大卫·约瑟夫 | 莱纳·库默勒 | 尼古拉斯·弗雷塔格 | 克里斯蒂安·格里斯林格
德国下萨克森州哥廷根市马克斯普朗克多学科科学研究所基于核磁共振的结构生物学部门，邮编D-37077
**摘要**
提高核磁共振（NMR）光谱的灵敏度需要仪器技术和实验方法的进步。在这项研究中，我们介绍了一种专为1.2 GHz仪器设计的5毫米三共振低温探头，该探头通过优化控制脉冲序列来增强性能。实验结果显示，对于苯样品，平均灵敏度提高了56%；对于具有损耗的生物样品，灵敏度提高了多达50%，与目前使用的3毫米低温探头相比，实验时间缩短了一倍以上。此外，我们还系统地优化了实验条件，以充分利用GHz级磁体的能力。使用5毫米低温探头在1.2 GHz频率下获得显著提升的灵敏度是通过低功率优化控制脉冲实现的。因此，我们开发了一套优化控制的三共振实验库，使得在1.2 GHz仪器上进行的高级NMR应用能够实现更高的灵敏度。
**引言**
在脉冲核磁共振（NMR）光谱中，通常通过测量射频（RF）线圈中的时变感应电压来检测核自旋的自由感应衰减（FID）信号[1]、[2]、[3]、[4]。NMR实验的信噪比（SNR）由以下公式给出[4]：
$$
SNR = \frac{C_f V_c^{-1/2}}{I + \gamma \frac{5}{2} N V_s B_0^{3/2} Q^{1/2} T_s^{-3/2} \Delta\nu^{-1/2}}
$$
其中，$C_f$ 是一个常数，$f$ 是考虑系统中除检测线圈中的约翰逊噪声之外的所有噪声源的因子，$V_c$ 和 $V_s$ 分别是线圈和样品的体积，$I$ 是核自旋，$\gamma$ 是其旋磁比，$N$ 是单位体积内的自旋数，$B_0$ 是静态磁场，$Q$ 是线圈的空载Q因子，$T_s$ 是样品温度，$\Delta\nu$ 是检测带宽。这一公式在文献中被广泛用于推导出NMR灵敏度与 $B_0^{3/2}$ 成正比的关系，尽管它忽略了频率依赖性因素（如Q因子）以及样品损耗。研究表明，当检测线圈和样品处于相同温度且样品损耗主要由样品导电性决定时[3]、[5]、[6]，NMR实验的正确频率缩放关系应为：
$$
SNR = \frac{B_0^2}{B_1^{-\alpha} + \beta B_0^2 r^4 L}
$$
其中，$B_1^{-}$ 是射频线圈中单位电流的圆极化场强，$\alpha$ 和 $\beta$ 是常数，$r$ 是样品半径，$L$ 是与 $B_0$ 平行的样品长度。当样品损耗可以忽略不计（$\beta B_0^2 r^4 L \ll \alpha B_0^1/2$）时，SNR与 $B_0^{7/4}$ 成正比；当导电损耗占主导时（$\beta B_0^2 r^4 L \gg \alpha B_0^1/2$），SNR与 $B_0$ 成线性关系。$B_0^{7/4}$ 的依赖性源于趋肤效应，同时忽略了其他损耗机制，特别是电容器中的介电损耗[3]、[5]、[6]。
高分辨率NMR光谱发展的一个重大突破是引入了低温冷却探头，通过冷却检测线圈和前置放大器来降低光谱噪声，从而将灵敏度提高了多达六倍[3]、[7]、[8]、[9]、[10]。目前，使用低温冷却探头研究少量（浓度小于150 μM）的生物分子（如蛋白质、RNA、DNA和代谢物）已成为标准做法，这些研究通常使用高场和超高场NMR光谱仪[11]、[12]。NMR光谱中的噪声主要来源于测量样品和电气检测系统中的热激活随机波动，而在低温探头的情况下，这两个系统的温度不同。根据互易原理[5]，这种噪声受线圈（$T_c$ 和 $P_c$）和样品（$T_s$ 和 $P_s$）的温度以及耗散功率的影响。通过前置放大器链产生的噪声可以用等效噪声温度 $T_a$ 来表示[5]、[8]、[13]、[14]、[15]、[16]：
$$
\text{噪声} \propto P_c T_c + T_a + P_s T_s
$$
冷却线圈和前置放大器可以减少它们的噪声贡献，从而提高SNR[7]、[8]、[9]、[10]。耗散功率 $P_c$ 受 $T_c$、$B_0$ 和 $\omega$ 的影响，因为金属的导电性和电容器中的介电损耗都强烈依赖于温度、频率和磁场。由于 $T_c + T_a$（例如 $T_c = 20 \, \text{K}$，$T_a = 20 \, \text{K}$，$T_s = 298 \, \text{K}$）可能比 $T_s + T_a$ 小九倍，因此对于低温探头来说，样品通常占总噪声的主导地位，特别是当样品含有高介电损耗溶剂或表现出导电性时。
