**摘要**
乳凝酶（MCEs）是奶酪制造中的重要生物催化剂。然而，由于小牛凝乳酶的供应有限以及相关的伦理问题，人们开始积极寻找微生物替代品。本研究报道了从巴基斯坦Dera Ismail Khan分离出的土壤菌株Bacillus stercoris NCCP-3139中纯化并表征了一种乳凝蛋白酶的过程。该菌株通过标准的形态学和生化检测以及16S rRNA基因测序被鉴定为B. stercoris（与B. stercoris JCM 30051的相似度为98.75%）。该酶通过硫酸铵沉淀、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱和Sephacryl S-200凝胶过滤色谱进行纯化。其在山羊、绵羊、牛和水牛的牛奶中表现出显著的乳凝活性（p < 0.05），这与产生类似凝乳酶的蛋白酶的特性一致。其中，绵羊和水牛牛奶的凝乳效果优于其他物种（p < 0.05）。纯化后，该酶的比活性从1.6 U/mg提高到了5.0 U/mg，乳凝活性与蛋白水解活性（PA）的比值从50提高到了550，显示出显著的催化选择性。该酶在55°C和pH 9.0条件下表现出最佳活性，并且能被Mn2+和Sr2+激活，但会被EDTA、Hg2+和Zn2+强烈抑制。SDS-PAGE分析显示该酶为单体形式。因此，分离出的B. stercoris NCCP-3139产生的蛋白酶具有显著的特异性和选择性，表明其可作为奶酪生产中动物凝乳酶的微生物替代品。
**1 引言**
蛋白酶是广泛应用于乳制品、食品和制药工业中的重要生物催化剂。在奶酪生产中，MCEs通过水解牛奶中的κ-酪蛋白来启动凝固和凝块形成过程（Bilal和Iqbal 2020）。传统上，使用动物来源的凝乳酶来凝固牛奶；然而，随着全球奶酪需求的增加以及对动物屠宰的伦理担忧，人们开始研究微生物和植物来源的替代品。特别是来自Bacillus属的微生物蛋白酶因其高产量、稳定性和易于基因操作而被视为有前景的替代品（Zhang, Tao等人2025；Zhang, Yang等人2025）。B. stercoris是一种栖息在土壤中的细菌，其特征是能够分泌耐热和碱性的蛋白酶，这些蛋白酶在食品生物加工中具有潜在应用价值。蛋白酶因其广泛的pH和温度范围内的显著催化性能而在工业上得到应用（Banerjee和Ray 2017）。具有高乳凝活性与蛋白水解活性比（MCA/PA）的微生物MCEs对于减少非特异性蛋白水解至关重要，因为非特异性蛋白水解可能对奶酪的质地和产量产生不利影响。因此，筛选、纯化和表征新的Bacillus来源的酶对于识别高效且经济可行的生物催化剂和乳制品非常重要（Ali等人2025）。鉴于对奶酪需求的增加以及动物来源凝乳酶的局限性，微生物乳凝酶作为可扩展且潜在可持续的替代品受到了关注（Priyashantha 2025）。其中，Bacillus来源的酶特别值得关注，因为它们可以通过发酵生产，并可能为乳制品加工提供良好的稳定性和催化性能（Raman等人2025；Kumar等人2025）。本研究的主要目的是从Bacillus stercoris NCCP-3139中分离、纯化并表征一种乳凝蛋白酶，重点研究其乳凝活性与蛋白水解活性比（MCA/PA）、最佳物理化学条件及其商业潜力。这项研究强调了其作为环保且经济可行的动物凝乳酶替代品的潜力。
**2 材料与方法**
**2.1 研究地点**
本研究在巴基斯坦Dera Ismail Khan的Gomal大学微生物学研究所和食品科学与营养研究所进行。
