插件和最大团中心性（MCC）算法对枢纽基因进行排名。在R（v4.5.2）中进行功能富集分析，包括基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG），以探索与交集靶点相关的生物功能和通路。
2.5. 建立HFpEF小鼠模型
从Huafu Kang（北京）生物科技有限公司获得8周大的C57BL/6J雄性小鼠（20 ± 2克，SPF等级）（证书：SCXK（北京）2024-003）。动物在无病原体条件下饲养于中国中医科学院西苑医院的实验动物中心（25°C，50∼60%相对湿度）。所有程序均获得西苑医院动物伦理委员会的批准（批准号：2023XLC024-3）。HFpEF模型的建立方法如前所述（Schiattarella等人，2019年）。适应一周后，小鼠随机分配到正常饮食（ND）或高脂饮食（HFD，60%热量来自猪油）。HFD组同时接受L-NAME（0.5克/升饮用水），并维持HFD直到研究终点，而ND组接受ddH2O。10周后，通过超声心动图证实LVEF>50%以及舒张指标的特征性改变（包括早期二尖瓣流入速度（E）/二尖瓣环早期舒张速度（e’）和心房收缩时E速度（A）比率）来确认模型建立成功。
2.6. 动物分组和药物给药
HFpEF小鼠随机分为几组（图1）：HFpEF-Vehicle、HFpEF-LGQH-3-L（15克/千克体重LGQH-3，等效剂量）、HFpEF-LGQH-3-H（30克/千克体重LGQH-3，两倍等效剂量）和HFpEF-DAPA（1.76克/千克体重DAPA，阳性对照）。剂量基于LGQH-3（每70千克成年体重85克）和DAPA（每70千克成年体重10毫克）的常用临床剂量。使用基于标准转换因子（Km = 37（人类）和Km = 3（小鼠）的体表面积缩放方法计算小鼠的等效剂量。正常小鼠接受等量的蒸馏水。药物每天通过胃灌胃给药一次，持续4周。ND组作为对照组。每天监测体重（BW）、饮水量、尿量和一般行为。在处死前，使用尾袖血压计测量清醒小鼠的收缩压（SBP）和舒张压（DBP），并评估运动耐受性。在异氟醚麻醉下进行超声心动图检查。收集血液、心脏、肺和肾脏组织以进行后续检测。
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**图1. 动物实验示意图**
为了制备含药血清，8周大的Sprague-Dawley雄性大鼠（180–220克，SPF等级）每天通过胃灌胃接受LGQH-3（10.5克/千克）7天。最后一次给药后1小时，在麻醉状态下通过腹主动脉采集血液。血清分离、热灭活（56°C）、过滤（0.22微米）并储存在-80°C。有效浓度通过细胞活力测定验证。
2.7. 心脏功能的超声心动图评估
使用Vevo 3100高分辨率微超声系统（FUJIFILM VisualSonics，多伦多，加拿大）和21 MHz MX 250探头在轻度异氟醚麻醉下进行经胸超声心动图检查。图像捕获和分析使用Vevo LAB软件（v 5.7.0）进行。结构指标包括左心室质量（LV Mass）、舒张末期内径（LVIDd）、舒张末期前壁厚度（LVAWd）、舒张末期后壁厚度（LVPWd）和左心室射血分数（LVEF）。舒张功能通过脉冲波多普勒（E, A）和组织多普勒成像（e’）进行评估，随后计算E/A和E/e’比值。每个参数取三个连续心动周期的平均值。
2.8. 运动耐力测试
在经过3天的跑步机适应后，小鼠接受了分级跑步机测试直至疲劳（Columbus Instruments，美国哥伦布）。测试开始时进行4分钟的热身（5米/分钟，20°倾斜角度），然后以2米/分钟的速度持续2分钟，之后每2分钟增加2米/分钟的速度。疲劳定义为尽管有刺激（0.3毫安，3赫兹），但仍与冲击网格持续接触≥10秒，依据Schiattarella等人（2019年）的标准。记录总跑步时间和距离（速度×持续时间）以评估功能能力。
2.9. 血清生化参数测定
血液样本在4°C下以3000转/分钟的速度离心15分钟以获得血清。使用表S3中列出的商业检测试剂盒定量ANP、BNP、S-Cr和BUN的浓度。
2.10. 组织学评估和免疫荧光（IF）染色
收集心脏和肾脏样本，固定、包埋并切片。切片用苏木精-伊红（H&E）和Masson三色染色进行组织学和纤维化分析。使用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，美国马里兰州）定量胶原体积分数（CVF）和血管周围纤维化比率（PFR）。
对于IF染色，切片进行脱蜡、复水，用牛血清白蛋白（BSA）封闭，然后在4°C下过夜孵育一抗：心脏组织用抗AQP4和抗Corin，肾脏组织用抗AQP2和抗Corin。PBS洗涤后，切片与二抗孵育，用DAPI复染，并使用共聚焦显微镜（FV3000，奥林巴斯，日本东京）成像。所有抗体均购自Abcam（英国剑桥）。
