Meryem El Fadil | Karim El Fakhouri | Noamane Taarji | Chaimae Ramdani | Rachid Boulamtat | Mohamed Ouaarous | Cheima Moufid | Badreddine Drissi | Imane Abbad | Mustapha El Bouhssini | Mansour Sobeh
农业与生物科学项目，农业与环境科学学院，穆罕默德六世理工学院，本盖里尔 43150，摩洛哥
**摘要**
Helicoverpa armigera 是一种极具破坏性的农业害虫，其对传统化学杀虫剂具有很强的抗性，因此迫切需要寻找可持续且环保的替代方案。本研究评估了 Dysphania ambrosioides 精油（DAEO）对 H. armigera 的杀虫潜力，并探讨了基于纳米技术的递送系统是否能够提高其效果。DAEO 通过离子凝胶化技术制备成壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNP），并通过超声均质化技术制备成油水纳米乳液（DAEO-NE）。GC-MS 分析鉴定出 19 种成分，其中以 ascaridole (Z) (48.33%) 和 p-cymene (33.83%) 为主。两种纳米制剂都具有纳米级尺寸（266-291 nm）、高包封效率（92-96%）和良好的胶体稳定性，其中 CSNPs 的 zeta 电位为正（+40.49 mV）。FTIR 和 SEM 分析证实了包封的成功以及颗粒的球形形态。与游离油相比，纳米制剂显著提高了润湿性、叶片覆盖率和持续释放效果。实验室生物测定显示，纳米制剂对三龄幼虫的杀虫效果更优，DAEO-NE 在 4 天内可导致高达 95.83% 的死亡率，而 DAEO-CSNPs 在较长时间内达到了类似的死亡率，这反映了其控释特性。温室试验进一步证实了 CSNPs 的优越性能，在第六天时死亡率达到了 90%。Probit 分析显示，CSNPs 的 LC₅₀ 值（0.47-0.60%）低于纳米乳液和游离油。总体而言，纳米包封和纳米乳化显著提高了 DAEO 的稳定性、生物利用度和杀虫效果，证实了其在综合害虫管理中的潜在应用价值。
**1. 引言**
Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) 是一种适应性极强且破坏性极大的害虫，它以超过 300 种植物为食，对全球农业构成重大威胁，包括鹰嘴豆。其侵害每年造成的经济损失超过 50 亿美元（Gopalakrishnan 等，2016）。该害虫的迁徙能力使其能够在各大洲扩散，导致作物损失高达 100%。其幼虫通过啃食叶片和豆荚严重损害鹰嘴豆作物，对整个收成构成严重威胁。尽管每年在杀虫剂上的支出高达 5 亿美元，农民仍面临巨大挑战（Sharma 等，2007）。然而，这些化学农药的过度使用导致了害虫抗性的产生。这些困难凸显了开发综合害虫管理（IPM）策略以可持续控制 H. armigera 种群的紧迫性。植物精油（EOs）通常被认为是安全的，已被证明对多种害虫具有广泛的杀虫作用，因此被视为可生物降解、有效且安全的天然替代品（Sarmah 等，2025）。从植物中提取的精油是挥发性有机化合物混合物，包含萜类和非萜类生物活性分子，如单萜、倍半萜、酚类、醛类、酮类和醇类。这些化合物在专门的分泌结构（腺体、毛状体、导管或腔体）中合成，具有多种生态功能，包括抵御食草动物和病原体、吸引传粉者以及植物间通信（Turek 和 Stintzing，2013）。由于其杀虫、驱虫、抗摄食和生长调节作用，精油作为合成农药的环保替代品受到了越来越多的关注。它们的复杂化学组成提供了多种作用机制，降低了目标害虫产生抗性的可能性。使用这些活性成分可以在不损害人类健康、有益昆虫或环境的情况下控制害虫。这些化合物对昆虫有多种生理效应，如抑制生长和产卵、导致幼虫死亡以及干扰繁殖（S. Ibrahim，2020）。尽管精油具有很好的生物活性，但其应用受到某些限制，包括高挥发性、低水溶性和易氧化降解（Moretti 等，2002）。这些物理限制会降低产品在田间的稳定性和效果。为了解决这些问题，人们探索了新的制剂技术来保护活性成分免受降解和蒸发损失。包封是一种实用有效的策略，可以提高精油的物理稳定性并在加工和储存过程中增强其生物活性。此外，它还可以提高水溶性、调节释放、增强吸收，并通过减少所需剂量和增强杀虫活性来降低活性成分的毒性和成本（Mohammadi 等，2015）。其中，基于壳聚糖的递送系统和纳米乳液在提高精油的稳定性、生物利用度和杀虫效果方面显示出潜力。壳聚糖被认为是安全的、无毒的，并且能够通过与多阴离子相互作用形成复合物和凝胶（Sharma 等，2019）。在将生物活性成分包封到壳聚糖纳米颗粒（CSNPs）的各种方法中，使用壳聚糖（CS）和三磷酸钠（TPP）在室温下进行离子凝胶化的技术被证明特别适用。这种方法简单、无毒、无需有机溶剂且易于操作（Hasheminejad 等，2019）。纳米乳液是光学透明的系统，由直径通常在 0.1 至 200 nm 之间的液滴组成，具有抗聚结特性。在这些系统中加入适当的乳化剂可以显著降低油相和水相之间的界面张力，从而稳定制剂（Delmas 等，2011）。Dysphania 属植物在全球广泛分布，其中 Dysphania ambrosioides (L.) Mosyakin & Clemants（旧称 Chenopodium ambrosioides L.）在传统民间医学中因其药用价值而闻名，摩洛哥称其为“Mkhinza”。该物种原产于墨西哥和拉丁美洲其他地区，现已广泛传播到欧洲、非洲和亚洲。Dysphania ambrosioides 精油被证明是一种特别有效的植物杀虫剂（Singh 和 Pandey，2022）。
**2. 材料与方法**
2.1. 植物材料
D. ambrosioides 种子来自马拉喀什的 Ouljat-Oued-Tensift 地区（31°37′48″N 8°0′32″W）。2024 年 4 月，在摩洛哥中部 Benguerir 的穆罕默德六世理工学院实验农场开始在温室条件下种植（32° 13′ 11.5″ N, 7° 53′ 29.9″ W）。每个花盆种植 10–12 颗种子，使用泥炭基质，并立即浇水以促进均匀发芽。一个月后，当植物进入叶片生长期时，将幼苗移植到约 600 m² 的露天田地中。试验田地分为九行，行间距为 1 m，每个孔种植两株植物。采用滴灌系统，每隔 2 至 3 天灌溉一次，在生长期间未施用肥料。2024 年 7 月在营养生长期收获，收获后的叶片在室温下风干，随后进行水蒸馏以提取精油。取 100 克干燥叶片，在 Clevenger 型装置中用 1 升蒸馏水以 1:10（w/v）的比例进行蒸汽蒸馏 3 小时。
2.2. GC-MS 分析
使用 GC-MS-TQ8040 SHIMADZU 系统（日本）对 D. ambrosioides 的挥发性化合物进行分析。分析在 Rtx-5MS 融合键柱（长度 30 m，内径 0.25 mm，膜厚 0.25 μm，Restek，PA）上进行，温度程序从 50 °C 开始，以 5 °C/min 的速率升至 300 °C。样品稀释至 1%（v/v），并在 250 °C 下以分流模式注入，载气为氦气，流速为 1.5 mL/min。质谱条件设置为：离子源温度 200 °C，接口温度 280 °C，质量范围 50−500 m/z。化合物鉴定使用 NIST 2017 数据库进行。此外，通过将检测到的化合物与在相同色谱条件下分析的一系列标准正烷烃进行比较，计算其保留指数（RIs）。
2.3. 纳米制剂的制备
2.3.1. 油水纳米乳液
油水（O/W）纳米乳液通过超声均质化（Ivymen 超声波均质器 CY-500，Comecta，S.A.，巴塞罗那，西班牙）制备，振幅为 60%，时间为 6 分钟，交替进行 3 秒的超声处理和 7 秒的休息时间。水相包含 0.5%（w/v）的 Tween 80 水溶液，而有机相由商业葵花油和 D. ambrosioides 精油的新鲜混合物组成，比例为 1:1。超声处理在装有冰浴的塑料烧杯中进行，以防止过度产热和精油蒸发。此外，在超声处理过程中逐滴加入精油，并不断调整超声探头的位置，以确保精油和超声波在液体中的均匀分布。最终乳液含有 2.5%（v/v）的精油，立即储存在 4 °C 下直至进一步表征。
2.3.2. 壳聚糖纳米颗粒
壳聚糖纳米颗粒的制备包括两个步骤：液滴形成和固化。首先，通过超声均质化形成含有 D. ambrosioides 精油的 O/W 乳液液滴。然后通过引入三磷酸钠（TPP）进行离子凝胶化，使壳聚糖纳米颗粒（CSNPs）自发形成。壳聚糖（0.3%，w/v）分散在 1%（v/v）的冰醋酸溶液中，并在室温下搅拌过夜。随后使用 2 M NaOH 将溶液的 pH 调节至 4.6，再用 Whatman 过滤纸过滤去除未溶解的颗粒。为了增强乳化效果，向新制备的壳聚糖溶液中加入 Tween 80（0.1%，w/v），通过磁力搅拌 30 分钟。然后将精油加入壳聚糖/Tween 80 的水相中，并按照前一节描述的方法进行超声均质化。接着加入溶解在蒸馏水中的 TPP（0.3% w/v），继续超声处理 2 分钟以促进离子凝胶化。最终制剂含有 2.5%（v/v）的精油，立即储存在 4 °C 下直至进一步表征。