**2.2 细菌菌株的分离**
从Gomal大学微生物学研究所附近无菌采集了土壤样本（31.8188°N, 70.8971°E）。共采集了10个土壤样本，每个样本的深度为5-10厘米，然后用无菌聚乙烯袋在4°C下运输。将1克土壤依次稀释在无菌0.9%盐水中，并将稀释液涂布在R2A琼脂培养基上（0.6克蛋白胨、0.6克酵母提取物、0.6克葡萄糖、0.6克酪氨酸、0.3克丙酮酸钠、0.3克K2HPO4·7H2O、0.005克MgSO4·7H2O、15克琼脂，pH 7.0）。培养板在37°C下培养48小时。通过划线法纯化出不同的菌落，并在4°C下的营养琼脂上维持。为了长期保存，将菌株置于-70°C下的20%甘油中（Nair等人2021）。
**2.3 形态学和生化表征**
**2.3.1 菌落形态**
记录了营养琼脂培养板上的菌落大小、形状、边缘、隆起、表面纹理和色素沉着情况（Taredahalli 2013）。
**2.3.2 显微镜检查和染色**
按照标准程序进行了革兰氏染色、内孢子染色（孔雀石绿/沙黄）和半固体琼脂中的运动性测试（Ryu等人2024）。
**2.3.3 生化测试**
生化测试包括甲基红（MR）、Voges–Proskauer（VP）试验、尿素酶、过氧化氢酶、柠檬酸利用、酪蛋白水解和吲哚试验（Al-Joda和Jasim 2021）。
**2.4 分子表征**
**2.4.1 DNA提取**
使用SDS-苯酚-氯仿-异戊醇方法提取基因组DNA。DNA溶解在TE缓冲液中并储存在-20°C（Rath和Das 2023）。
**2.4.2 16S rRNA基因的PCR扩增**
使用通用引物27F和1492R对16S rRNA基因进行PCR扩增。扩增产物（约1116 bp）在含有溴化乙锭的1.8%琼脂糖凝胶上可视化（Satilmis等人2019）。
**2.4.3 测序和系统发育分析**
PCR产物在NCCP（伊斯兰堡）进行测序，序列号PV363620。使用BLAST将序列与NCBI GenBank和EzBioCloud数据库进行比对。使用CLUSTAL_X进行多序列比对，并在MEGA 7.0中生成邻接树，重复次数为1000次（Chouaia和Dittmer 2024）。
**2.5 牛奶采样和成分分析**
从Bhakkar和Layyah地区的当地农场无菌采集了新鲜牛奶（牛n=15、水牛n=15、绵羊n=15、山羊n=20、骆驼n=10）样本。为了减少与泌乳早期和晚期牛奶成分及凝固行为相关的生理变化，样本来自处于泌乳中期（或接近中期）的临床健康动物。采集后立即将各物种的牛奶样本混合并在4°C下保存，以便进行成分分析。使用Ultrasound Milk Analyzer（Milkotronic Ltd. Lactoscan SA50）测定牛奶的近似成分（蛋白质、脂肪、乳糖、非脂固体、总固体和灰分）。脂肪、蛋白质、乳糖、总固体和非脂固体的含量按照Stocco等人（2025）描述的Kjeldahl方法测定。
**2.6 酶的生产和提取**
在含有100毫升无菌脱脂牛奶培养基的250毫升Erlenmeyer烧瓶中进行酶的生产（牛奶来源为牛、水牛、绵羊或骆驼）。首先去除原始牛奶中的脂肪成分以制备脱脂牛奶。简要地说，牛奶样本在4°C下以5000×g离心15分钟，然后无菌去除奶油层，所得脱脂部分用作发酵培养基中的酪蛋白底物。脱脂牛奶作为主要的酪蛋白底物，同时加入玉米浸出液和盐（K2HPO4、(NH4)2HPO4和MgCl2）以支持微生物生长、维持营养平衡并促进蛋白酶的产生。初始接种密度约为10^6 CFU/mL，通过600 nm处的光密度（OD）测量或平板计数（每毫升的菌落形成单位）确定。培养物在37°C下持续振荡150 rpm培养24-120小时。发酵过程中没有主动控制培养基的pH值，但会定期监测。根据所使用的牛奶种类，pH值在7.0到8.0之间波动（Wang等人2025）。