2.11. 心脏和肾脏组织中的酶联免疫吸附测定（ELISA）
心脏和肾脏组织在冰冷的裂解缓冲液中匀浆并离心以获得上清液。根据制造商的说明，使用市售的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒定量ANP、钠尿肽受体-A（NPR-A）和磷酸化NPR-A（p-NPR-A）的浓度。上述试剂盒列在表S3中。
2.12. 体外研究
人类AC16心肌细胞和HK-2肾小管上皮细胞（国家生物医学细胞系资源，中国北京）在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，在37°C和5% CO2条件下培养。为了模拟HFpEF相关的损伤，AC16细胞暴露于PA和高葡萄糖培养基中，而HK-2细胞用AVP处理24小时。通过活力测定优化剂量。处理后，细胞被分为五组：CTRL组、Model组、Model-Vehicle组（10%空白血清）和DAPA组（阳性对照组）。处理24小时后，用Calcein-AM测量AC16细胞的通透性，而HK-2细胞中的ANP水平通过ELISA定量。
2.13. RT-qPCR和Western blot（WB）分析
从新鲜心脏、肾脏和培养细胞中提取总RNA，并使用表S3中列出的试剂盒逆转录为cDNA。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为组织的内参，β-actin作为细胞样本的内参。相对mRNA表达通过2−ΔΔCT方法计算。引物序列列在表S4中。对于蛋白质分析，使用针对AQP2、AQP4、Corin、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK, Thr180/Tyr182）、总p38 MAPK、PCSK6、GAPDH和β-actin的抗体进行Western blotting（WB）（抗体详情见表S5）。
2.14. 统计数据分析
统计分析和图表制作使用SPSS 27.0和GraphPad Prism 10.0进行。使用Shapiro–Wilk和Brown–Forsythe检验分别评估正态性和方差同质性。组间差异通过普通单因素分析（ANOVA）进行分析，随后进行Tukey的事后检验进行多重比较。数据以平均值±标准差（SD）表示，P < 0.05被认为具有统计学意义。
3. 结果
3.1. LGQH-3成分的定性分析
在正离子和负离子模式下，UHPLC-MS分析在LGQH-3中检测到2,508个特征，其中35个化合物在化合物筛选和文献基础评估后初步标注。这些化合物可以追溯到配方中的相应草药成分，并与之前报道的这些药用植物的代表性生物活性成分一致。详细信息，包括化合物身份、保留时间、电离模式和草药来源，列在表S6中。基于MS碎片信息和先前的药理学报告，进一步总结并表征了13个具有报道生物学相关性的代表性化合物作为LGQH-3的候选成分（表1）。在正离子模式下，这些化合物包括L(+)-精氨酸、5-羟甲基-2-呋喃醛、mesaconine、fuziline、albiflorin、肉桂醛、苯甲酰mesaconine和poricoic酸B。在负离子模式下，鉴定出的成分包括奎宁酸、没食子酸、paeoniflorin、没食子酰paeoniflorin和cornuside。它们的色谱和光谱特征分别显示在图2和表1中。此外，为了评估LGQH-3的化学稳定性和批次间一致性，在不同给药时间点（给药第1、2和3周以及治疗结束时）收集的两批样品进行了UHPLC-MS分析。结果显示主要成分在所有时间点上具有高度一致性的色谱模式，没有明显变化（图2C∼D），表明LGQH-3配方具有良好的批次间一致性和可重复性。
表1. LGQH-3代谢物的关键MS/MS碎片
| 编号 | 化合物 | m/z | RT (min) | 模式 | 加合物 | 公式 | 相对丰度 | 来源 |
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1 | L(+)-精氨酸 | 175.1 | 190.6 | pos | M+HC6H14N4O2 | 114 | 22 | 14.6 | Poria cocos (Schw.) Wolf / Atractylodes macrocephala Koidz. |
| 2 | 5-羟甲基-2-呋喃醛 | 127.0 | 392.1 | pos | M+HC6H6O3 | 65 | 148 | 2.3 | 5 |
| 3 | Mesaconine | 486.2 | 692.8 | pos | M+HC24H39NO | 94 | 52 | 27.3 | 9 |
