摘要
脉冲电场（PEF）处理技术作为一种有前景的非热处理方法，能够改变生物分子结构并提升食品系统的功能特性。在本研究中，利用PEF制备了交联的藻酸盐-鱼明胶材料，并将其结构特性、抗氧化活性以及营养物质的包封能力与传统的均质化处理方法制备的材料进行了比较。结构分析显示，PEF处理后得到的颗粒尺寸更小（约80纳米），而均质化处理后的颗粒尺寸为250-550纳米；同时PEF处理后的材料具有更紧凑的微观结构，表面积更低（4678.3平方米/克对比8230.2平方米/克），孔隙率也更低（0.0973立方厘米/克对比0.2366立方厘米/克）。这些结构上的差异显著提升了材料的性能。与均质化处理样品相比，PEF处理样品中的矿物质包封能力从21%提高到了33%，维生素的包封能力从15%提高到了24%。此外，通过FRAP和ABTS测试测得的抗氧化活性也显著增强。研究结果表明，PEF能够有效促进蛋白质与多糖之间的相互作用，从而改善藻酸盐-鱼明胶复合物的结构和功能特性。本研究为开发具有增强营养输送和抗氧化功能的蛋白质-多糖材料提供了一种新的非热处理策略。
1 引言
脉冲电场（PEF）是一种短时非热处理技术，在商业应用中得到了广泛普及。由于对食品性质的影响较小，该技术在食品加工领域的应用相对较少（Vashisht等人，2024年）。与标准的热处理方法相比，这种非热处理技术具有生物相容性高、能耗低以及易于定制等优点（Jafari等人，2024年）。近年来，这项新技术在商业和实验层面都得到了深入探索。PEF设备的应用范围从测试阶段逐渐扩展到实际应用阶段，尤其是在工业领域。最初，PEF被用作预处理步骤来制备生物活性成分，能够提高生物活性化合物的产量并优化细胞通透性（Brückner和Griehl，2023年）。Baltacıoğlu等人（2024年）研究了PEF预处理对黄肉和紫肉土豆的影响，发现PEF处理显著降低了土豆的油含量（黄肉土豆降低了至少20%，紫肉土豆降低了24%），同时增强了酚类化合物的含量。近年来，PEF处理对多种蛋白质的影响也得到了研究，包括小麦面粉蛋白（Achayuthakan等人，2023年）、大豆蛋白（Belobrajdic等人，2024年）和豆类蛋白（Bravo-Núñez和Gómez，2021年）。例如，Wang等人（2023年）发现，在10千伏/厘米的电压下进行PEF处理并调整pH值后，商业大豆蛋白分离物的溶解度从26.06%提高到了70.34%。PEF处理过程中产生的离子电荷残余或静电排斥作用可能导致蛋白质的二级和三级结构变化。已知蛋白质的物理化学性质与其结构密切相关。然而，关于PEF处理对蛋白质-多糖相互作用材料物理化学性质的影响的研究较少。鱼明胶因其良好的生物相容性和成膜能力而被广泛用于功能性食品中的营养物质包封。例如，Liu等人（2021年）开发了鱼明胶/海藻酸盐双网络凝胶来包封益生菌，提高了其在模拟胃液中的热稳定性和存活率。Hadidi等人（2021年）将嗜酸乳杆菌包封在藻酸盐-鱼明胶珠中，增强了益生菌在加热和储存过程中的存活能力。通过多糖交联，可以进一步提高鱼明胶系统的营养物质包封能力。Peng等人（2024年）报道，使用genipin交联的明胶-多糖复合物显著提高了鱼油的氧化稳定性和包封能力，包封效率达到了44.3%，包封效率为90.9%。Oliver-Cadena等人（2024年）开发了用转谷氨酰胺酶交联并层压有支链淀粉的鱼明胶薄膜，提高了食品包装的机械性能和耐水性。尽管取得了这些进展，但大多数研究仍依赖于化学交联剂或传统的机械处理方法，这些方法可能需要额外的试剂、复杂的处理条件或对微观结构形成的控制有限。相比之下，PEF处理可以通过静电相互作用、离子迁移和分子重排来诱导生物分子的结构变化，从而实现蛋白质-多糖的自组装，无需使用化学交联剂。先前的研究还探索了涡流流体装置（VFD）处理来促进生物分子之间的相互作用并制备功能性生物聚合物材料。例如，VFD处理通过高剪切应力和微流控混合促进了酶促水解和结构化生物聚合物系统的形成（Joseph，2021年）。这些研究表明，VFD可以显著影响食品和生物材料系统中的分子相互作用和材料形态。然而，VFD主要依赖于机械剪切力和薄膜微流控技术来诱导分子相互作用（Cao等人，2021年）。相比之下，PEF处理通过高压电脉冲诱导电穿孔、偶极子排列和生物分子之间的静电相互作用，可能导致蛋白质-多糖系统的不同结构结果。尽管PEF处理具有诸多优势，但此前尚未有研究报道其用于制备交联的藻酸盐-鱼明胶系统以实现营养物质包封。因此，本研究旨在探讨使用PEF制备交联藻酸盐-鱼明胶材料的可行性，并评估其结构特性、抗氧化活性和营养物质包封能力与传统均质化处理方法的差异。