准确计算线圈、电容器、电气网络组件和传输线中耗散的功率 $P_c$ 是具有挑战性的，因为这些参数强烈依赖于接收电路的具体实现。尽管如此，可以通过认识到耗散源来自金属中的导电（欧姆）损耗和电容器中的介电损耗来评估频率依赖性，即 $P_c = P_{\text{cond}} + P_{\text{dieel}}$。导电损耗与线圈电阻 $R_c$ 有关，根据公式 $P_c = R_c I^2$。与直流（DC）不同，射频（RF）电流仅流经导体表面，其趋肤深度 $\delta$ 是角频率 $\omega$ 的函数。对于室温下的金属，表面电阻 $R_s \propto \omega$ 通常与磁场无关。然而，对于低温下的高纯度导体，情况更为复杂。当电子在两次散射事件之间的平均自由路径 $\lambda$ 长于趋肤深度 $\delta$ 时，经典的趋肤效应不再适用，导致异常趋肤效应。此外，施加磁场会增加材料的电阻，因为磁场对移动电荷的作用会增加碰撞次数，从而缩短有效平均自由路径。这种依赖于磁场的电阻称为磁阻，其值随导体材料而变化[17]、[18]。根据Reuter和Sondheimer[18]报告的方程进行数值积分，并结合拉莫尔进动频率与静态磁场的比例关系（$\omega = \gamma B_0$），可以得到低温NMR探头工作温度范围内高纯度铜的 $R_s \propto \omega^{0.9}$。可以设计NMR探头，使其共振电路中的介电损耗远小于导电损耗，从而忽略 $P_{\text{dieel}}$，得到：
$$
P_c \propto \omega^0.5 \quad \text{对于室温探头}
$$
$$
P_c \propto \omega^0.9 \quad \text{对于低温探头}
$$
根据实现方式的不同，在非常高频率下，介电损耗并不总是可以忽略的，特别是使用市售电容器时。由于它们的损耗频率依赖性与测量样品中的介电损耗相同，因此在这里不单独讨论场/频率缩放关系。
样品中耗散的功率 $P_s$ 由以下公式给出：
$$
P_s = \int \sigma_{\text{eff}} E^2 \, dV
$$
其中积分是在样品的整个体积上进行的，$E$ 是包括保守性（电容性：$\nabla \times E = 0$）和非保守性（感性：$\nabla \times E = -\partial B \partial t$）贡献在内的峰值电场，$\sigma_{\text{eff}}$ 是样品的等效导电性，包括直流导电性 $\sigma$ 和高频介电损耗。
大多数NMR溶剂的介电行为可以用Debye模型或其扩展的Cole-Cole或Debye-Davidson模型来描述。在2 GHz以下的相关频率范围内，大多数溶剂的复介电常数可以通过一个由松弛时间 $\tau$ 定义的单一共振来很好地描述：
$$
\epsilon = \epsilon_{\infty} + \epsilon_s - \epsilon_{\infty} e^{-i \omega \tau} + \alpha e^{-i \sigma \omega \epsilon_0}
$$
其中 $\epsilon_{\infty}$ 是高频下的介电常数，$\epsilon_s$ 是静态介电常数（低频极限），$\omega$ 是角频率，$\sigma$ 是静态电导率，$\epsilon_0$ 是自由空间的介电常数，$\alpha$ 是一个经验参数。需要注意的是，$\epsilon_s$、$\tau$ 和 $\sigma$ 不是给定溶剂的常数，而是温度的函数，对于离子种类、迁移率和浓度也有影响[19]、[20]。
在纯Debye松弛情况下（$\alpha \approx 0$），可以将方程（6）转换为实部和虚部：
$$
\epsilon' = \epsilon_{\infty} + \epsilon_s - \epsilon_{\infty} e^{-i \omega \tau} \\
\epsilon'' = \epsilon_s - \epsilon_{\infty} e^{-i \omega \tau} + \sigma \omega \epsilon_0
$$
因此，有效导电率为：