| 4 | Fuziline | 454.2 | 80 | 3.5 | pos | M+HC24H39NO | 71 | 148 | 7 | 10 | 3.0 | Radix Aconiti Lateralis Preparata |
| 5 | Albiflorin | 481.1 | 70 | 3.7 | pos | M+HC23H28O | 11 | 49 | 90 | 8 | 7 | 8.9 |
| 6 | 肉桂醛 | 133.0 | 65 | 3.9 | 7 | 9 | 76 | 49.1 | 0 | 2 | 3 | Cinnamomum cassia Presl |
| 7 | 苯甲酰mesaconine | 590.2 | 96 | 5.2 | 13 | pos | M+HC31H43NO | 10 | 26 | 88 | 16 | 3 | 4.4 | Radix Aconiti Lateralis Preparata |
| 8 | Poricoic acid B | 485.3 | 26 | 7.0 | 1 | pos | M+HC30H44O | 54 | 4.0 | 9 | 7 | 28 | 29 | Poria cocos (Schw.) Wolf |
| 9 | 奎宁酸 | 191.0 | 55 | 0.6 | 3 | neg | M-HC7H12O | 69 | 88 | 73 | 17.8 | 2 | 5 | Cornus officinalis Sieb. et Zucc. |
| 10 | 没食子酸 | 169.0 | 13 | 1.2 | 4 | 3 | neg | M-HC7H6O | 51 | 10 | 6 | 13 | 7 | 21 | 4 | Cornus officinalis Sieb. et Zucc. |
| 11 | paeoniflorin | 479.1 | 56 | 3.9 | 7 | neg | M-HC23H28O | 11 | 69 | 15 | 23 | 3.8 | 9 | Radix Paeoniae Rubra |
| 12 | 没食子酰paeoniflorin | 631.1 | 68 | 4.4 | 3 | neg | M-HC30H32O | 15 | 81 | 85 | 58 | 6 | 4 | Radix Paeoniae Rubra |
| 13 | Cornuside | 541.1 | 57 | 4.7 | 6 | neg | M-HC24H30O | 14 | 85 | 58 | 2 | 15.0 | 6 | Cornus officinalis Sieb. et Zucc. |
注：RT：保留时间。
图2. Linggui Qihua 3 decoction (LGQH-3) 成分的定性分析。(A∼B) 基于UHPLC-MS的正离子（A）和负离子（B）模式的LGQH-3总离子色谱图（TIC）。(C∼D) 基于UHPLC-MS的不同时间点的LGQH-3总离子色谱图（TIC）。第1周和第2周对应一个批次，而第3周和治疗结束时对应另一个批次。(E) 13种LGQH-3主要化学成分的化学式。
3.2. 网络药理学表明LGQH-3调节液体平衡，并确定p38 MAPK为HFpEF的核心靶点
在LGQH-3预测的目标和HFpEF相关基因之间共鉴定出238个重叠靶点（图3A）。为了阐明潜在介导LGQH-3治疗效果的关键靶点和通路，对这些交集靶点进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，随后进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。
图3. LGQH-3主要成分的网络药理学分析
(A) 左图：文氏图（药物靶点基因和疾病靶点基因）；右图：成分-靶点网络（粉色菱形代表化合物，蓝色矩形代表基因）。(B) 左图：药物-疾病共同靶点蛋白的PPI分析；右图：使用CytoHubba插件中的MCC算法筛选的前10个靶点。颜色的深度代表靶点的重要性。(C) GO分析。(D) KEGG分析。PPI网络的Hub分析突出显示p38 MAPK作为一个中心节点，以及MAPK1、IL1β、EGFR、FGFR1、NTRK1、TNF、IGF1R、PDGFRB和FGF2（图3B）。重要的是，几个上游炎症介质（例如IL1β和TNF）和受体酪氨酸激酶（例如EGFR/FGFR1/IGF1R/PDGFRB）汇聚在MAPK信号通路，支持p38 MAPK为中心的调节网络与HFpEF中的应激反应和病理重塑相关。GO生物过程术语在MAPK级联的正向调节、管径和血管直径调节以及对氧水平的反应中富集（图3C），共同涉及与血流动力学适应和充血相关重塑的通路。GO细胞成分术语表明主要定位在膜微域/筏和囊泡/分泌颗粒腔室中，与组织液体处理相关的信号和运输过程一致。同时，GO分子功能富集显示蛋白质酪氨酸激酶活性、G蛋白偶联胺受体活性和核受体活性（图3C）。KEGG分析（前25个通路）显示MAPK通路显著富集，以及PI3K–Akt、AGE–RAGE信号在糖尿病并发症中的富集，和HIF-1信号（图3D）。这些结果促使我们选择p38 MAPK作为机制研究的候选核心靶点，并在后续实验中测试LGQH-3是否影响AQP相关的水分运输和参与钠尿肽激活的PCSK6/Corin通路。