**2.7 蛋白酶活性测定**
使用酪蛋白作为底物测定PA。反应用5%三氯乙酸终止，然后离心并在650 nm处测量吸光度。一个PA单位定义为每分钟释放1微克酪氨酸的酶量。蛋白质浓度通过Lowry测定法估算（Zhang, Tao等人2025；Zhang, Yang等人2025）。
**2.8 乳凝活性（MCA）**
培养物在37°C下以150 rpm振荡24、48、72、96和120小时以促进酶的产生。在每个时间点，无菌收集培养物上清液并用作乳凝活性的粗酶制剂。然后在37°C下使用含有0.1 M CaCl2的复原脱脂牛奶分别测定乳凝活性，并监测凝固过程长达40分钟。一个MCA单位定义为在37°C下40分钟内使10毫升牛奶凝固所需的酶量（Jasim等人2025）。MCA的计算方法如下：
**2.9 MCA/PA比率**
乳凝活性（MCA）与蛋白水解活性（PA）的比率是评估酶选择性的重要参数。MCA/PA比率通过将MCA除以PA来计算。
**2.10 酶的纯化**
粗酶溶液在4°C下用30%-70%饱和度的硫酸铵分两步沉淀（30%-50%和50%-70%），然后以10,000 rpm离心10分钟，并重新悬浮在含有50 mM NaCl的磷酸盐缓冲液中（pH 7.5）。接着通过DEAE-纤维素离子交换色谱进行进一步纯化，使用20 mM Tris–HCl（pH 7.5）和50 mM NaCl（缓冲液A），并通过线性NaCl梯度洗脱。随后使用相同的缓冲液进行Sephacryl S-200凝胶过滤色谱。DEAE-纤维素的流速为1 mL/min，收集5 mL体积的组分；Sephacryl S-200的流速为0.5 mL/min，收集2 mL体积的组分。在280 nm处监测蛋白质含量，并收集具有最高比活性的组分（Bytyçi等人2025）。
**2.11 物理化学参数的影响**
研究了pH（5–11）、温度（30°C–80°C）和金属离子/抑制剂（Mn2+、Sr2+、Ca2+、Zn2+、Hg2+、K+、SDS、EDTA）对酶活性的影响（Im等人2025）。
**2.12 SDS–PAGE和酶谱分析**
通过SDS–PAGE分析酶的纯度和分子量。使用酪蛋白酶谱确认蛋白水解活性（Acharjee等人2025）。
**2.13 统计分析**
所有实验重复三次，结果以平均值±标准差（SD）表示。数据使用GraphPad Prism 9.0中的单因素ANOVA进行分析，随后进行Tukey检验。统计显著性标准为p < 0.05。每次比较的实验单元是独立的生物重复，每个发酵或酶制剂在单独的烧瓶中进行，并作为单独的样本处理。在进行ANOVA之前评估了正态性和同方差性。使用Shapiro–Wilk检验评估正态性，使用Levene检验评估同方差性。
**3 结果**
**3.1 形态学表征**
分离出的Bacillus stercoris NCCP-3139表现出典型的Bacillus特征，包括形成不规则、不透明的菌落，边缘粗糙，以及革兰氏阳性、产内孢子的杆状形态（图S1）。如表1所示，生化测试结果为甲基红、尿素酶、过氧化氢酶和淀粉水解均为阳性，这与Bacillus的特性一致。显微镜下观察到的革兰氏阳性细胞呈杆状（图S1）。内孢子染色表明粉红色的营养细胞中含有绿色内孢子，说明该菌株能形成孢子。此外，半固体琼脂中的扩散生长表明该菌株具有运动性（图S1）。根据数据结果，可以确定该分离菌株属于Bacillus属。表1显示了B. stercoris NCCP-3139的生化特征。