$$
\sigma_{\text{eff}} = \omega \epsilon_0 \epsilon''
$$
对于频率远小于Debye共振频率（$\omega \tau = 1$）的情况，我们得到：
$$
\sigma_{\text{eff}} \approx \sigma + \omega^2 \tau \epsilon_0 \epsilon_s
$$
在假设静态磁场方向长度为L的均匀磁场下，对于圆形和矩形样品，方程（5）的解为：
$$
P_s \sim \sigma_{\text{eff}} B_1^2 \omega^2 \frac{c_{\text{sample}}{L}
$$
其中 $c_{\text{sample}} = \pi r^4$ 是圆形样品的半径，$a$（垂直于$B_1$）和$b$（平行于$B_1$）是椭圆形样品的尺寸[6]。因此，激发脉冲后样品中耗散的功率频率依赖性为：
$$
P_s = d_{\text{cond}} \sigma \omega^2 + d_{\text{dieel}} \omega^4 B_1^2 \frac{c_{\text{sample}}{L}
$$
其中 $d_{\text{cond}}$ 和 $d_{\text{dieel}}$ 是取决于测量探头和样品特性的常数。
对于生物样品，决定样品中功率损耗的关键因素是缓冲液的特定导电性，对于低温探头来说，它通常也主导了总噪声，表示为：
$$
\sigma = \sum_i c_i q_i \lambda_i w_e
$$
其中求和是对存在的不同离子种类进行的，$c_i$ 是离子浓度，$q_i$ 是电荷，$\lambda_i T_s$ 是第i种离子的温度依赖性迁移率。研究表明，使用导电性较低的缓冲系统和稳定离子可以降低功率损耗和噪声[12]、[14]，从而提高灵敏度。
对于双共振或三共振NMR实验，通常需要多个线圈和电容器来调节不同传输和检测通道的共振频率，这些通道可能具有不同的温度 $T_c$。包括所有噪声贡献在内的NMR实验的正确SNR缩放关系为：
$$
SNR \propto \frac{B_0^2}{B_1^{-\alpha} \sum_i \alpha_i B_0^x + \delta_i B_0^4 T_c + T_a + d_{\text{cond}} \sigma B_0^2 + d_{\text{dieel}} B_0^4 B_1^2 \frac{c_{\text{sample}}{L} T_s + T_a}
$$
其中 $x = 0.5$ 对于室温下的线圈，$0.5 < x < 1$ 对于低温下的线圈，特别是对于在25 K以下高温下工作的非常纯铜制成的线圈。有三个有趣的极限情况：
1. 对于无损耗样品，室温探头的SNR $\propto B_0^{7/4}$，而使用纯铜导体的低温探头的SNR $\propto B_0^{3.1/2}$。需要注意的是，常用的 $B_0^{3/2}$ 非常接近正确值，因为低温下谐振器的空载Q因子基本上与频率无关。
2. 对于导电样品损耗主导总噪声的情况，SNR $\propto B_0^3$。
3. 对于溶剂介电损耗是主要噪声源的情况，这可能发生在非常灵敏的低温探头和较大体积的样品中，特别是含有极性溶剂（如水、DMSO、甲醇或更高醇）的情况下，信噪比与静态场的缩放关系达到饱和，在非常高磁场下预计是常数。
为了验证所提出理论的有效性，我们对5毫米低温探头和室温探头进行了数值模拟，并将结果与从已建立的液态NMR标准获得的实验SNR数据进行了比较。具体来说，我们评估了0.1%乙苯在CDCl₃中的SNR数据（图1A）以及2 mM蔗糖溶解在90% H₂O/10% D₂O中的SNR数据（图1B）。此外，对于低温探头，模拟结果还与使用成型定向样品管以及填充有蔗糖（溶解在90% H₂O/10% D₂O中的150 mM NaCl）的圆形5毫米管获得的实验测量结果进行了比较（图1C）。
对于水和盐水溶液，数值模拟采用了Klein–Swift模型[19]，而氯仿则使用Debye松弛模型进行描述。CDCl₃的介电参数为 $\epsilon_{\infty} = 2.03$、$\epsilon_s = 4.82$、$\tau = 6.87 \times 10^{-12} \, s$ 和 $\alpha = 0$，这些参数是根据在298 K下进行的开放式同轴探头测量在0.01–20 GHz频率范围内确定的。所有模拟数据都根据400 MHz时的实验值进行了缩放，使用一个参数对应乙苯标准，另一个参数对应蔗糖标准。使用盐水溶液作为缓冲剂获得的数据也使用从蔗糖-水测量中确定的相同参数进行缩放（图1B）。