3.3. LGQH-3改善HFpEF小鼠的心脏功能障碍和全身液体代谢
基线时，HFpEF小鼠的体重（BW）显著高于正常小鼠。经过4天的治疗，高剂量LGQH-3（HFpEF-LGQH-3-H）显著降低了BW，这种差异从第12天开始在LGQH-3和DAPA处理的小鼠中仍然显著（图4A）。各组之间的饮水量没有显著差异（图4B）。所有小鼠在整个研究期间都保持良好的健康状态，表明LGQH-3的安全性和耐受性。运动测试显示HFpEF小鼠的跑步距离受损，而LGQH-3-H和DAPA治疗有效恢复了这一情况（图4C）。
图4. LGQH-3改善HFpEF小鼠的心脏功能障碍和全身液体代谢。(A∼C) 治疗期间的体重（BW）、饮水量和跑步距离。(D) M模式超声心动图（上）、脉冲波多普勒参数（中）和组织多普勒成像（下）的代表性图像。(E) 左心室（LV）结构（LV质量、LV舒张末期前壁（LVAWd）、LV舒张末期后壁厚度（LVPWd）、LV和舒张末期内径（LVIDd）、LV收缩期（LV射血分数（LVEF）以及舒张功能（二尖瓣早期流入速度（E）/心房收缩速度（A）和E/二尖瓣环早期舒张速度（e’）。(F) 小鼠的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）水平。(G) 心房钠尿肽（ANP）和脑钠尿肽（BNP）水平。(H) 小鼠的肺湿干重量比。(I) 小鼠的24小时尿量。数据为平均值±标准差（n = 6），* P < 0.05，** P < 0.01 vs. CTRL组，# P < 0.05，## P < 0.01 vs. HFpEF-Vehicle组。
HFpEF小鼠表现出明显的心脏重塑，包括LV质量和LVPWd增加，以及功能受损，表现为E/A和E/e’比值升高（图4D∼E）。LGQH-3治疗特别是在高剂量下缓解了结构异常，并改善了心脏功能。此外，HFpEF小鼠的SBP和DBP显著升高，但被LGQH-3降低，效果与DAPA相当（图4F）。HFpEF小鼠的血清ANP和BNP水平显著升高，与疾病进展一致，而两者都被LGQH-3和DAPA降低（图4G）。HFpEF小鼠还表现出肺部充血，表现为肺湿干重量比增加，这被LGQH-3在低剂量和高剂量下显著改善（图4H）。24小时尿量的测量证实了LGQH-3在HFpEF小鼠中的利尿作用（图4I）。综合这些结果表明，LGQH-3通过促进液体清除、减少组织水肿和恢复血流动力学平衡来改善HFpEF小鼠的心肌重塑和心脏功能障碍。
3.4. LGQH-3改善HFpEF小鼠的心脏和肾脏组织病理学并恢复钠尿肽系统损伤
心脏组织的H&E染色显示，与正常小鼠相比，HFpEF小鼠出现了典型的病理改变，包括心室扩张、心肌肥大、肌纤维紊乱、间质扩张和炎症浸润。LGQH-3和DAPA治疗显著缓解了这些组织病理变化，其中高剂量LGQH-3在心肌结构上的改善最为明显。Masson三色染色进一步证实HFpEF心脏中广泛的间质和血管周围纤维化，表现为CVF和PFR升高，而LGQH-3治疗显著减少了心肌胶原沉积（图5A∼B）。同样，H&E染色显示HFpEF小鼠的肾脏组织存在结构异常，如管腔扩张、间质增生和肾小球萎缩。相应地，Masson染色显示肾脏间质中广泛的胶原沉积，表明纤维化。这些病理改变被LGQH-3治疗减轻（图5C）。此外，生化分析显示LGQH-3和DAPA治疗显著降低了HFpEF小鼠升高的BUN和S-Cr水平（图5D）。LGQH-3 改善了心力衰竭伴轻度肥厚（HFpEF）小鼠的心脏和肾脏组织病理学，并恢复了钠尿肽系统的损伤。(A) 在1×和20×放大倍数下用苏木精和伊红（H&E）染色，以及在20×和40×放大倍数下用Masson三色染色的心脏切片。(B) Masson三色染色心脏切片的胶原体积分数（CVF）和血管周围纤维化比率（PFR）。(C) 在20×放大倍数下用H&E和Masson三色染色的心脏切片。(D) 血清肌酐（S-Cr）和血尿素氮（BUN）水平。(E) HFpEF小鼠心脏组织中的ANP、总NAP-R和p-NPR-A水平以及p-NPR-A/总NPR-A比率。(F) HFpEF小鼠肾脏组织中的ANP、总NAP-R和p-NPR-A水平以及p-NPR-A/总NPR-A比率。数据为平均值±标准差（n = 3∼6），* P < 0.05，** P < 0.01 vs. CTRL组，# P < 0.05，## P < 0.01 vs. HFpEF-Vehicle组。鉴于心脏和肾脏损伤的协同改善，我们进一步研究了钠尿肽系统。