**3.2 生化表征**
进一步通过生化分析确认了B. stercoris NCCP-3139的身份。该菌株产生了阳性的甲基红（MR）反应，表明能够从葡萄糖发酵中稳定产生酸；而Voges–Proskauer（VP）试验为阴性，表明没有形成乙醛。该菌株表现出强烈的尿素酶和过氧化氢酶活性，分别通过深粉色和剧烈气泡形成得到证实。柠檬酸利用试验呈阳性，表明存在柠檬酸酶；淀粉水解在菌落周围产生了透明圈，表明存在淀粉酶活性。相反，吲哚试验为阴性，加入Kovac试剂后没有出现红色（表1）。这些结果与先前的研究一致。例如，从芽孢杆菌属物种中成功分离出耐热蛋白酶，这支持了这种方法用于获得适用于工业应用的高活性酶的可行性（Ibrahim和Ma 2017）。此外，多位研究者已经表明，使用土壤样本分离芽孢杆菌菌株是一种常见且有效的策略，可以获取具有理想特性的蛋白酶，以用于乳制品行业（Khatoon等人2023；Patil和Jadhav 2017）。
3.3 酪蛋白水解和牛奶凝固活性
B. stercoris NCCP-3139被发现具有“强”酪蛋白水解能力，并在脱脂牛奶琼脂上产生了较大的清晰区（图S1）。这种“强”水解能力是根据之前描述的凝固速度来确定的（Chen等人2021）。这证实了该菌株能够分泌能够降解酪蛋白的胞外蛋白酶（Baggiolini等人2009）。牛奶凝固试验显示其活性很高（p < 0.05），与非蛋白酶菌株相比，表明该酶能够切割κ-酪蛋白，这是乳胶体不稳定和牛奶凝固的关键步骤（Ben Amira等人2017）。这些结果表明，B. stercoris NCCP-3139表达了一种具有强大工业奶酪生产潜力的类似凝乳酶的蛋白质。牛奶凝固活性（MCA）与蛋白酶活性（PA）的比率对于确定微生物凝固剂的效率和适用性至关重要（Moschopoulou 2017）。
3.4 分子鉴定
通过分子测试进一步确认了该菌株的身份，这些测试包括扩增16S rRNA基因，在琼脂糖凝胶电泳中产生了一条大约1116 bp的单一条带（图S2）。基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树使用了分子进化遗传学分析（MEGA）软件，并采用了邻接连接法结合自助法进行分析。通过序列分析确定了该菌株的分类学身份（表2），显示其与B. stercoris JCM 30051的相似度为98.75%。NCCP-3139与B. stercoris JCM 30051的聚类关系密切，自助值为71%（图3）。这种系统发育关系支持了对该菌株的分类学鉴定，并证实了其与B. stercoris的密切进化亲缘关系。这种方法有助于确定该菌株的分类学位置，并评估其与芽孢杆菌属内其他菌株的遗传多样性（Sacchi等人2002）。
3.5 牛奶成分的比较评估
比较了山羊、绵羊、奶牛、水牛和骆驼的牛奶成分，发现关键成分（如脂肪、SNF、TS、蛋白质、乳糖和灰分）存在显著差异（p < 0.05）（图1）。山羊奶的脂肪和蛋白质含量平均较高，而SNF和TS含量相对较低，这意味着其营养密度较低。绵羊奶的脂肪、蛋白质和总固体含量最高（p < 0.05），使其更适合乳制品加工。奶牛奶的脂肪和蛋白质含量处于中等水平，但乳糖含量较高（p < 0.05），这证实了其消化性和工业适用性。水牛奶的脂肪、SNF和TS含量显著较高（p < 0.05），表明其适合生产高脂肪乳制品，如黄油和酥油。相比之下，骆驼奶的脂肪和蛋白质含量较低（p < 0.05），但乳糖含量较高，这增强了其消化性和治疗效益，特别是在干旱地区。这些成分差异突显了不同物种牛奶的特定营养和功能特性（p < 0.05）。