2.4. 纳米制剂的表征
2.4.1. 颗粒大小、多分散指数和 zeta 电位
使用 Zetasizer Nano ZS 仪器（Malvern Instruments Ltd.，伍斯特郡，英国）通过动态光散射（DLS）分析新鲜制备的 O/W 纳米乳液和壳聚糖纳米颗粒的颗粒大小分布和多分散指数（PDI）。分别设置折射率为 1.47 和 1.7。散射光的检测角度调整为 173° 以实现非侵入式后向散射检测，并用去离子水（1:100）稀释样品以减少多次散射效应。
2.4.2. 包封效率和负载能力
使用 UV–vis 光谱法（Soltanzadeh 等，2021）测定 O/W 纳米乳液或壳聚糖纳米颗粒中封装的 D. ambrosioides 精油的含量，略有修改。简要来说，取 200 µL 的纳米制剂样品与 5 mL 的 2 M 盐酸混合，在 95 °C 下回流 30 分钟。冷却至室温后，加入 2 mL 乙醇，然后在 6000 rpm 下离心 5 分钟。使用 UV–vis 分光光度计（Shimadzu UV-1900 I，大阪，日本）在 200–800 nm 波长范围内分析上清液中的精油含量，根据吸收光谱（图 S1）确定最大吸光度（λmax = 360 nm）进行定量测量。同时制备不含精油的 O/W 纳米乳液或壳聚糖纳米颗粒空白样品，并在相同条件下进行处理。负载的EO浓度是使用为溶解在乙醇中的游离D. ambrosioides EO建立的校准曲线来确定的（R² = 0.987）。然后使用以下公式计算了包封效率（EE %）和负载能力（LC %）。对于LC的测量，通过冻干在5 hPa和-20 °C下进行3天来干燥壳聚糖纳米颗粒。EE(%) = (加载的EO总量 / 初始EO总量) × 100；LC% = (加载的EO总量 / 冻干后纳米颗粒的重量) × 100。
2.4.3 体外释放行为
采用透析法评估D. ambrosioides EO从O/W纳米乳液和壳聚糖纳米颗粒中的体外释放曲线。该程序改编自(Zheng等人，2022年)，并进行了轻微修改。简要来说，将5 mL的纳米制剂放入一个分子量为14 KDa的透析膜中，该膜已在蒸馏水中预处理过。然后将袋子浸入一个装有50 mL缓冲溶液的烧杯中，缓冲溶液在28 °C下保持，并在150 rpm下进行连续磁力搅拌。在预定的时间间隔内，从烧杯中取出2 mL的样品，并立即用等体积的新鲜缓冲溶液替换。为了确定从纳米乳液或壳聚糖纳米颗粒中释放的D. ambrosioides EO的总量，使用UV–Vis分光光度计在360 nm处测量释放介质中的EO浓度，如前一节所述。然后通过将每个时间点释放的总量(Mt)除以样品中初始加载的EO量(M₀)来计算D. ambrosioides EO的累积释放百分比：累积释放(%) = ∑(t=0到t) Mt / M₀ × 100。
2.4.4 傅里叶变换红外光谱
使用Jasco FTIR 4600 LE仪器（日本）在4000–400 cm⁻¹的光谱范围内记录了壳聚糖、壳聚糖纳米颗粒、D. ambrosioides EO、负载EO的纳米乳液和壳聚糖纳米颗粒的傅里叶变换红外(FTIR)光谱。壳聚糖和EO-壳聚糖纳米颗粒以粉末形式分析，而精油和纳米乳液则以液体形式分析。壳聚糖纳米颗粒的干燥是通过在5 hPa和-20 °C下进行3天的冻干来完成的。
2.4.5 扫描电子显微镜
使用Thermo Fisher Quanta FEG450显微镜和ETD探测器（二次电子）以及10000x和20000x的放大倍数，通过扫描电子显微镜(SEM)观察冻干的壳聚糖纳米颗粒的微观结构。
2.4.6 接触角和表面张力测量
通过测量新鲜切割的叶样上液滴的接触角来评估蒸馏水、O/W纳米乳液和壳聚糖纳米颗粒对鹰嘴豆叶的润湿性。所有测量都使用DataPhysics Instruments GmbH（德国Filderstadt）的静止滴法进行，滴液体积为5 μL，并小心地滴在叶表面。此外，测量在室温和压力下进行，并在滴液放置后立即记录。
2.5 昆虫饲养
在ICARDA实验站（33°56'10"N, 6°69'21"W）的受侵染鹰嘴豆田中收集H. armigera幼虫。根据(Koul等人，1997年)的方法，在受控实验室条件下（27 ± 2 °C，75 ± 5%相对湿度，14:10的光周期）饲养这些幼虫。每个幼虫单独放在培养皿上，并提供人工饲料直到化蛹。羽化后，将成虫放入昆虫学网笼（90 cm × 90 cm × 90 cm）中，并提供10%的蜂蜜溶液作为食物。每天收集卵并转移到培养皿中，而新孵化的幼虫则在人工饲料上饲养。第三龄幼虫用于各种生物测定。
2.6 生物测定
2.6.1 接触试验
在实验室条件下（25 ± 2 °C，75% RH，14/10 h光/暗光周期）进行直接接触试验，采用完全随机设计，每个浓度重复五次。每个玻璃培养皿中含有五个H. armigera第三龄幼虫。评估了五种浓度的D. ambrosioides EO (DAEO)、D. ambrosioides壳聚糖纳米颗粒(DAEO-CSNPs)和D. ambrosioides纳米乳液(DAEO-NE)（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%）。对照组幼虫暴露于壳聚糖纳米颗粒和含有Tween 80 (0.1%)的水中。处理组和对照组幼虫都喂食人工饲料。通过喷洒处理，使溶液覆盖每个幼虫的整个身体表面。在处理后24至192小时内，定期用细画笔轻轻刺激幼虫的运动来评估死亡率，没有反应的个体被记录为死亡。由于同类相食或对机械刺激无反应而消失的幼虫也被视为死亡。幼虫的死亡率(%)通过以下公式计算并随后进行调整：校正死亡率(%) = [(处理组的死亡总数(Mt) - 对照组的死亡总数(Mc)) / 对照组的初始幼虫数(M₀) × 100]。
2.6.2 抗食性试验
通过饲料掺入法，使用(Koul等人，1997年)的方法，评估精油及其制剂对H. armigera第三龄幼虫生长和发育的影响。实验前，幼虫禁食六小时，然后引入含有不同处理的培养皿中的人工饲料。测试了五种浓度的DAEO、DAEO-CSNPs和DAEO-NE（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%）。实验采用完全随机设计，每个重复一次，每个重复使用一个幼虫。以含有壳聚糖和Tween 80的人工饲料作为对照。在喂食24小时后监测处理组和对照组的饲料消耗情况。之后，将处理过的饲料替换为未处理的饲料，并测量昆虫的重量和死亡率直到化蛹。
2.6.3 温室试验
在受控生长室条件下（24 ± 2 °C，75% RH，14/10 h光/暗光周期），进行全植物生物测定，以评估杀虫剂对鹰嘴豆植物上H. armigera幼虫的有效性。在装有准备好的土壤混合物（土壤和泥炭藓）的小盆中播种本地品种鹰嘴豆种子Rizki (FLIP 83-48 C)。种植15天后，每个盆保留两株植物。处理包括D. ambrosioides精油(EO)、DAEO-CSNPs和DAEO-CSNPs-NE，浓度分别为1.5%和2%，这些浓度是基于之前的实验室生物测定选择的，以及阳性对照Proclaim® 05 SG，其中含有5%的Emamectin Benzoate，推荐剂量为250 g/ha。Tween 80 (0.1%)和壳聚糖(0.3%)作为阴性对照。采用随机完全区组设计(RCBD)，每个处理重复五次。处理针对在鹰嘴豆植物营养阶段早期受侵染的H. armigera第三龄幼虫。每个盆中引入两只幼虫，并使用200 mL的手动喷雾器将处理液直接喷洒在植物上。在处理后24至192小时内记录幼虫的死亡率。
2.7 统计分析
在统计分析之前，将死亡率百分比转换为角度值（arcsine √P）。转换后的百分比在实验室条件下使用双因素方差分析(ANOVA)进行分析，考虑浓度和处理因素。在温室条件下，转换后的百分比进行单因素方差分析。通过probit分析（Finney，1971年）确定50%和90%死亡率的致死浓度(LC50和LC90)。使用XLSTAT和Tukey检验在p < 0.05的水平上分析均值。
3. 结果
3.1 GC-MS分析
使用GC-MS分析了精油的化学成分（表1，图1）。在D. ambrosioides精油中鉴定出19种化合物，主要由单萜类化合物组成（99.12%），其次是倍半萜类化合物（0.24%）和其他成分（0.3%）。主要成分是ascaridole（48.33%）和ρ-cymene（33.83%），两者合计占总组成的82.16%以上。
表1. 使用GC−MS的D. ambrosioides EO的化学组成