ELISA分析显示，HFpEF小鼠的心肌ANP和总NPR-A水平显著增加。相比之下，p-NPR-A水平和p-NPR-A/总NPR-A比率显著降低，表明NPR-A激活受损。LGQH-3治疗显著恢复了心脏中的p-NPR-A水平和p-NPR-A/总NPR-A比率（图5E）。在肾脏组织中，尽管ANP表达相对保持不变，但HFpEF小鼠的总NPR-A和p-NPR-A水平降低，p-NPR-A/总NPR-A比率也降低。LGQH-3治疗剂量依赖性地增加了肾脏中的总NPR-A和p-NPR-A水平，并恢复了p-NPR-A/NPR-A比率，同时上调了ANP（图5F）。总体而言，这些结果表明LGQH-3缓解了HFpEF小鼠的心脏和肾脏重塑，这与钠尿肽系统的调节紊乱有关。
3.5. LGQH-3调节HFpEF小鼠心脏和肾脏中的p38 MAPK/AQPs–PCSK6/Corin轴的表达和激活
如图6A所示，免疫荧光（IF）和Western blot（WB）分析显示，HFpEF小鼠的心脏AQP4表达显著上调，表明心肌水分滞留和水肿增加。同时，Corin表达显著抑制，反映了心脏液体稳态受损。进一步分析表明，上游调节因子p38 MAPK的过度激活，表现为磷酸化p38 MAPK与总p38 MAPK的比率增加（p-p38 MAPK/总p38 MAPK）。这种病理性的p38 MAPK激活与心肌重塑加剧有关。相反，作为Corin的关键激活剂的上游蛋白酶PCSK6的表达降低，与Corin的抑制一致。LGQH-3治疗下调了p38 MAPK/AQP4途径的病理激活，同时上调了PCSK6/Corin途径，从而促进了液体转运并恢复了心脏液体代谢平衡。
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图6. LGQH-3调节HFpEF小鼠心脏和肾脏中的p38 MAPK/AQPs–PCSK6/Corin轴的表达和激活。(A) 通过免疫荧光（IF）染色检测水通道蛋白4（AQP4）和Corin的表达，以及小鼠心脏中AQP4、Corin、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、总p38 MAPK和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin-6（PCSK6）的蛋白质表达水平。(B) 通过IF染色检测AQP2和Corin的表达，以及小鼠肾脏中AQP2、Corin、p-p38 MAPK、总p38 MAPK和PCSK6的蛋白质表达水平。(C) 小鼠心脏中Aqp4、Corin、p38 Mapk的相对mRNA表达水平，以及小鼠肾脏中Aqp2、Corin、p38 Mapk和Pcsk6的mRNA表达水平。数据为平均值±标准差（n = 3∼6），* P < 0.05，** P < 0.01 vs. CTRL组，# P < 0.05，## P < 0.01 vs. HFpEF-Vehicle组。同样，在肾脏组织中（图6B），HFpEF小鼠表现出p38 MAPK/AQP2信号通路的过度激活和PCSK6及Corin表达的降低，表明肾脏水分处理能力受损。LGQH-3治疗有效逆转了这些变化，使p38 MAPK/AQP2活性正常化，恢复了PCSK6/Corin信号通路，促进了肾脏液体稳态，最终缓解了HFpEF相关的心肾功能障碍。RT-qPCR结果（图6C）进一步证实了这些蛋白质水平的发现。在HFpEF小鼠中，心脏AQP4以及肾脏AQP2和p38 MAPK的mRNA水平显著升高，而Corin和PCSK6的mRNA表达降低。LGQH-3治疗逆转了这些趋势，降低了AQP4、AQP2和p38 MAPK的表达，同时增强了Corin和PCSK6的转录，与观察到的蛋白质表达模式一致。总体而言，这些证据表明LGQH-3通过协调调节p38 MAPK/AQPs–PCSK6/Corin信号通路来恢复心脏和肾脏的液体代谢。这种调节机制缓解了液体失衡，减少了组织水肿，并促进了HFpEF中的结构和功能恢复。
3.6. LGQH-3在体外保护细胞免受损伤并调节p38 MAPK/AQPs–PCSK6/Corin轴
基于体内发现，使用AC16和HK-2细胞系进行了体外实验（图7A∼B）。为了模拟HFpEF引起的心脏和肾脏损伤的病理条件，AC16细胞用1.0 mM棕榈酸（PA）和30 mM葡萄糖（GLU）处理，而HK-2细胞暴露于100 nM血管加压素（AVP）。这些条件是根据细胞毒性测定确定的，可导致细胞活力大约降低30%。还评估了含有LGQH-3的血清和DAPA的安全性，发现在浓度≤10%和≤2 μM时没有显著的细胞毒性作用。随后用含有LGQH-3的血清处理显著提高了AC16和HK-2模型中的细胞活力，表明其对细胞损伤具有保护作用。