3.6 蛋白酶活性
不同类型牛奶和发酵时间下的蛋白酶活性存在显著差异（p < 0.05）（图2）。绵羊奶和水牛奶的酶活性最高，在48小时时分别为27 U/mL和22 U/mL，随后逐渐下降至72 U/mL。山羊奶和奶牛奶的蛋白酶活性适中，而骆驼奶的酶活性最低（1–3.5 U/mL）。随时间下降的趋势（p < 0.05）表明酶可能失活或底物耗尽。这些发现表明，蛋白酶的活性受牛奶成分、酶的稳定性以及物种特异性蛋白质含量的影响（图2）。
3.7 牛奶凝固活性（MCA）
五种牛奶类型和不同发酵时间下的MCA存在显著差异（图3）。48小时时，绵羊奶的MCA含量最高（约950 SU），其次是水牛奶（约300 SU）和奶牛奶（约160 SU）。山羊奶的MCA含量处于中间水平（48小时时约为160 SU），而骆驼奶的凝固潜力最低（120小时时约为60 SU）。所有物种在48小时后的活性下降（p < 0.05），可能表明酪蛋白过度水解或酶失稳。绵羊奶和水牛奶中较高的酪蛋白和钙含量使其在奶酪生产方面具有优势。MCA在不同牛奶类型和发酵时间点之间存在显著差异。所报告的数值对应于不同发酵时间（24–120小时）后收获的酶制剂，而凝固试验本身是在标准化条件下单独进行的。所示数值代表24–120小时细菌培养后收获的酶制剂的MCA，而不是凝固试验本身的持续时间（图3）。
3.8 酶的纯化和表征
该酶依次通过硫酸铵沉淀（30%–70%）、透析、DEAE-纤维素离子交换和Sephacryl S-200凝胶过滤进行纯化（图S2和S3）。蛋白酶活性（PA）降低了22至10 U/mL（p < 0.05），蛋白质浓度显著降低（p < 0.05）至13至2 mg/mL，表明非特异性蛋白质被去除（Ullah等人2022；Naveed等人2023）。特定活性显著增加（p < 0.05），达到1.6至5.0 U/mg，证明酶得到了纯化，因为没有出现条带扩大的现象（Suryani等人2023）。纯化产率从100%下降至25%（p < 0.05），这是多步纯化的典型特征。纯化倍数增加了0.5倍，MCA增加了800至1700 SU（p < 0.05）。MCA与PA的比率在50至550之间显著增加，表明酪蛋白的凝固和水解作用存在显著差异（图4）。如图4所示，酶纯化过程逐渐降低了总蛋白质含量，同时提高了特定活性和MCA/PA比率。这些结果表明，Sephacryl S-200纯化的酶是最活跃且最适用于工业用途的（图4）。
3.9 纯化酶的表征
3.9.1 温度对PA的影响
蛋白酶和牛奶凝固活性的最佳温度为55°C，最佳pH值为9.0（图5a）。为了确认这些最佳条件的统计显著性，我们使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验比较了相邻温度和pH值（例如50°C和60°C，pH 8.5和9.5）下的酶活性。结果表明，55°C和pH 9.0下的酶活性显著高于其他条件（p < 0.05）。图中将提供置信区间（或SD条）以说明这些发现的变异性和统计显著性。在80°C时，PA进一步下降，证实了超过最佳温度后的显著热失活。然而，在冷冻过程中，55°C以上的活性急剧下降，60°C时活性降至4.7 U/mL，65°C时降至4.2 U/mL，70°C时降至3.3 U/mL，75°C时降至1.89 U/mL。最佳温度以上活性下降可以归因于酶结构的变性和构象改变。因此，55°C是PA最大化的最高温度。在80°C时，仅观察到残余的PA，表明酶在最佳温度以上发生了显著的热失活（图5）。
3.9.2 温度对MCA的影响