化合物 | RI | CalR | Rep | 相对丰度%
-----------------|------|------|-----------|
Terpinene | 1018 | 10 | 14 | 0.63|
Cymene | 1027 | 10 | 20 | 33.83|
Sylvestrene | 1030 | 10 | 25 | 0.24|
Terpinene | 1061 | 11 | 54 | 0.03|
Octanol | 1073 | 10 | 63 | 0.03|
α-p-dimethylstyrene | 1092 | 10 | 89 | 0.25|
Nonanal | 1106 | 11 | 00 | 0.02|
Mentha-2,8-dien-1-ol | 1124 | 11 | 19 | 0.09|
Pinocarveol | 1135 | 11 | 39 | 0.13|
Terpineol | 1143 | 11 | 40 | 0.03|
Cymen-8-ol | 1189 | 11 | 79 | 0.37|
Terpineol | 1195 | 11 | 86 | 0.03|
Ascaridole | 1246 | 12 | 34 | 48.33|
Piperitone epoxide | 1260 | 12 | 50 | 0.56|
Piperitone epoxide | 1263 | 12 | 52 | 2.02|
Thymol | 1296 | 12 | 89 | 2.76|
Carvacrol | 1306 | 12 | 98 | 2.96|
trans-Ascaridole | 1312 | 13 | 03 | 7.31|
Isobornyl isobutanoate | 1426 | 14 | 31 | 0.04|
图1. D. ambrosioides精油的GC−MS色谱图。
3.2 纳米制剂的表征
3.2.1 颗粒表征
O/W纳米乳液和壳聚糖纳米颗粒的粒径分布显示在图2中，相应的平均粒径和ζ电位总结在表2中。原始壳聚糖纳米颗粒的平均粒径相对较大，为429.37 ± 35.89 nm，多分散指数(PDI)为0.28 ± 0.015，表明分布较为不均匀。这些样品还记录了正的ζ电位+34.25 ± 0.07 mV。将D. ambrosioides EO掺入壳聚糖纳米颗粒(DAEO-CSNPs)后，平均粒径减小到291.47 ± 16.53 nm，PDI略有增加（0.33 ± 0.033），表明成功包封并形成了相对更均匀的纳米颗粒。ζ电位也增加到+40.49 ± 1.22 mV，可能是由于壳聚糖表面质子化氨基的暴露增加，从而提高了稳定性（Bertonceli等人，2025年）。
表2. 装载D. ambrosioides的壳聚糖纳米颗粒(DAEO-CSNPs)和O/W纳米乳液(DAEO-NE)的平均粒径、多分散指数(PDI)、ζ电位、包封效率(EE)和负载能力(LC)。
样品 | 粒径 | PDI | ζ电位 | EE% | LC%
------|------|------|------|------|
Chitosan | 429.37 ± 35.89 | a | 0.28 ± 0.015 | b |
DAEO-CSNPs | 291.47 ± 16.53 | b | 0.33 ± 0.033 | ab |
40.49 ± 1.22 | a | 97.39 | 1 ± 0.37 | 6 a |
DAEO-NE | 265.96 ± 18.83 | b | 0.41 ± 0.013 | a |
-16.25 ± 4.41 | b | 96.85 | 4 ± 0.15 | 3 a |
50.59 ± 4.10 | 0 a |
另一方面，纳米乳液系统(DAEO-NE)显示出最小的平均粒径（265.96 ± 18.83 nm）和最高的PDI（0.41 ± 0.013）在三种制剂中。这可能是由于纳米乳液系统的非均匀性，其中包含不同大小的液滴分布，而不是严格单分散的群体。这种非均匀性可能源于乳化过程和不同大小液滴的共存，导致更宽的粒径分布。在乳化系统中还观察到了略微负的ζ电位（−16.25 ± 4.41 mV），表明乳液表面存在带负电的表面活性杂质（例如，羟基离子）。总体而言，两种包封系统似乎在纳米颗粒表面提供了足够的物理（即静电或空间）力，使得形成了相对较小且粒径分布均匀的颗粒。所研究系统中EO的EE和LC分别达到了约96-97%和50-53%的出色水平，证实了两种系统适用于有效的EO包封。
3.2.2 体外释放研究
图3显示了D. ambrosioides EO从O/W纳米乳液和壳聚糖纳米颗粒中的释放曲线。两种制剂都表现出特征性的双相释放行为，最初7小时内快速释放，随后是持续的释放阶段，直到96小时达到最大释放量。前几小时的快速释放速率在O/W纳米乳液(DAEO-NE)中比壳聚糖纳米颗粒(DAEO-CSNPs)更为明显。这种情况通常归因于吸附在表面或结合不牢固的活性化合物的扩散，这些化合物在暴露于释放介质时容易释放（Miastkowska等人，2020年）。在此阶段之后，释放速率减慢并进入一个更受控制和持续的阶段，可能受扩散和/或纳米颗粒逐渐侵蚀的影响。有趣的是，在整个持续释放阶段，乳液的累积释放百分比始终高于壳聚糖纳米颗粒，表明其扩散行为可能更有效且更快。96小时后，两种制剂的累积释放量均接近100%。这些结果表明，虽然两种系统都能有效传递活性化合物，但基于纳米乳液的制剂可能更适合需要快速和高效释放的应用。当需要更长时间和更受控制的释放时，壳聚糖纳米颗粒可能更有优势。
图3. D. ambrosioides从O/W纳米乳液(DAEO-NE)和壳聚糖纳米颗粒(DAEO-CSNPs)中的体外释放曲线。
3.2.3 傅里叶变换红外(FTIR)光谱
图4中的FTIR光谱提供了关于D. ambrosioides EO与制剂成分（即壳聚糖、TPP和植物油）之间化学成分和相互作用的信息。壳聚糖的光谱(a)在3400 cm⁻¹处显示出一个宽的吸收带，对应于O–H和N–H伸缩振动（Ali等人，2018年）。它还在大约1650 cm⁻¹和1580 cm⁻¹处显示出特征峰，分别对应于酰胺I（C=O伸缩）和酰胺II（N–H弯曲）基团。在壳聚糖纳米颗粒(DAEO-NE, b)的光谱中，这些特征峰基本保持不变，尽管强度有所变化，并且在1000 cm-1以下形成了新的带，表明通过离子凝胶化形成了静电相互作用和氢键（Ali等人，2018年）。这些变化表明纳米颗粒的成功合成以及壳聚糖基质的结构重组。下载：下载高分辨率图像（120KB）下载：下载全尺寸图像图4. (a) 壳聚糖，(b) 空白壳聚糖纳米颗粒，(c) 装载了D. ambrosioides的壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs），(d) D. ambrosioides纳米乳液（DAEO-NE）和(e) D. ambrosioides精油的FTIR光谱。另一方面，D. ambrosioides精油（e）在3600-3000 cm⁻¹区域显示出一个独特且强烈的吸收带，这可能对应于O-H伸缩振动（Ali等人，2018年）。在1700 cm⁻¹附近也观察到一个强吸收带，主要归因于C=O伸缩振动，这是萜类和芳香成分的典型特征。O/W纳米乳液（DAEO-NE，d）的光谱完美保留了精油的特征峰，表明精油在纳米乳液配方中保持了其化学完整性。然而，装载了精油的壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs，c）的光谱显示了精油的特征峰，但没有明显的壳聚糖或壳聚糖纳米颗粒的吸收带，特别是在对应于酰胺I和酰胺II伸缩振动的区域。这表明在封装过程中，精油成分和壳聚糖聚合物链可能发生了分子间的相互作用，如氢键作用。
3.2.4 扫描电子显微镜观察
壳聚糖纳米颗粒的SEM观察显示其具有高度聚集的结构，并且颗粒大小分布相对均匀（图5a）。颗粒的大小在纳米到亚微米范围内，表明其具有适合控制释放应用的相对较高的比表面积。装载了精油的壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）的SEM图像也显示了密集且聚集的结构，颗粒相对较小，这与DLS测量结果一致（表2）。DAEO-CSNPs的小而有序的形式可以更好地与昆虫角质层相互作用，增强精油的渗透性和持久的杀虫活性。然而，这也可能导致储存期间由于表面积增加而加速释放。
3.2.5 接触角和界面张力
进行接触角测量是为了评估测试配方中鹰嘴豆叶子的表面润湿性。如图6所示，蒸馏水获得了相对较高的接触角（91.76°），表明鹰嘴豆叶子的表面是疏水性的。壳聚糖纳米颗粒的接触角降低到57.19 ± 1.64°，这可能是由于系统中存在Tween 80分子所致。实际上，块状Tween 80溶液的接触角也相对相似，表明Tween 80在降低壳聚糖纳米颗粒的接触角方面起着重要作用。有趣的是，DAEO-NE和DAEO-CSNPs的接触角进一步降低到46.50 ± 0.97°和45.35 ± 0.96°，表明表面相互作用程度更高。这可能是由于颗粒表面残留的油或部分暴露的油分子增加了疏水油与表面之间的直接接触。