2 材料与方法
2.1 材料
Berocca营养补充剂（富含维生素）和Kid's多矿物质补充剂（富含矿物质）由Chemist Warehouse（澳大利亚）提供。鱼明胶（食品级）购自Woolworth超市（澳大利亚）。藻酸盐来自Sappire Bioscience（新南威尔士州，澳大利亚）。Milli-Q水是通过蛋白质与多糖的反应制备的。
2.2 交联藻酸盐-鱼明胶材料的制备
将鱼明胶和藻酸盐与水溶液混合，鱼明胶与藻酸盐的比例为2:0.75（重量比），最终浓度为0.18克/毫升。制备过程的第一步是在室温下搅拌10毫升2%（重量/体积）的鱼明胶溶液和6毫升0.125%（重量/体积）的藻酸盐溶液15分钟。本研究使用了由PulseMaster Pty. Ltd.（荷兰Hapert）设计的PEF系统。实验系统包括控制面板、高压脉冲电源、用于测量输出的示波器以及用于处理材料的平行板腔室。两个电极之间的距离为2.5厘米，以确保脉冲放电均匀。将约100毫升的预混合溶液放入处理腔室中，以58%的占空比在14千伏/厘米的电压下处理6分钟。PEF信号的输入频率为900赫兹，采用单极模式，能够生成脉冲方波形。为了与VFD方法进行比较，还采用了定制的均质化技术，将样品在T25数字ULTRA-TURRAX均质机中以13,500转/分钟的转速均质化600秒。从PEF和均质化处理得到的样品分别进行冷冻和干燥处理后使用。
2.3 动态光散射（DLS）技术
在25°C下使用DLS（Nano ZS90，Malvern仪器，英国Worcester）对PEF和均质化处理得到的样品进行粒度分布分析。这些样品随后用He-Ne 633纳米波长的激光在173°的检测角度下进行处理。Malvern zeta sizer仪器能够根据光的时间依赖性波动来确定不同粒度的散射情况。
2.4 扫描电子显微镜（SEM）
我们使用Inspect FEI F50 SEM（PS216）仪器在光学图像下观察了最后一步得到的液态和冻干形式的样品。点尺寸和输入电压分别为2.0千伏和5.0千伏。为了观察冻干后的微观结构，样品首先被冻干，然后迅速浸入液氮中约2分钟以促进断裂。断裂后的样品被切割成大约5×5×2毫米（长度×宽度×厚度）的块状，然后用手术刀片固定在一个SEM样品台上，并喷涂一层薄铂膜（约2纳米）以改善导电性和图像分辨率。
2.5 Brunauer, Emmett, and Teller（BET）分析
使用BET分析技术（TriStar II，Micrometric Ltd.，Lincoln LN6 3RX，英国）计算冻干和干燥样品的总表面积和孔隙率。将冻干和干燥的样品通过液氮制成粉末。然后将40毫克的样品放入BET管中，接着对BET管进行12小时的抽真空处理。最后，将BET管放入分析仪中，吸附气体为氮气，浴温为77开尔文，平衡时间为20秒。
2.6 傅里叶变换红外光谱（FTIR）
在25°C的室温下使用配备钻石晶体的光谱仪对冻干和干燥样品进行FTIR光谱分析。光谱范围、扫描次数和分辨率分别设置为400-4000厘米^-1、40次和4厘米^-1。然后将约10毫克的样品放置在钻石晶体上进行测量。该仪器的背景光谱和样品光谱具有相同的范围、扫描次数和分辨率。
2.7 粘度测量
使用配备热容器和程序温度控制器的Brookfield粘度计（LV-DVIII，HT-60；HT-110FR，Brookfield Engineering Laboratories Inc.，美国Middleboro）分析交联藻酸盐-明胶材料的粘度。热容器与样品室和旋转轴（HT-2和SC4-18，Brookfield Engineering Laboratories Inc.，美国Middleboro）集成在一起。测量单元通过冷却插件组件（HT-26Y，Brookfield Engineering Laboratories Inc.，美国Middleboro）进行冷却，该插件连接到加压空气喷嘴。控制加热曲线的温度范围设定在20°C至40°C之间，升温速率为2°C/分钟。样品重量设置为2克，剪切速率为20.00 rad/s，间隙设置为20.00毫米。
2.8 交联藻酸盐-鱼明胶材料的营养物质包封能力