如图5b所示，纯化酶的MCA在55°C时逐渐增加（p < 0.05），达到1475.6 SU。在此温度以上，MCA显著下降（p < 0.05），60°C时降至1011.29 SU，65°C时降至865.41 SU，70°C时降至756.4 SU。温度效应表明55°C是最佳的牛奶凝固温度，因为高温可能导致酶的催化位点变性。同样，在80°C时，MCA进一步下降，表明在较高温度下催化效率大幅降低。结果表明，该酶可以在适中的温度条件下使用，这适用于乳制品加工行业。
3.9.3 pH对PA的影响
图5c显示了pH对PA的影响。随着pH值的增加，酶活性逐渐增加（p < 0.05），从pH 6.5时的2.4 U/mL增加到pH 9.0时的最大值5.4 U/mL。之后，活性急剧下降，pH 9.5时降至1.95 U/mL，pH 10时降至0.89 U/mL。在pH 11时，PA进一步下降，表明在强碱性条件下酶功能严重丧失。这些发现表明，该酶在微碱性环境中（pH 9）表现最佳，这是碱性蛋白质的特性。在较高pH下活性丧失可能是由于结构重要氨基酸残基的结构不稳定或离子化所致。在pH 11时，仅检测到残余的PA，表明在强碱性条件下酶功能严重丧失。
3.9.4 pH对MCA的影响
图5d显示了pH对MCA的影响。MCA在pH 9.0时达到最大值1593.16 SU，表明这是酶的最佳催化效率。超过这个最佳值后，MCA迅速下降，pH 9.5时降至967.78 SU，pH 10时降至623.32 SU。同样，在pH 11时，MCA进一步下降，证实催化性能在最佳pH值以上受到严重影响。由于该酶在较高pH下仍能保持稳定，因此在需要酶在高pH下保持稳定的工业奶酪制造过程中非常有益。
3.10 金属离子和酶抑制剂的影响
进行这项实验是因为许多蛋白酶，包括由芽孢杆菌属产生的蛋白酶，都是金属蛋白，其活性通常依赖于特定金属离子（Mn2+、Ca2+和Sr2+）的存在（Saeed等人2023；Selvaraj等人2024）。测试这些金属离子的目的是为了识别能提高酶活性的必需辅因子。通过测试不同浓度（1 mM至20 mM）的金属盐来评估金属离子对酶活性的影响。图6显示了在不同金属离子（MnCl2、MnSO4、CaCl2、ZnSO4和HgSO4）存在下酶的残余活性。结果表明，Mn2+离子（MnCl2和MnSO4）显著增强了酶活性，在10 mM MnCl2时活性是对照组的2.2倍，在20 mM MnSO4时是4倍。相比之下，Hg2+和Zn2+的存在导致酶活性降低，10 mM HgSO4和ZnSO4下的残余活性分别为...（数据未完整提供）。
3.11 SDS-PAGE分析
进行了SDS-PAGE分析以评估酶的纯度和分子均一性（图S3）。观察到了与预期碱性蛋白酶分子量相符的明显条带，证实了纯化成功，并表明该酶由单一蛋白质物种组成（Hashmi等人2022）。单一条带的存在表明该酶已被纯化至接近纯度的状态，没有受到其他蛋白质的显著污染（Tarek等人，2023年）。该条带的分子量与之前报道的由芽孢杆菌属（Bacillus）产生的碱性蛋白酶的分子量一致（Ullah等人，2022年），进一步支持了该酶制剂的身份和纯度。
4 讨论