润湿是一个复杂的现象，取决于多个因素，即固体表面（这里是鹰嘴豆叶子）的表面自由能、表面活性剂的表面张力、液体与固体表面成分之间的化学亲和力以及表面拓扑或微观结构（Tie等人，2023年）。Tween 80是一种非离子表面活性剂，通常与带电和中性固体表面都有良好的化学亲和力，因为没有静电排斥作用，并且分子堆积程度较高。它还具有较低的表面张力，这促进了在液体/空气和固体/空气界面上的吸附。表面张力（ST）测量值作为滴落时间的函数绘制出来，提供了对测试系统表面活性和稳定效果的洞察（图7）。正如预期的那样，蒸馏水显示出最高的ST值，保持在75–78 mN/m左右，因为没有表面活性剂的存在。相比之下，壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）显示出最低的ST值（约38–40 mN/m），甚至低于块状Tween 80溶液。这种界面张力的显著降低表明由于壳聚糖和Tween 80分子之间的协同效应，表面活性增强，从而促进了与空气/水界面的相互作用。O/W纳米乳液（DAEO-NE）显示出中等的IFT值，波动在52–56 mN/m之间。Tween 80和壳聚糖溶液分别显示出中等的ST值，约为45 mN/m和50–52 mN/m。
3.3 生物学测定
3.3.1 接触测试
表3展示了Helicoverpa armigera幼虫暴露于基于D. ambrosioides的配方后的死亡率。ANOVA显示，处理类型、剂量和暴露时间对死亡率有显著影响（D = 4；所有观察日的p < 0.0001，表S1）。在所有处理中，死亡率通常随时间和剂量的增加而增加，表明存在剂量和时间依赖性效应。在所有处理中，2.5%的D. ambrosioides纳米乳液（DAEO-NE）在应用后第三天和第四天的死亡率最高，分别达到了92%和95.83%。而在2%的剂量下，第七天的死亡率为91.67%。壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）是第二有效的处理方法，在2.5%的剂量下，第三天和第八天的死亡率分别为91.30%和95.45%。单独的D. ambrosioides精油（DAEO）在第五天的最大死亡率为91.76%。处理类型和剂量之间的交互作用在统计上不显著（p > 0.05），表明每种配方的有效性随着剂量的增加而类似增加。
表3. H. armigera幼虫暴露于不同D. ambrosioides精油及其配方后的平均死亡率±标准误差
处理剂量（%）校正死亡率（%）±标准误差
1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D 8
D. ambrosioides 壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs） 0.5 28.00 ± 4.90 a 33.33 ± 10.21 a 33.33 ± 10.21 a 34.78 ± 9.72 a 34.78 ± 9.72 a 36.36 ± 13.25 a 37.50 ± 9.32 a 39.13 ± 12.68 a 136.00 ± 4.00 ab
40.00 ± 6.32 ab 54.17 ± 10.21 ab 62.50 ± 7.80 ab 65.22 ± 8.70 ab 69.57 ± 11.08 a 73.91 ± 10.65 ab 72.73 ± 11.13 ab
1.56 0.00 ± 12.65 ab 72.00 ± 8.00 ab 75.00 ± 7.80 ab 75.00 ± 7.80 ab 73.91 ± 8.13 abc 73.91 ± 8.13 ab 73.91 ± 8.13 ab 72.73 ± 8.50 a 268.00 ± 4.90 ab 76.00 ± 7.48 abc 79.17 ± 6.59 ab 79.17 ± 6.59 ab 82.61 ± 4.35 abc 82.61 ± 4.35 ab 86.96 ± 5.32 ab 90.91 ± 5.57 ab
2.58 0.00 ± 6.32 ab 88.00 ± 4.90 ab 87.50 ± 5.10 ab 87.50 ± 5.10 abc 86.96 ± 5.32 abc 91.30 ± 5.32 ab 91.30 ± 5.32 ab 95.45 ± 4.55 ab
D. ambrosioides 纳米乳液（DAEO-NE） 0.5 24.00 ± 7.48 abc 36.00 ± 4.00 abc 44.00 ± 11.66 ab 41.67 ± 12.15 abc 54.17 ± 12.15 abc 66.67 ± 5.10 ab 70.83 ± 5.10 ab 69.57 ± 5.32 ab 132.00 ± 10.20 ab
cd 44.00 ± 4.00 abc 40.00 ± 6.32 abc 54.17 ± 7.80 abc 54.17 ± 7.80 abcd 58.33 ± 9.32 ab 70.83 ± 5.10 ab 73.91 ± 4.35 ab 1.56 0.00 ± 8.94 abcd 76.00 ± 4.00 abc 76.00 ± 4.00 abc 75.00 ± 4.17 abc 75.00 ± 4.17 abcd 79.17 ± 6.59 ab 79.17 ± 6.59 ab 79.26 ± 6.87 ab 272.00 ± 4.90 abcde 72.00 ± 4.90 bcd 84.00 ± 7.48 abcd 87.50 ± 5.10 abcd 87.50 ± 5.10 abcd 87.50 ± 5.10 abc 91.67 ± 5.10 abc 91.30 ± 5.32 abc
2.58 4.00 ± 4.00 cde 92.00 ± 4.90 d 92.00 ± 4.90 bcd 95.83 ± 4.17 bcd 95.83 ± 4.17 abcde 95.83 ± 4.17 abc 95.83 ± 4.17 abc 95.65 ± 4.35 abc
D. ambrosioides 精油（DAEO） 0.5 32.00 ± 4.90 bcde 44.00 ± 4.00 cd 44.00 ± 4.00 bcd 41.67 ± 4.17 cd 45.83 ± 5.10 bcde 45.83 ± 5.10 bcd 45.83 ± 5.10 bcd 43.48 ± 5.32 bcd 148.00 ± 4.90 def 52.00 ± 4.90 d 56.00 ± 7.48 d 54.17 ± 7.80 cd 58.33 ± 9.32 cde 58.33 ± 9.32 bcd 62.50 ± 7.80 abcd 60.87 ± 8.13 abc 1.55 2.00 ± 4.90 ef 60.00 ± 6.32 d 64.00 ± 4.00 cd 66.67 ± 5.10 d 70.83 ± 5.10 cde 70.83 ± 5.10 abcd 75.00 ± 4.17 abcd 73.91 ± 4.35 abcd 276.00 ± 7.48 def 80.00 ± 6.32 d 80.00 ± 6.32 cd 79.17 ± 6.59 d 83.33 ± 4.17 de 83.33 ± 4.17 cd 87.50 ± 5.10 cd 86.96 ± 5.32 cd 2.58 0.00 ± 6.32 def 84.00 ± 4.00 d 84.00 ± 4.00 de 87.50 ± 5.10 d 91.67 ± 5.10 e 91.67 ± 5.10 d 91.67 ± 5.10 d 91.30 ± 5.32 d
对照 Tween 80 0.10.00 ± 0.00 f 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e
控制 壳聚糖 0.30.00 ± 0.00 f 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e 0.00 ± 0.00 e
Pr > F（模型）<0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
显著 是 是 是 是 是 是 是 是 是
Pr > F（处理*剂量）0,723 0,251 0,443 0,919 0,654 0,184 0,288 0,250
显著 否 否 否 否 否 否 否 否
同一列中带有不同字母的值基于Tukey’s HSD显著不同（p < 0.05）。D：天数