图1A展示了乙苯标准的模拟SNR，图1B展示了蔗糖标准的相应结果。在这两张图中，5毫米低温探头的结果显示为深蓝色，室温探头的结果显示为红色。误差条表示从自动化测试程序获得的群体标准偏差；对于样本数量少于十个的群体，不报告标准偏差。对于通常用于量化液态NMR探头中质子灵敏度的两种SNR标准，低温探头的SNR在高磁场下表现出明显的饱和现象，这与方程（11）的预测一致。这种行为突显了现有SNR标准在表征超高场下低温探头性能方面的局限性。
对于使用室温探头测量的氯仿和水溶液缓冲液，主要的噪声贡献来自射频线圈中的电阻损耗，导致SNR与 $B_0^{7/4}$ 成正比，直到大约20 T的磁场。实验中的高场数据与模拟结果的偏差归因于探针电容组件中的介电损耗，这些损耗在当前的模拟中并未考虑。图1C显示了使用生理盐水溶液在定向形状样品管中的低温探针的模拟信噪比（SNR）值，用黄色曲线或方块表示；而在传统的圆形5毫米管中则用紫色曲线或圆圈表示。在这种情况下，SNR的频率依赖性主要由样品内的导电损耗决定，并且与水和氯仿的饱和行为（图1A、B）相比，显示出对静态磁场强度B0的近似线性依赖性。因此，与纯水相比，含盐水溶液的相对灵敏度随着磁场强度的增加而降低，这种效应在使用定向形状样品管时尤为明显。例如，当使用填充有接近生理条件下的分析物溶解盐水的形状管时，与在圆形5毫米管中相同浓度的分析物相比，相对SNR从600 MHz时的0.4增加到1200 MHz时的0.56，并在1500 MHz时达到0.66。由于导电缓冲剂导致的SNR损失减少是由于两个不同的效应：首先，水中的介电损耗与磁场强度的四次方成正比，而由离子导电性引起的损耗仅与磁场的平方成正比。因此，在同时含有水和离子的导电样品中，离子损耗的相对贡献在较高磁场下会减小。其次，在非常高的磁场下，传统圆形5毫米管中纯水的固有介电损耗变得足够大，以至于定向形状样品管通常可以提供比标准圆形5毫米几何结构更高的SNR。此外，对于低温探针和150 mM NaCl或更高浓度的盐水，定向形状管在所有相关磁场下都能提供最高的SNR，使其成为生物样品的首选几何结构。总体而言，图1A–C中显示的实验数据与所有三种缓冲系统的模拟曲线非常吻合。这种一致性表明，低温探针在给定样品和样品管几何结构下接近于可实现的最大灵敏度。特别是对于水基和盐水溶液，NMR信号以及几乎所有相关的噪声都来自样品本身。因此，探针的固有噪声贡献可以忽略不计，这强调了选择低损耗缓冲系统和适当定向的形状样品管以实现实验中最佳SNR的重要性。尽管如此，需要注意的是，样品制备，特别是选择低导电性缓冲剂，是最大化NMR实验SNR的最关键参数之一。对于生物样品，优化用于检测1H信号的三共振逆向低温探针（以下简称低温探针）对于最大化灵敏度是非常理想的[21]。然而，缺乏针对质子检测优化的5毫米低温探针显著阻碍了使用1.2 GHz光谱仪研究浓度有限的样品[22]。此外，在多维NMR实验中实现最大灵敏度取决于在所需带宽内均匀操控自旋的能力以及B1补偿[22]、[23]。这种能力与使用矩形脉冲可实现的最大拉比频率密切相关[24]。值得注意的是，对于给定的可用射频功率，最大可实现拉比频率与射频线圈体积的平方根成反比，因为在恒定功率下，射频磁场强度B1+随着线圈尺寸的增加而减小[3]、[13]、[25]。这一限制在GHz级别的磁体中尤为关键，因为在5毫米低温探针上的B1+相比3毫米低温探针和低场磁体受到更多限制[22]。因此，1.2 GHz仪器的商业供应商Bruker迄今为止只提供了3毫米低温探针用于溶液NMR测量。在我们之前的工作中[22]，我们提出了低功率最优控制（OC）脉冲来克服与脉冲生成相关的障碍，这些障碍限制了5毫米低温探针的可用性。然而，关于灵敏度的其他混淆因素需要通过实验进行评估。在GHz级别的磁场中，介电损耗对噪声的贡献特别显著[15]。由于这种损耗，水基样品的灵敏度降低了多达34%[15]。通过使用定向形状管或矩形样品管[6]、[26]、[27]可以将样品限制在电场较低的区域，从而可以最大化SNR。