本研究充分证明了B. stercoris NCCP-3139是一种强效的碱性蛋白酶来源，具有有效的酪蛋白水解能力（MCA），因此展示了其在工业乳制品应用中的潜力。通过形态学、生化和分子分析验证/确认了该分离株的分类学身份，而其酶活性则揭示了其独特的蛋白水解能力和类似凝乳酶的特性。形态学和革兰氏染色结果显示了典型的芽孢杆菌特征：不规则且不透明的菌落以及革兰氏阳性且能形成内孢子的杆菌，这些特征也在Acharjee等人（2025年）和Peng等人（2025年）对芽孢杆菌属的研究中有所报道，其中B. subtilis和B. licheniformis的菌落特征相似，包括它们的形态外观和运动能力（Acharjee等人，2025年；Peng等人，2025年）。通过生化分析也确认了这一分类，因为该分离株对MR、尿素酶、过氧化氢酶和淀粉水解试验呈阳性反应，这与Uddin等人（2014年）描述的芽孢杆菌属的代谢特征相符。所有这些特征共同证明了B. stercoris是一种能够产生胞外酶的强效蛋白水解细菌。高水平的酪蛋白水解能力和显著的凝乳效果表明该酶合成了类似凝乳酶的胞外蛋白酶。Zhang、Tao等人（2025年）和Zhang、Yang等人（2025年）也发现了类似的结果，并声称B. cereus和B. subtilis菌株具有双重的蛋白水解/凝乳能力，可用于奶酪制造。纯化过程获得了较高的MCA与PA比值（550），这进一步表明该酶能够选择性地切割κ-酪蛋白，这对于微生物凝乳酶类似物破坏微管结构至关重要（Jasim等人，2025年）。对牛奶成分的比较分析显示了物种间的显著差异（p<0.05），这对酶的活性有影响。绵羊奶和水牛奶具有更好的蛋白水解和凝乳活性，因为它们的蛋白质和酪蛋白含量更高，这与Cecchinato等人（2012年）的研究结果一致，他们指出总固体含量和钙含量的增加会提高酶介导的凝固效率（Cecchinato等人，2012年）。相比之下，骆驼奶的活性较低，这与较低的酪蛋白胶束密度和较高的2-酪蛋白比例相符（Ellouze等人，2021年）。硫酸铵沉淀、离子交换和凝胶过滤纯化显著提高了酶的比活性（1.6至5.0 U/mg）（Johnvesly和Naik，2001年，针对Bacillus flexus蛋白酶的纯化研究）。比活性的提高和产量的降低表明成功富集了具有催化活性的酶组分。SDS-PAGE分析显示了一条与碱性蛋白酶大小相匹配的蛋白质条带（2535 kDa），这与Winarti等人（2018年）报道的芽孢杆菌分泌的蛋白酶的分子量相符。研究结果显著表明，这种碱性蛋白酶在55°C和pH 9.0条件下具有热稳定性以及最佳的蛋白水解和凝乳活性。Pulikkottil Rajan（2024年）和Ullah等人（2022a）也观察到了类似的结果，他们发现芽孢杆菌属的碱性蛋白在中等温度和碱性条件下最为稳定，并在乳制品和洗涤剂配方等工业应用中具有实用性（Pulikkottil Rajan，2024年；Ullah等人，2022年）。在温度高于55°C和pH值高于9.0时活性迅速丧失，表明活性位点残基发生了热变性或离子化，这是丝氨酸蛋白酶的特征。金属离子的测定显示Mn2+、Ca2+和Sr2+可以增强酶活性，而EDTA和Hg2+则显著降低了酶活性，表明该酶具有金属蛋白特性。这一结果与Vazquez-Armenta等人（2022年）和Krstić等人（2005年）的研究一致，他们发现Mn2+在稳定酶的催化构象中起着关键作用（Vazquez-Armenta等人，2022年；Krstić等人，2005年）。Mn2+的激活作用和EDTA的抑制作用以及其他金属离子的影响表明该酶可能依赖于金属。对于细菌蛋白酶（包括芽孢杆菌来源的酶）也观察到了类似的反应模式，其中Mn2+增强了酶活性，而EDTA显著降低了酶活性（Lee等人，2016年）。然而，这些观察结果仍然是间接的，在将该酶明确分类为金属蛋白酶之前，还需要进一步的机制证据。特别是，通过重新添加特定金属离子来恢复EDTA处理后的活性，以及直接的金属结合测定，将为Mn2+或其他辅因子在催化中的作用提供更有力的证据（Yu和Lee，1999年；Yao等人，2023年）。