与这些生物学测定的结果一致，probit分析显示LC₅₀和LC₉₀值随时间逐渐降低，证实了毒性的增加。对于来自D. ambrosioides的壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs），LC₅₀从第1天的1.114%降低到第8天的0.604%，而LC₉₀从5.297%降低到1.910%，表明随着暴露时间的延长，效力显著提高（表4）。同样，对于D. ambrosioides纳米乳液（DAEO-NE），LC₅₀值从1.138%降低到0.316%，LC₉₀值从3.715%降低到1.864%，突显了它们的持续性和优越的毒性。相比之下，粗精油显示出略高的LC₅₀和LC₉₀值（分别为0.589-0.724%和2.198-4.269%），反映了较低但仍然显著的效力。总体而言，纳米配方（DAEO-CSNPs和DAEO-NE）获得的较低LC₅₀和LC₉₀值表明纳米封装和乳化显著提高了D. ambrosioides精油的生物利用度和持久性。
表4. 不同暴露时间下D. ambrosioides精油及其配方对H. armigera的接触测试的致死浓度（LC₅₀和LC₉₀）
处理 时间（天）LC₅₀ LC₉₀ χ² p
截距 斜率 [log₁₀(剂量)]
D. ambrosioides 壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs） 11.114 5.297 23.69 38 10.01 65 6-2.65 21 71.89 51 52 0.89 13.31 12 1.25 68 50.01 91 9-3.81 46 02.23 25 73 0.77 63.02 01 67.32 49 90.00 100-3.49 69 62.18 74 64 0.67 63.09 02 76.42 21 00.00 47-2.48 96 61.95 82 15 0.63 72.75 44 14.70 12 30.00 02 6-2.64 43 42.00 84 46 0.62 82.42 37 88 36 11 60.00 30 4-3.28 52 22.18 07 17 0.55 82.25 45 58 11 50.00 49 6-2.91 59 22.11 13 88 0.60 41.91 04 0.97 15 10.00 77 2-4.68 03 52.56 78 9
D. ambrosioides 纳米乳液（DAEO-NE） 11.138 3.71 53 4.41 25 60.00 98 8-5.10 76 72.49 28 72 0.97 73.93 61 5.04 43 20.03 03 5-3.30 65 52.08 67 53 0.80 72.63 61 69 18 90.02 65 0-4.73 80 42.49 34 54 0.80 22.19 81 5.51 38 70.02 91 6-6.40 98 2.92 55 05 0.65 22.12 82 0.48 54 40.02 01 7-4.54 65 92.50 18 46 0.40 42.11 76.50 19 0.08 39 5-1.42 90 11.78 06 57 0.31 61.90 78 92 97 0.05 82 1-0.74 40 81.64 67 58 0.31 61.86 41 0.51 79 0.04 77 8-0.51 65 21.59 77
D. ambrosioides 精油（DAEO） 11.01 24.85 32 7.08 77 0.01 37 9-2.53 95 91.88 48 02 0.78 94 65 61 82 12 95 0.02 36 1-1.47 35 31.66 94 73 0.71 44.26 93 61 50.02 91 6-4.68 03 52.56 78 9
D. ambrosioides 纳米乳液（DAEO-NE） 11.138 3.71 53 4.41 25 60.00 98 8-5.10 76 72.49 28 72 0.97 73.93 61 5.04 43 20.03 03 5-3.30 65 52.08 67 53 0.80 72.63 61 69 18 90.02 65 0-4.73 80 42.49 34 54 0.80 22.19 81 5.51 38 70.02 91 6-6.40 98 2.92 55 05 0.65 22.12 82 0.48 54 40.02 01 7-4.54 65 92.50 18 46 0.40 42.11 76.50 19 0.08 39 5-1.42 90 11.78 06 57 0.31 61.90 78 92 97 0.05 82 1-0.74 40 81.64 67 58 0.31 61.86 41 0.51 79 0.04 77 8-0.51 65 21.59 77
D. ambrosioides 精油（DAEO） 11.01 24.85 32 7.08 77 0.01 37 9-2.53 95 91.88 48 02 0.78 94 65 61 82 12 95 0.02 36 1-1.47 35 31.66 94 73 0.71 44.26 93 61 50.02 91 6-2.61 81 32.00 59 66 0.62 42.71 03 0.38 66 90.01 17 6-2.61 81 32.00 59 67 0.58 92.40 47 0.12 18 80.00 35 7-2.94 70 02.10 67 88 0.58 92.40 47 0.12 18 80.00 35 7-2.94 70 02.10 67 88
LC₅₀ = 致死浓度，杀死50%的暴露昆虫；LC₉₀ = 致死浓度，杀死90%的暴露昆虫；χ² = 卡方。b 由于拟合优度χ²显著（p < 0.15），因此使用了异质性因子。由于拟合优度χ²不显著（p > 0.15），在计算置信限时未使用异质性因子。
D. ambrosioides精油（DAEO）及其配方处理在H. armigera的整个发育阶段引起了显著的形态异常（图8）。处理后立即出现神经系统症状，暴露于基于D. ambrosioides的配方的幼虫表现出震颤、运动紊乱和逐渐瘫痪，表明神经信号和运动协调迅速受到破坏。处理过的幼虫表现出色素沉着的黑色身体和畸形，有些表现出不完全蜕皮的幼虫-蛹中间体。蛹通常体型较小且畸形，有些未能成功发育为成虫。在出现的成虫中，观察到严重的翅膀畸形，如扭曲和发育不良的翅膀。相比之下，对照组在所有阶段都表现出正常的形态，有健康的幼虫、完全形成的蛹和正常发育的成虫。这些效应可能归因于DAEO的主要成分，特别是ascaridole和p-cymene，据报道它们会诱导氧化应激并干扰神经信号传导，可能破坏蜕皮和正常发育。此外，纳米配方的持续释放行为可能延长了幼虫与活性化合物的接触时间，从而加剧了发育紊乱和观察到的畸形程度。
3.3.2 抗摄食和摄入生物测定
在528小时的实验期间（DF = 16，p < 0.001，表S2），D. ambrosioides精油的配方类型和剂量显著影响了H. armigera幼虫的生长。在对照组（壳聚糖和Tween 80）中，幼虫持续生长，在试验结束时达到超过250毫克的最大重量。相比之下，所有油类处理都在不同程度上抑制了幼虫的发育。最显著的抑制效果出现在使用壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）且剂量较高（2.0–2.5%）的情况下，处理后3天幼虫体重稳定，并在整个实验过程中保持在20毫克以下（图9B）。纳米乳液（DAEO-NE）和纯精油（DAEO）配方也减少了幼虫的生长，尽管其效果较弱且变化较大，尤其是在中等剂量下（图9A-C）。生长抑制在168至384小时期间最为明显，这与幼虫的快速进食阶段相吻合。总体而言，结果表明D. ambrosioides精油能够抑制幼虫生长，其中纳米颗粒配方在时间上提供了最一致的效果。
下载：下载高分辨率图片（591KB）
下载：下载全尺寸图片
图9. D. ambrosioides精油（A）、纳米乳液（DAEO-NE）和壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）在528小时内对H. armigera幼虫体重的影响。线条代表最小二乘均值（± SE）。所有处理和剂量的统计分析均采用双因素ANOVA（因素：处理 × 剂量），随后进行Tukey's HSD检验（p < 0.05）。每个暴露时间上方的不同字母表示处理和剂量之间存在显著差异。