因此，实施额外的策略（如选择用于样品的缓冲剂和优化NMR管的几何结构）以在使用5毫米低温探针时最小化介电损耗，对于在超高场NMR仪器上实现最佳灵敏度至关重要[14]、[15]、[16]、[28]。在这项研究中，我们评估了5毫米低温探针在1.2 GHz光谱仪上的性能。我们系统地研究了这种5毫米低温探针在不同盐浓度的水基缓冲液中的最大可实现SNR比，将其与非导电参考样品以及不同样品管几何结构进行了比较。由于样品导电性引起的噪声贡献大约与仪器频率的平方成正比，而介电损耗引起的噪声贡献甚至与频率的四次方成正比，我们强调了采用有效最小化这些效应的实验工作流程的重要性。此外，我们通过实验证明了使用OC脉冲对于充分利用5毫米低温探针在1.2 GHz下的能力是必不可少的。最后，我们提供了一个三共振OC脉冲序列库，旨在使这些方法更容易为生物分子NMR社区所使用。
**章节片段**
**针对1H检测优化的5毫米低温探针的灵敏度**
为了最小化介电效应，我们使用了氘代苯进行初步灵敏度测试，以比较5毫米低温探针与3毫米低温探针的SNR性能。由于其低介电强度，氘代苯的品质因数和灵敏度与未加载探针相当[15]。在1.2 GHz仪器上，5毫米低温探针的灵敏度提高了56%（图2），接近预测的67%增幅[3]、[4]、[29]。
**讨论**
使用5毫米低温探针进行测量对于研究浓度有限的样品至关重要[22]、[42]。我们证明了在1.2 GHz下使用低功率最优控制脉冲序列可以实现最佳性能。在这里，我们研究了5毫米低温探针在1.2 GHz光谱仪上的性能。我们的结果表明，增加样品体积可以预期地提高SNR，这表明没有必要妥协使用小体积的低温探针。
**结论**
总之，为了从5毫米低温探针中获得最佳性能，对于GHz级别磁体的建议包括：
i) 在所有通道上使用OC脉冲[22]；
ii) 使用形状样品管[6]、[26]；
iii) 结合文献中的其他技巧，例如使用低导电性的缓冲剂和较大的离子作为缓冲剂中的稳定盐[12]、[14]。
总之，这项研究使得使用5毫米低温探针能够研究GHz级别磁体中的浓度有限生物样品。
**材料**
氘代苯-d6用于灵敏度测量。为了评估5毫米TCI低温探针在1.2 GHz仪器上的性能，准备了两个测试样品。第一个样品是100 μM均匀标记了15N/13C的泛素溶液，置于50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中，其中含有100 mM NaCl、0.1%叠氮化钠和5% D₂O。第二个样品是100 mM均匀标记了15N/13C的p53 1–73 WT溶液，置于20 mM Bis-Tris缓冲液（pH 6.8）中，含有0.02%叠氮化钠。
**作者贡献**
D.J.和C.G.构思了问题并设计了研究，D.J.构建了脉冲序列并进行了实验，D.J.解释了数据。原型5毫米低温探针由N.F.和R.K.提供，初稿由D.J.在N.F.、D.J.、N.F.、R.K.和C.G.的帮助下撰写，D.J.、N.F.、R.K.和C.G.审阅并编辑了手稿。
**数据和材料可用性**
评估论文中结论所需的所有数据都包含在论文和/或补充材料中。所有报告的脉冲序列代码和在Bruker Avance Neo 1200 MHz上重现结果所需的参数文件都提供在Edmond数据库中，网址为：“生物分子NMR光谱学的最优控制脉冲序列库”，https://doi.org/10.17617/3.CBOUXH, Edmond, V1.C
**作者贡献声明**
David Joseph：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，软件，方法论，调查，数据分析，概念化。
Rainer Kümmerle：撰写 – 审阅与编辑，验证，资源。
Nicolas Freytag：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，资源。
Christian Griesinger：撰写 – 审阅与编辑，资源，资金获取，概念化。
**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
**致谢**
这项工作得到了马克斯·普朗克学会的支持。作者感谢Claudia Schwiegk、Melanie Wegstroth和Stefan Becker博士提供了同位素标记的泛素和p53 1-73样品。