这些方法将有助于明确金属离子对酶激活的具体贡献，并更深入地理解其催化机制。本研究通过鉴定B. stercoris NCCP-3139作为具有相对良好凝乳选择性的蛋白酶来源，为微生物凝乳酶的研究增添了新的内容。在微生物凝乳剂中，较高的MCA/PA比值通常被认为是理想的，因为它反映了更强的凝乳性能和较低的非特异性蛋白水解作用，这对于奶酪制造非常重要（Narwal等人，2017年；Zhang等人，2019年）。与之前关于B. subtilis、B. licheniformis、B. megaterium和B. velezensis的凝乳酶的研究相比，本研究为B. stercoris提供了物种特异性的证据，并提供了基于纯化和表征的数据，支持其作为微生物凝乳酶候选物的进一步评估（Narwal等人，2017年；Yao等人，2023年）。此外，评估芽孢杆菌来源的凝乳酶在奶酪系统中的研究表明，尽管性能强烈依赖于酶的特异性、酪蛋白水解模式和奶酪类型（Wehaidy等人，2023年；Mamo等人，2020年），但这些酶仍具有实际应用前景。然而，在确定其工业适用性之前，还需要通过动力学分析、直接的κ-酪蛋白切割研究和奶酪制作试验进行额外的验证。
5 结论
本研究鉴定并表征了一种新的菌株B. stercoris NCCP-3139，它产生了一种热稳定、碱性和依赖金属的蛋白酶，具有显著的凝乳能力。形态学、生化和分子研究表明，它在分类学上与B. stercoris JCM 30051相同（相似度为98.75%）。该酶具有强效的酪蛋白水解能力和类似凝乳酶的特性，能够有效切割κ-酪蛋白，这是奶酪生产过程中微胶束不稳定化的关键步骤。通过硫酸铵沉淀、离子交换和凝胶过滤的顺序纯化过程提高了酶的比活性（5.0 U/mg）和MCA/PA比值（550），证明了酶的富集和选择性。其热稳定性和对碱性的偏好通过其在55°C和pH 9.0条件下的最佳活性得到证实。添加Mn2+可以增强催化活性，而Hg2+、Zn2+、EDTA和SDS则会抑制酶活性，从而证明了其金属蛋白特性。SDS-PAGE分析显示了一条蛋白质条带，表明纯化产物的存在。未来应进行基因克隆、固定化以及扩大规模生物加工的研究，以最大化酶的稳定性、产量及其在乳制品和生物制药行业的工业应用。作者贡献
Muhammad Sibtain：方法学、可视化、数据分析、软件使用、撰写——审阅和编辑、初稿撰写。Ghulam Murtaza：研究设计、概念化、资金获取、可视化、撰写——审阅和编辑。Sadaf Javaria：概念化、研究设计、可视化、验证、监督、软件使用。Noor-ul Ain：研究设计、验证、可视化。Ashraf Ahmed Qurtam：研究设计、资金获取、验证、数据分析、软件使用、数据管理。Sadia Chaman：研究设计、验证、数据分析、数据管理。Ali Zaman：概念化、研究设计、资金获取、初稿撰写、方法学、数据分析、项目管理、监督、资源协调。Mohammed Al-zharani：研究设计、验证、软件使用、数据管理、资源协调、数据分析。Fahd A. Nasr：研究设计、验证、数据分析、监督。致谢
作者没有需要报告的内容。资金支持
本研究得到了伊玛目穆罕默德·伊本·沙特伊斯兰大学（IMSIU）科学研究部的支持和资助（资助编号IMSIU-DDRSP2601）。利益冲突声明
作者声明在本文的撰写过程中没有使用任何生成式人工智能。数据可用性声明
研究中呈现的原始贡献包含在文章/支持信息中；如有进一步疑问，请联系通讯作者。
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