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图7. LGQH-3在体外保护细胞免受损伤并调节p38 MAPK/AQPs–PCSK6/Corin轴。(A) 在棕榈酸（PA）和高葡萄糖（GLU）诱导的损伤条件下对AC16细胞的细胞活力测定，含有LGQH-3的血清和DAPA的细胞毒性评估，以及LGQH-3对受损细胞的保护作用。(B) 在精氨酸血管加压素（AVP）诱导的损伤条件下对HK2细胞的细胞活力测定，含有LGQH-3的血清和DAPA的细胞毒性评估，以及LGQH-3对受损细胞的保护作用。(C) AC16细胞的膜通透性流式细胞术分析。(D) HK2细胞中ANP水平的ELISA测量。(E∼F) AC16细胞中p38 MAPK、AQP4、PCSK6和Corin的mRNA表达水平，以及HK2细胞中p38 MAPK、AQP2、PCSK6和Corin的mRNA表达水平。数据为平均值±标准差（n = 3∼6），* P < 0.05，** P < 0.01 vs. CTRL组，# P < 0.05，## P < 0.01 vs. Model组。使用Calcein-AM荧光染色评估了AC16细胞中的细胞水肿（图7C）。LGQH-3治疗增强了模型组中观察到的钙荧光强度降低，表明膜通透性降低，减轻了心肌细胞水肿。在肾脏中，Corin催化pro-ANP转化为活性ANP；因此，在HK-2细胞中测量了ANP水平（图7D）。与CTRL组相比，模型细胞中的ANP水平显著降低，但在LGQH-3治疗后以剂量依赖的方式增加。RT-qPCR分析进一步证实了这些转录变化（图7E∼F）。在损伤条件下，p38 MAPK和AQP4（AC16）及AQP2（HK2）的mRNA水平显著升高，而Corin和PCSK6的mRNA表达降低。LGQH-3治疗逆转了这些变化，抑制了p38 MAPK和AQP4的表达，同时提高了Corin和PCSK6的mRNA水平，与体内结果一致。总体而言，这些发现表明LGQH-3在体外具有直接的细胞保护作用。它减轻了心肌细胞水肿，通过Corin介导的ANP激活促进了肾脏液体转运，并调节了p38 MAPK/AQPs和PCSK6/Corin信号通路，以恢复HFpEF中的液体代谢平衡。
3.7. 药理学抑制p38 MAPK支持PCSK6/Corin-p38 MAPK/AQPs轴在LGQH-3对HFpEF保护中的作用
为了进一步研究p38 MAPK信号通路对LGQH-3保护作用的贡献，使用了特定的p38 MAPK抑制剂SB203580。如图8A所示，在PA和GLU诱导的AC16心肌细胞中，p-p38 MAPK与总p38 MAPK的比率显著升高，表明p38 MAPK过度激活。LGQH-3以剂量依赖的方式减弱了这种磷酸化，其中2.5% LGQH-3的效果最强。SB203580同样抑制了p38 MAPK的磷酸化。同时，SB203580对p38 MAPK的抑制降低了AQP4的过度表达，反映了LGQH-3的作用，并支持AQP4是p38 MAPK的下游效应器（图8B）。
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图8. p38 MAPK的抑制证实了PCSK6/Corin-p38 MAPK/AQPs轴在LGQH-3介导的对HFpEF保护中的作用。(A) AC16细胞中p-p38 MAPK和总p38 MAPK的相对蛋白质表达水平。(B) AC16细胞和HK2细胞中PCSK6、Corin和AQP4的相对蛋白质表达水平。数据为平均值±标准差（n = 3），* P < 0.05，** P < 0.01 vs. CTRL组，# P < 0.05，## P < 0.01 vs. Model组。如图8B所示，受损心肌细胞中的Corin表达显著降低，但LGQH-3治疗使其恢复。值得注意的是，SB203580并未显著改变Corin的表达，表明Corin不太可能是p38 MAPK的直接下游靶点。相反，这一发现更符合Corin可能在p38 MAPK上游或与其并行作用的可能性。这一解释得到了先前研究的支持，这些研究表明Corin相关信号可能调节p38 MAPK活性，并且Corin缺乏与MAPK信号调节紊乱有关（Hong等人，2024；Xue等人，2020）。LGQH-3还逆转了损伤模型中PCSK6的下调。有趣的是，SB203580处理增加了PCSK6的表达，这可能反映了对p38抑制的补偿或反馈反应；然而，这种可能性仍需进一步研究。总体而言，这些数据支持PCSK6/Corin–p38 MAPK/AQPs轴在LGQH-3介导的对HFpEF的保护中的作用，从而恢复了体液代谢平衡，减轻了心脏和肾脏功能障碍。
4. 讨论与结论