H. armigera幼虫在接触D. ambrosioides精油配方24小时后的拒食指数（FDI%）总结在表S2中。在各种处理中，壳聚糖纳米颗粒配方（DAEO-CSNPs）显示出明显的剂量依赖性效应，从0.5%剂量的13.95%增加到2%剂量的最大值21.45%，然后在2.5%剂量时略有下降（16.01%）。乳液配方（DAEO-NE）在低浓度下显示出最高的拒食效果（0.5%剂量为21.96%，1%剂量为20.40%），但在中等剂量下效果下降（1.5%剂量为8.04%，2%剂量为7.07%）。在最高剂量（2.5%）时，DAEO-NE的部分拒食效果得到恢复（16.11%）。纯精油（DAEO）在所有浓度下均表现出中等程度的拒食效果（9.66-16.52%），其中0.5%剂量的效果最强，而在更高剂量下效果减弱。总体而言，DAEO-CSNPs和DAEO-NE在较低至中等浓度下的拒食效果最高，而DAEO的效果较弱但较为稳定。
幼虫死亡率显著受到配方、剂量和暴露时间的影响（双因素ANOVA，p < 0.05；表S3）。壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）通过摄入方式表现出最强的杀虫活性，产生快速且持续的效果。在最高浓度（2%和2.5%）下，24小时内的死亡率分别达到60%和40%（表6）。2.5%剂量下的死亡率从120小时开始上升至100%，而2%剂量在384小时时达到100%死亡率。DAEO-CSNPs的中等剂量（1.0-1.5%）导致较慢但显著的死亡率，在432小时（18天）时超过70-100%。
表6. 不同配方和剂量的D. ambrosioides精油处理后H. armigera幼虫的平均死亡率（± SE）随时间的变化。
处理 剂量（%） 死亡率（%）
24小时 72小时 120小时 168小时 240小时 312小时 384小时 432小时 480小时 528小时
DAEO-CSNPs 0.5 20.00 ± 13.33 a 20.00 ± 13.33 ab 30.00 ± 15.27 ab 40.0 ± 16.32 ab 40.0 ± 16.32 ab 40.0 ± 16.32 ab 40.00 ± 16.32 abc 50.0 ± 16.66 abc 60.0 ± 16.32 abc 60.0 ± 16.32 abc 130.0 ± 15.27 a 30.0 ± 15.27 ab 40.0 ± 16.32 ab 50.0 ± 16.66 ab 60.0 ± 16.32 ab 60.0 ± 16.32 ab 70.0 ± 15.27 ab 80.0 ± 13.33 ab 80.0 ± 13.33 ab 80.0 ± 13.33 ab 1.5 30.0 ± 15.27 a 40.0 ± 16.32 ab 60.0 ± 16.32 ab 60.0 ± 16.32 ab 70.0 ± 15.27 ab 70.0 ± 15.27 ab 70.00 ± 15.27 ab 90.00 ± 10 ab 100.00 ± 0.00 a 100.00 ± 0.00 a 240.0 ± 16.32 a 50.0 ± 16.66 ab 70.0 ± 15.27 ab 80.0 ± 13.33 a 90.0 ± 10 a 90.0 ± 10 a 100.0 ± 0.00 a 100.0 ± 0.00 a 100.0 ± 0.00 a 100.0 ± 0.00 a 2.5 60.0 ± 16.32 a 80.0 ± 13.33 a 100.0 ± 0.0 a 100.0 ± 0.0 a 100.0 ± 0.0 a 100.0 ± 0.0 a 100.0 ± 0.0 a 100.0 ± 0.0 a 100.0 ± 0.0 a
DAEO-NE 0.5 20.0 ± 13.33 a 20.0 ± 13.33 ab 30.0 ± 15.27 ab 30.0 ± 15.27 ab 40.0 ± 16.32 ab 40.0 ± 16.32 ab 40.0 ± 16.32 abc 40.0 ± 16.32 abc 40.0 ± 16.32 abc 40.0 ± 16.32 abc 120.0 ± 13.33 a 20.0 ± 13.33 ab 40.0 ± 16.32 ab 40.0 ± 16.32 ab 40.0 ± 16.32 ab 50.0 ± 16.66 ab 50.0 ± 16.66 abc 50.0 ± 16.66 abc 50.0 ± 16.66 abc 50.0 ± 16.66 abc 1.5 20.0 ± 13.33 a 20.0 ± 13.33 ab 50.0 ± 16.66 ab 50.0 ± 16.66 ab 50.0 ± 16.66 ab 60.0 ± 16.32 abc 60.0 ± 16.32 abc 60.0 ± 16.32 abc 60.0 ± 16.32 abc 230.0 ± 15.27 a 30.0 ± 15.27 ab 40.0 ± 16.32 ab 70.0 ± 15.27 ab 70.0 ± 15.27 ab 70.0 ± 15.27 ab 70.0 ± 15.27 ab 70.0 ± 15.27 ab 80.0 ± 13.33 ab 80.0 ± 13.33 ab 80.0 ± 13.33 ab
壳聚糖 0.0 ± 0.0 a 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c
Tween 80 0.0 ± 0.0 a 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 b 0.0 ± 0.0 c 0.0 ± 0.0 c
P值（模型） 0.273 0.015 0 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001
P值（处理*剂量） 0.989 0.925 0.523 0.977 0.955 0.998 0.960 0.912 0.916 0.916
同一列中带有不同字母的数值具有显著差异（双因素ANOVA，Tukey’s HSD，p < 0.05）。壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）、纳米乳液（DAEO-NE）、精油（DAEO）。
纳米乳液配方（DAEO-NE）在高剂量下也导致了显著的死亡率。DAEO-NE 2.5%在24小时时达到了30%的死亡率，并在384小时时达到完全死亡。同一配方的2%浓度在应用后480小时时达到了80%的最大死亡率。DAEO-NE的较低剂量（0.5-1.5%）产生了中等效果，在最终观察时达到了40-60%的死亡率。纯精油（DAEO）的整体效果较差，因为在2.5%剂量下的死亡率未超过80%，而在较低剂量下死亡率≤60%（表6）。对照组（Tween 80和壳聚糖）在整个生物测定过程中没有引起任何死亡率。总体而言，DAEO-CSNPs在2%和2.5%剂量下以及DAEO-NE在2.5%剂量下是最有效的处理方法，通过摄入方式迅速且完全杀死了幼虫。
这些在生物测定中观察到的趋势通过probit分析得到了证实（表7），该分析显示LC₅₀值随时间逐渐降低，证实了所有配方的毒性随时间的增加。然而，在早期暴露时间，由于某些处理（特别是DAEO和DAEO-NE）在测试浓度范围内的死亡率不足，无法估计LC₅₀和LC₉₀值。Probit分析需要明确的剂量-反应关系和部分死亡率；因此，这些时间点观察到的低或均匀的死亡率阻止了可靠的模型拟合。这种行为可能反映了时间依赖性的毒性效应，特别是在摄入测定中，活性化合物需要时间被摄入、吸收并发挥其生物活性。
表7. 不同暴露时间后D. ambrosioides及其配方对H. armigera的致死浓度（LC₅₀和LC₉₀）的摄入测试。
处理 时间（小时） LC₅₀ LC₉₀ χ² p
截距 斜率 [log₁₀(剂量)]
D. ambrosioides 壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs） 24 2.51 -11.67 64 0.04 19 -0.79 62 1.31 72 21.55 -12.39 98 0.03 89 -3.68 22 2.07 26 12 0.92 1.90 4.49 69 0.12 41 -11.01 92 4.04 32 168 0.81 1.76 4.42 61 10.12 61 -9.75 21 3.77 61 24 0.74 1.55 7.67 05 0.06 96 -10.50 25 4.00 52 31 20.74 1.55 7.67 05 0.06 96 -10.50 25 4.00 52 38 40.69 1.24 9.81 90 0.05 19 -14.21 98 5.00 97 43 20.58 1.08 21.73 81 0.01 86 -12.68 27 4.70 08 48 0.47 0.89 17.76 93 0.02 44 -12.36 48 4.72 36 52 80.47 0.89 17.76 93 0.02 44 -12.36 48 4.72 36
D. ambrosioides 纳米乳液（DAEO-NE） 24 -- 4.54 71 0.12 27 2.25 97 0.49 29 72 5.47 -3.50 41 0.15 80 0.37 55 0.97 61 12 0.65 11 20 2.68 -6.66 22 0.08 17 2.11 70 0.65 11 16 81.21 -31.67 10 0.01 11 -1.54 97 1.60 49 24 0.10 70.02 05 1.23 64 31 20.91 -11.79 07 0.04 14 -0.70 14 1.43 95 38 40.82 1.86 3.41 60 0.16 17 -9.01 13 3.58 06 43 20.82 1.86 3.41 60 0.16 17 -9.01 13 3.58 06 48 0.81 1.76 4.42 61 0.12 61 -9.75 21 3.77 61 52 80.81 1.76 4.42 61 0.12 61 -9.75 21 3.77 61
D. ambrosioides 精油（DAEO） 24 -- 2.63 40.20 30 0.71 77 0.80 93 72 -- 4.80 10.11 61 -0.24 96 1.14 11 12 0.18 61 -13.06 90.03 64 -3.08 28 1.89 58 16 81.70 -7.82 80.06 80 -0.66 17 1.33 85 24 0.17 -7.82 80.06 80 -0.66 17 1.33 85 31 21.42 -13.84 80.03 38 -0.76 78 1.38 96 38 41.28 7.33 80.05 92 -1.92 73 1.68 69 43 21.28 7.33 80.05 92 -1.92 73 1.68 69 48 01.19 7.56 7.53 90.07 10 -1.48 97 1.59 27 52 81.19 7.56 7.53 90.07 10 -1.48 97 1.59 27
LC₅₀ = 致死50%暴露昆虫的浓度；LC₉₀ = 致死90%暴露昆虫的浓度；χ² = 卡方。b 由于拟合优度χ²显著（p < 0.15），因此使用了异质性因子。(-) 由于LC50和LC90、截距和斜率无法通过统计分析确定，因此没有数据。
对于DAEO-CSNPs，LC₅₀从24小时时的2.51%急剧下降到480至528小时后的0.47%，相应的LC₉₀从1.90%下降到0.89%，表明随着暴露时间的延长，毒性很高且持续。陡峭的斜率（后期间隔大于4.0）表明幼虫对剂量的反应一致，且剂量-死亡率关系有效。
相比之下，DAEO-NE和DAEO表现出较高的LC₅₀值（分别为0.81%至1.84%和1.19%至1.84%），显示出较慢的毒性进展和较低的效力。CA-EO相对较平的斜率（< 3.0）表明幼虫对处理的反应具有更大的变异性。
3.3. 温室试验
图10中展示的温室生物测定结果证明了D. ambrosioides精油不同配方对H. armigera幼虫的杀虫效果，持续时间为8天。统计分析显示，在几天的观察期间（df = 5；p < 0.0001，从第3天到实验结束，表S4）处理之间存在显著差异。
下载：下载高分辨率图片（225KB）
下载：下载全尺寸图片
图10. 在温室中，使用D. ambrosioides配方[壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）、纳米乳液（DAEO-NE）和精油（DAEO）处理后8天（24–192小时）的幼虫死亡率（%）热图，同时展示了阳性对照（Emamectin benzoate）和阴性对照（Tween 80和壳聚糖）的效果。
在测试的油类处理中，2%的D. ambrosioides壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）显示出最高且快速的幼虫死亡率，在第4天达到80%。同一配方的1.5%浓度也显示出显著的效果，死亡率从第1天的40%上升到第7天的77.77%。D. ambrosioides纳米乳液（DAEO-NE）在2%和1.5%浓度下在第6天达到了77.77%的最大死亡率。两种浓度的精油处理（DAEO）效果较差，在第8天时最高死亡率为66.66%。总体而言，应用8天后，所有D. ambrosioides配方的效果相似，死亡率约为90%，在统计上与化学阳性对照相当（p < 0.05）。值得注意的是，作为阳性对照的Emamectin benzoate在250克/公顷的剂量下最为有效，在24小时时达到70%的死亡率，在应用后5天达到100%的死亡率（表S5）。
4. 讨论
对于新型、环保的害虫控制策略的需求正在增长，尤其是在管理和控制农业及医学害虫方面。来自药用植物的精油（EOs）因其对人类健康和环境的安全性而被广泛认为是合成杀虫剂的有希望的替代品。与许多传统杀虫剂不同，EOs通常不会对非目标生物或消费者构成严重的毒理学风险（Sarmah等人，2025年）。然而，EOs在实际害虫管理中的使用受到其固有的挥发性、快速氧化和在田间条件下残留时间短的限制。当暴露在阳光、空气和其他环境因素下时，EOs往往会迅速蒸发或降解，从而在短时间内失去效力（Modafferi等人，2025年）。这些缺点需要频繁重新施用，迄今为止阻碍了许多基于EO的生物杀虫剂的商业化。为了克服这些挑战，最近的研究集中在先进的配方上，如纳米乳液和基于聚合物的纳米颗粒，这些配方可以提高EOs的稳定性、生物利用度和控制释放（Giuliano等人，2025年）。通过在纳米尺度上封装EOs，可以减少其挥发性，保护敏感成分免受光/氧的影响，并延长其杀虫活性。本研究通过将Dysphania ambrosioides精油（DAEO）制成壳聚糖纳米颗粒（DAEO-CSNPs）和纳米乳液（DAEO-NE），并评估它们对多食性害虫Helicoverpa armigera的接触毒性、拒食试验和温室试验的效果来解决这些问题。
本工作报告了将D. ambrosioides精油制成壳聚糖纳米颗粒和油包水纳米乳液用于管理H. armigera的方法。这里研究的DAEO富含单萜类化合物。GC–MS分析鉴定出19种成分，占油的99.66%，其中（Z）-ascaridole（约48%）和p-cymene（34%）是主要成分，还有少量的thymol、carvacrol和其他萜类化合物。这一成分谱与之前关于D. ambrosioides精油的报告一致。例如，Cavalli等人（2004年）发现该油的主要成分是阿斯卡里多尔（41.8%）、异阿斯卡里多尔（18.1%）和对伞花烃（16.2%）。Zhu等人（2012年）在中国 Dysphania ambrosioides 的精油中鉴定出22种化合物，其中主要成分是（Z）-阿斯卡里多尔（29.7%）、异阿斯卡里多尔（13.0%）、对伞花烃（12.7%）和胡椒酮（5.0%）。这种油及其主要成分对德国小蠊（Blattella germanica）表现出很高的熏蒸毒性，原油的LC₅₀值为4.13 mg/L，而（Z）-阿斯卡里多尔、异阿斯卡里多尔和对伞花烃的LC₅₀值分别为0.55 mg/L、2.07 mg/L和6.92 mg/L。在接触试验中，（Z）-阿斯卡里多尔的毒性最强（LD₅₀ = 22 μg/成虫），远高于原油（约67 μg/成虫），这表明它在杀虫活性中起主要作用。其他研究也表明D. ambrosioides精油对多种害虫有效。例如，Wei等人（2015年）报告称，Dysphania ambrosioides精油对Plutella xylostella表现出强烈的毒性和拒食作用，对第二龄幼虫的效果更明显。该精油的整体效果明显优于其单独的主要成分（如α-萜品烯和对伞花烃），在LC₅₀方面大约强十倍，这突显了精油内部的协同效应。此外，它还显示出与储存产品保护相关的熏蒸杀虫活性。Chu等人（2011年）报告称，该精油对玉米象（Sitophilus zeamais）具有强烈的熏蒸效果，LC₅₀值为3.08 mg/L，而其主要成分（Z）-阿斯卡里多尔的LC₅₀值更低，为0.84 mg/L。该精油对S. zeamais的接触毒性也很高（LD₅₀ = 2.12 μg/昆虫体重），这主要归因于阿斯卡里多尔（LD₅₀ = 0.86 μg/昆虫体重）。这些发现证实D. ambrosioides精油是一种广谱生物杀虫剂，可通过接触和熏蒸两种方式发挥作用。一种商业配方（QRD 400）已被证明能有效控制软体害虫，如真菌蚊幼虫，并对粉蚧和蓟马具有中等效果（Cloyd和Chiasson 2007年）。然而，与合成杀虫剂相比，其效果较低（在某些情况下死亡率为3-34%），这归因于高挥发性和短暂的残留活性，这是未配方精油的常见局限性。