HFpEF仍然是心血管医学中的一个主要未满足的需求，疾病负担与有效疗法之间存在持续差距（Hamo等人，2024）。传统的HF疗法主要是为HFrEF开发的，在HFpEF中的效果有限且不一致。充血、炎症和多系统受累主导了临床进程（Mishra和Kass，2021）。随着疾病的发展，利尿剂抵抗和肾脏损伤进一步加剧了心肾相互作用，使临床管理复杂化（Noels等人，2025；Tuttle等人，2024）。尽管钠-葡萄糖共转运蛋白-2抑制剂（SGLT2i）显示出心肾益处，但个体治疗反应仍然存在异质性（Bhatt等人，2021；Solomon等人，2022）。在这种背景下，我们的研究重点关注HFpEF中的液体代谢紊乱，并评估了一种多组分中药配方恢复心肾稳态的潜力。LGQH-3改善了HFpEF小鼠的舒张功能障碍和运动能力，减轻了心脏和肾脏损伤，并纠正了全身液体失衡。从机制上讲，这些效果与PCSK6/Corin/p38 MAPK/AQPs轴的协调调节有关（图9），将钠尿肽激活与水通道控制联系起来。总体而言，这些发现强调了LGQH-3作为HFpEF潜在疗法的作用，并为针对心肾液体失调提供了机制见解。
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图9. LGQH-3介导的HFpEF中心肾功能障碍改善的机制
心脏和肾脏之间的关键机制联系是钠尿肽系统。ANP在心肌拉伸和体积扩张时释放，促进钠尿、利尿和抗重塑作用（Kondo等人，2024；Matsumoto等人，2020）。然而，在HFpEF中，升高的ANP水平并不一定表示生物活性保持，因为下游反应性通常受损（Nakagawa和Saito，2022）。在本研究中，HFpEF小鼠表现出代偿性升高的心脏ANP和NPR-A表达，但肾脏水平降低，同时两种组织中的p-NPR-A和p-NPR-A/总NPR-A比率也降低。这种模式表明肽的丰度与信号活性之间存在分离。重要的是，LGQH-3干预后HFpEF小鼠中的血清ANP水平显著降低。这种全身性的降低，结合局部组织变化，反映了该药物在减轻潜在心脏压力和重新建立ANP分泌和受体激活动态平衡中的作用。在分子水平上，ANP的生物激活受损可能是HFpEF的一个瓶颈。活性ANP是通过Corin介导的蛋白水解过程从其前体生成的（Wu等人，2009），而Corin的激活依赖于上游的转化酶PCSK6（Zhang等人，2022）。如果这一途径受损，即使肽表达增加，生物活性ANP的产生也可能受到限制。除了钠尿肽处理外，Corin本身也可能具有直接的心脏保护作用（Li等人，2018）。在我们的研究中，LGQH-3恢复了心脏和肾脏组织中的PCSK6和Corin表达（图6A∼B），同时改善了HFpEF小鼠的肾ANP信号传导（图5F）和利尿作用（图3C）。这些发现支持PCSK6/Corin/ANP轴作为一个有前景的治疗靶点（Sangaralingham等人，2023年）。相比之下，DAPA对ANP激活的作用相对较弱，这表明LGQH-3和SGLT2i可能通过部分不同的上游机制来缓解充血。同时，组织水平的水分调节受到应激激活的激酶信号传导和AQP表达的强烈调控。p38 MAPK信号的病理性激活与心肌重塑、纤维化和组织水肿有关，部分原因是通过调节AQP表达（Li等人，2019年；Xu等人，2024a年）。与这些发现一致，我们的HFpEF小鼠表现出心脏AQP4和肾脏AQP2的显著上调，以及过度的p38 MAPK激活。LGQH-3抑制了这种异常的p38 MAPK激活，并使两个器官的AQP表达恢复正常，表明流体动力学得到了改善。然而，p38 MAPK的确切上游调节因子仍有待确定。虽然经典的TGF-β驱动的促纤维化信号传导和TNF-α相关的炎症信号传导已知会驱动p38 MAPK，并与心脏重塑、纤维化（Dhingra等人，2007年；Zhang等人，2022年）以及HFpEF的进展（Bellahcene等人，2006年）密切相关，但我们的数据主要将p38 MAPK确定为LGQH-3的作用靶点，但并未确定LGQH-3的作用是通过这些已知的途径还是其他共通的上游途径实现的。因此，未来的研究需要直接评估这些上游调节因子。
值得注意的是，我们的机制实验揭示了Corin和p38 MAPK之间的复杂相互作用。具体来说，使用SB203580药理学抑制p38 MAPK会降低AQP表达，而不改变Corin的量。这表明Corin在p38 MAPK的上游或与其并行发挥作用，而不是作为其下游靶点，这与先前的研究结果一致（Xue等人，2020年）。有趣的是，p38 MAPK的抑制意外地增加了PCSK6的表达，这可能反映了补偿性反馈反应，而不仅仅是简单的线性信号级联。由于这项研究没有直接测试这种可能性，PCSK6上调的机制基础仍然不清楚，需要进一步研究。因此，我们将PCSK6/Corin–p38 MAPK/AQPs轴解释为一个功能上相互关联的调节网络，而不是一个完全明确的因果级联。通过调节这个相互连接的网络，LGQH-3展示了一种多药策略，可以克服单一靶点方法的局限性（Zheng等人，2023年）。