在当前的研究中，我们改进了两种纳米制剂方法：壳聚糖纳米颗粒的包封和水中的纳米级油体系。这两种纳米制剂通过尺寸分布、表面电荷和包封效率进行了全面表征。动态光散射（DLS）证实壳聚糖纳米颗粒系统的平均水动力直径在几百纳米范围内，而NE滴液略小（平均266纳米），但由于其液态性质，多分散性指数较高。CSNPs的ζ电位呈中等正值，反映了壳聚糖的阳离子性质，这对于通过静电排斥作用稳定系统非常重要（López-León等人2005年），而NE则表现出较小的负ζ电位，可能来自阴离子乳化剂和微量的TPP。D. ambrosioides NE和D. ambrosioides CSNPs的包封效率及负载量分别约为96-97%，D. ambrosioides CSNPs和D. ambrosioides NE的包封效率及负载量分别为50-53%，表明大部分油成功结合到了纳米载体中，与其他壳聚糖或聚合物纳米胶囊中的精油值相当（Rajkumar等人2020年）。FTIR分析证实了CAEO在纳米制剂中的成功包封。特征性的壳聚糖峰（O–H/N–H伸缩约3400 cm⁻¹，酰胺I约1650 cm⁻¹，酰胺II约1580 cm⁻¹）在负载了EO的纳米颗粒中发生了位移或强度减弱，而独特的EO峰（如O–H、C=O伸缩）仍然可见，表明油在结合过程中没有发生化学降解。新出现的低于1000 cm⁻¹的峰（来自TPP交联）和自由壳聚糖酰胺信号的减少表明DAEO通过物理方式被捕获。类似的光谱变化也已在其他负载EO的壳聚糖系统中报道（Hosseini等人2013年）。SEM成像显示CSNPs和NE滴液都是球形的且均匀。空白CSNPs形成了光滑的纳米球聚集体，而负载了EO的CSNPs看起来更密集，证实了油的成功捕获。光滑、无孔的表面起到了保护屏障的作用，防止了EO的蒸发和降解，从而提高了稳定性。这些发现与先前的报告一致，即球形、紧凑的壳聚糖纳米载体通过控制释放和减少挥发延长了EO的活性（Ahmadi等人2018年，Choudhary等人2024年）。纳米包封的一个主要优点是能够修改DAEO的释放曲线。在我们的研究中，CSNPs和NE都显示出双相释放模式：最初7小时内释放了约40-50%的油，随后在数十小时内缓慢、持续释放。早期的快速释放可能是因为油分子松散地吸附在纳米颗粒表面，而缓慢的释放阶段反映了从核心逐渐扩散的过程。与纳米乳液（NE）相比，DAEO-CSNPs释放油的速度更慢且更可控，这对于长期害虫控制是一个理想的特点。其他精油也观察到了类似的趋势。例如，牛至精油在3小时内表现出明显的快速释放效应，释放了约82%的封装OEO（Hosseini等人2013年）。对于含有α-生育酚的玉米醇酸酯包覆壳聚糖纳米颗粒，也有类似的发现，最初释放了85%的有效载荷，随后是缓慢的、恒定的释放阶段（Luo等人2011年）。与纳米乳液相比，DAEO-CSNPs显示出更慢且更可控的释放曲线。在一项关于百里香精油的体外研究中，大约91.68%的油在48小时内从纳米乳液释放到水中，而其壳聚糖封装形式在同一时期内的累积释放量仅为73.41%（Gupta等人2023年）。纳米制剂显著提高了叶片的润湿性，将鹰嘴豆叶片的接触角从约92°（水）降低到约45–57°。这种增强的扩散主要是由于非离子表面活性剂（Tween 80）和油在滴液界面的存在。DAEO-NE实现了最低的接触角（约46°），表明其对叶片表面的附着力极佳，而DAEO-CSNPs也表现出很强的润湿性。表面张力测量支持了这些结果：DSNP分散体的表面张力最低（约38–40 mN/m），甚至低于单独使用Tween 80时的表面张力，表明与壳聚糖有协同效应。较低的表面张力和接触角确保了更好的喷雾覆盖、附着力和在植物叶片上的持久性，这对于有效的害虫控制至关重要（Chopra等人2025年）。
本研究的生物测定结果表明，纳米制剂显著提高了D. ambrosioides精油的杀虫效果。无论是纳米乳液还是壳聚糖纳米颗粒制剂，在多种暴露方式下都对H. armigera表现出更高的效力。在接触毒性试验中，CSNPs和NEs导致的幼虫死亡率高于相同剂量的自由DAEO，表明壳聚糖纳米颗粒和纳米乳液有助于活性化合物更好地穿透昆虫角质层（Shahzad和Manzoor 2021年）。这种油不仅在接触或摄入时杀死昆虫，还能抑制进食——接受处理饮食的幼虫摄入量显著减少，生长速度也比未处理饮食的幼虫慢。在我们的温室试验中，模拟了半野外条件下的宿主植物（鹰嘴豆），纳米制剂的优越性显而易见。在最高应用率（2%的油浓度）下，DAEO-CSNPs在6天内导致H. armigera幼虫死亡率为90%，而DAEO-NE在6-8天内达到约80%的死亡率，自由精油（DAEO）在8天内仅达到70%的死亡率。Ibrahim等人（2022年）在评估香茅精油纳米制剂对Spodoptera littoralis（鳞翅目：夜蛾科）的杀虫效果的研究中也得到了类似的结果。作者观察到，测试的纳米制剂干扰了昆虫的正常发育。这种处理显著延长了幼虫和蛹的发育期，导致蛹的重量、成虫寿命和雌性繁殖力显著降低。此外，同一研究的半野外试验证实，壳聚糖-纤维素纳米封装系统表现出最高的持久性，在所有观察间隔内都实现了最高的幼虫死亡率。
我们的发现强化了纳米封装可以延长EO在田间“活性寿命”的概念。最初，直接喷洒后，自由油由于其高挥发性可能会迅速杀死害虫（提供短暂的高剂量），而纳米封装的油可能作用稍慢。实际上，在一些实验中，纯DAEO在暴露的最初几个小时内显示出稍快的杀虫效果，而CSNPs需要额外的几个小时来释放足够的阿斯卡里多尔以达到相同的死亡率。然而，从长远来看，自由油的影响迅速下降（因为其在环境中的浓度迅速降低），但纳米制剂继续释放活性成分并在连续几天内杀死昆虫。这些发现与Werdin González等人（2014年）的报告一致，他们发现天竺葵和佛手柑精油在24小时内导致100%的死亡率，而它们的纳米制剂最初甚至120小时后仍未显示出死亡率。作者将这种延迟效果归因于纳米颗粒对活性成分的逐渐释放。尽管纳米制剂的初始毒性低于自由精油，但它们保持了长期的杀虫活性，最终在后期实现了更高的死亡率，克服了未封装精油的快速生物活性损失。从实际角度来看，纳米封装的D. ambrosioides EO是一种有前景的生物杀虫剂，可用于控制H. armigera和其他害虫。壳聚糖纳米颗粒（CSNPs）提供了可控的释放和持久的活性，克服了自由EO的挥发性问题。壳聚糖是一种可生物降解、生物相容的聚合物，被批准用于农业，可以提供成膜和增强植物的作用，非常适合田间应用。纳米乳液（NE）虽然释放速度更快，但制备更简单，适用于需要快速作用的情况。这两种制剂都稳定、可水分散，在储存过程中不会发生相分离。由于由天然、安全的成分组成，它们符合可持续农业的目标。除了直接毒性外，DAEO还表现出驱避、杀卵和干扰生长等效果，有助于抑制未来的害虫世代。重要的是，植物性杀虫剂通常对有益昆虫更安全。尽管这里没有评估非目标效应，但DAEO的长期使用历史表明风险较低，尽管仍需进行田间验证和与天敌的兼容性测试。
5. 结论
我们的发现表明，纳米封装和纳米乳液技术可以显著提高D. ambrosioides精油的杀虫效果和持久性。特别是壳聚糖纳米颗粒制剂（DAEO-CSNPs）提供了一个可控释放的杀虫系统，克服了油的挥发性和快速降解问题，在实验室和温室条件下对Helicoverpa armigera幼虫提供了持久的保护。CSNPs和NEs提高了DAEO的接触和摄入毒性，实现了比未封装油更高的死亡率和拒食效果。基于D. ambrosioides的纳米杀虫剂的开发为综合害虫管理提供了一种环保且有效的工具，有可能减少我们对合成化学物质的依赖。未来的工作应集中在扩大这些制剂的产量和进行田间试验，以评估其在实际农业条件下的表现。同时，还需要研究它们对非目标生物（传粉者、天敌、土壤动物）的影响，以确保环境安全。鉴于这项研究的积极结果，D. ambrosioides EO纳米制剂值得进一步探索，作为下一代可持续害虫管理解决方案的一部分。通过适当的优化（例如大规模生产、制剂保质期和应用方法），它们可能成为可行的商业杀虫剂，为种植者提供安全、天然且有效的手段来对抗害虫如H. armigera。
**资助声明**
本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。
**作者贡献声明**
Badreddine Drissi：可视化
Mustapha El Bouhssini：验证、监督
Imane Abbad：可视化
Meryem El Fadil：写作——原始草稿、方法学
Mansour Sobeh：写作——审阅与编辑、验证、监督、资金获取、概念化
Noamane Taarji：写作——审阅与编辑、方法学、概念化
Karim El Fakhouri：写作——审阅与编辑、方法学、概念化
Rachid Boulamtat：可视化、调查
Chaimae Ramdani：写作——原始草稿
Cheima Moufid：可视化
Mohamed Ouaarous：软件
**关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明**
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT-5 Edu来提高语言清晰度并检查语法。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。
打赏