除了这些分子机制之外，我们的研究还具有潜在的转化医学意义。临床上，HFpEF是一种系统性疾病，其中肾功能障碍导致容量超负荷和心脏充盈压升高，形成一个自我强化的循环（Otaki等人，2023年）。通过减轻心脏负担和保护肾功能，LGQH-3可能中断这一反馈循环，符合中医的心肾协同原则。此外，LGQH-3与当前指南推荐的HFpEF治疗方法之间的关系也值得考虑。现代治疗越来越多地包括SGLT2i，在某些患者中还包括盐皮质激素受体拮抗剂或血管紧张素受体-脑利钠肽抑制剂（Heidenreich等人，2022年；Vaduganathan等人，2026年）。在我们的研究中，LGQH-3和SGLT2i产生了类似的心肾益处，但机制发现表明这些效应可能是通过部分不同的途径实现的，这表明它们可能是互补的而不是冗余的。类似的关系也可能适用于血管紧张素受体-脑利钠肽抑制剂，后者通过限制肽的降解来增强利钠肽的活性，而LGQH-3似乎通过PCSK6/Corin轴促进肽的激活和下游信号传导（Solomon等人，2019年）。考虑到盐皮质激素受体信号传导在钠保留和心肾损伤中的作用（Ferreira等人，2024年；Chang等人，2024年），LGQH-3与盐皮质激素受体拮抗剂之间的潜在互补性也是合理的。这些发现表明，LGQH-3可能作为辅助疗法适用于持续充血、利尿抵抗或肾功能障碍的患者。尽管有这些有希望的发现，但仍需承认一些局限性。首先，本研究中仅包括了雄性小鼠。这一选择基于之前使用相同的高脂饮食加L-NAME模型的研究，其中雌性小鼠的HFpEF表型明显减弱，肺部充血现象不那么明显，使得该模型在评估与充血和液体潴留相关的干预措施时不够敏感（Tong等人，2019年）。然而，这种设计也限制了结果的解释。性别是HFpEF的重要生物学修饰因素，影响心室硬度、炎症和代谢反应以及整体疾病易感性（Borlaug等人，2023年；Beale等人，2018年）。因此，这里观察到的LGQH-3的保护作用应主要在雄性HFpEF背景下解释，不能直接推广到雌性。未来的研究需要包括两种性别，以确定LGQH-3的效果是否与性别无关，并更好地反映HFpEF的生物学异质性。其次，尽管该模型小鼠再现了心血管代谢HFpEF的中心特征，但它并未完全模拟人类HFpEF的全部临床复杂性。特别是，与年龄相关的改变、虚弱以及患者中常见的各种合并症在该模型中未能得到充分体现。因此，目前的发现应在特定的实验表型背景下解释，而不能作为人类HFpEF的完整代表。未来使用老年动物或包含更广泛合并症谱的模型将有助于进一步提高这些发现的转化医学相关性。此外，本研究并未直接确定各个分子靶点的因果关系。未来的研究需要采用靶向干预策略，如药理学抑制、基因敲低或过表达，以进一步阐明LGQH-3在HFpEF中的机制基础。
总之，本研究提供了证据，表明LGQH-3通过调节PCSK6/Corin-p38 MAPK/AQPs网络、恢复液体平衡以及减轻充血和心脏容量超负荷，改善了HFpEF小鼠的心肾功能障碍。这些发现支持以液体代谢为中心的HFpEF治疗框架，并为进一步的机制和转化医学研究提供了基础。
**作者贡献声明：**
- Luqi Huang：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供。
- Guoju Dong：撰写 – 原始草稿、验证、监督、方法学设计。
- Xiaoyu Liang：撰写 – 原始草稿、方法学设计、正式分析、数据管理。
- Ziyi Chen：撰写 – 原始草稿、可视化、正式分析、数据管理。
- Siyu Liu：验证、方法学设计、实验研究、数据管理。
- Yue Wei：方法学设计、实验研究。
- Zhixuan Li：实验研究、正式分析。
- Yunying Mou：实验研究、正式分析。
- Dongxin Liu：正式分析、数据管理。
- Yao Li：正式分析、数据管理。
- Xiaopeng Hao：正式分析、数据管理。
**利益冲突声明：**
作者声明本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
**数据可用性声明：**
本研究中生成和分析的数据集不公开，但可根据合理请求向通讯作者获取。
**伦理声明：**
所有动物实验均符合ARRIVE指南，并遵循1986年《动物（科学程序）法》、欧盟指令2010/63以及NIH关于实验室动物护理和使用的指南。该研究获得了中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会的批准（批准编号2023XLC024-3）。
**资助声明：**
本研究得到了中国中医科学院科技创新项目（CI2023C010YL）和国家自然科学基金（82574852）的资助。
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