在包封研究之前，将Kid和Berocca的多矿物质和维生素营养补充剂分别粉碎成粉末。样品通过将明胶、单宁酸和每种营养补充剂与水按固定比例混合制备。明胶与单宁酸与每种营养补充剂的比例分别为2:0.375:1.25（重量/重量/重量）。实验步骤包括预先混合10毫升2%（重量/体积）的明胶溶液和3毫升0.125%（重量/体积）的单宁酸溶液，然后加入1.25克的粉末状营养补充剂。样品通过喷射进料方式倒入内径20毫米、外径17毫米的硼硅酸盐玻璃管中。硼硅酸盐玻璃管以7000转/分钟的速度和0.3毫升/分钟的流速旋转。管子在室温下操作，倾斜角度为45度。这些实验条件是通过优化处理参数得到的，以开发VFD辅助的非共价交联藻酸盐-鱼明胶材料。这里的实验条件与PEF处理条件相同，其中均质化过程（T25数字ULTRA-TURRAX均质机）的条件也与前述的均质化处理的交联单宁酸-明胶材料相同（13,500转/分钟，25°C下处理10分钟）。从PEF和均质化处理得到的液体样品分别进行收集，然后冷冻和干燥。
2.9 交联藻酸盐-鱼明胶材料中包封的营养物质定量
使用配备能量分散X射线光谱（SEM-EDS）的扫描电子显微镜（Inspect FEI F50，Bruker Cooperation，美国Billerica）对交联藻酸盐-鱼明胶材料中包封的营养物质进行定量。选择SEM-EDS是因为它能够同时观察样品的微观结构和元素分布，从而检测和半定量分析与包封营养物质相关的元素。该技术被广泛用于评估食品和生物材料基质中元素的空间分布和相对丰度。在本研究中，EDS检测到的元素信号（如矿物质补充剂中的P、Si、Mg和Zn）被用作藻酸盐-鱼明胶基质中包封营养物质的指标。结果以原子百分比（%）表示，表示分析区域内每种检测元素的相对比例。通过比较通过PEF处理和均质化处理得到的样品之间的元素百分比，可以评估不同材料的相对营养捕获能力。
2.10 抗氧化活性测量
样品的抗氧化活性使用铁还原抗氧化能力（FRAP）测定法和ABTS自由基清除测定法进行评估。选择这两种方法是因为它们代表了评估抗氧化能力的互补机制：FRAP通过测量抗氧化剂将铁离子（Fe3+）转化为亚铁离子（Fe2+）的能力来评估其还原能力，而ABTS测定法则测量抗氧化剂清除自由基的能力。结合使用这两种测定法可以更全面地评估食品生物聚合物系统的抗氧化特性。FRAP测定法按照Amamcharla和Metzger（2014）的方法进行，略有修改。FRAP试剂由10 mM TPTZ溶解在40 mM盐酸中、20 mM氯化铁以及醋酸缓冲液（0.3 M，pH 3.6）组成。处理过的材料与试剂以1:1:10（v/v）的比例混合。每个测试样品由1 mL样品溶液和5 mL FRAP试剂组成。混合物在37°C下孵育20分钟，然后使用分光光度计在593 nm处测量吸光度。抗氧化能力是根据硫酸亚铁溶液（100–1400 μM）生成的标准曲线计算得出的，结果以FRAP值（μM Fe2+）表示。ABTS自由基清除活性按照Dechakhamphu等人（2023）的方法进行测定，也略有修改。简而言之，ABTS自由基溶液是通过将7 mM的ABTS水溶液与2.45 mM过硫酸钾（K2S2O8）混合并在黑暗中于25°C下孵育16小时制备的。所得溶液用乙醇稀释至在734 nm处的吸光度为0.70（±0.02），然后在30°C下平衡。随后，将0.3 mL的每个样品与1.2 mL的ABTS溶液混合，孵育6分钟，并在734 nm处测量吸光度。ABTS自由基清除活性根据以下公式计算：
其中A是空白样品的吸光度，B是测试样品的吸光度。
2.11 数据分析
为了检测目的，采用了三次重复实验的方法，确定了平均值及其标准差，并使用v15 MINITAB统计软件进行了最小显著差异（LSD）和单因素方差分析（ANOVA）。F值在概率（p < 0.05）下用于计算统计显著性。
3 结果与讨论
3.1 交联藻酸盐-鱼明胶的合成和物理性质
多糖与蛋白质之间的相互作用已被广泛研究，以增强食品材料的功能特性。例如，蛋白质-多糖复合系统已被应用于可生物降解的食品包装膜和用于环境修复的水凝胶基质（Roy等人，2024；Wang等人，2022）。先前也有研究报道了鱼明胶与藻酸盐之间的交联，显示出改善的凝胶稳定性和机械性能（Basu等人，2022）。然而，大多数制造方法依赖于传统的机械混合或化学交联，控制这些材料微观结构的替代加工策略仍然有限。在本研究中，PEF处理过的样品显示出明显更粘稠和类似凝胶的结构，与均质化处理过的材料相比。当容器倒置时，PEF处理过的材料仍然附着在容器底部，表明形成了稳定的凝胶网络，而均质化处理的样品由于其较低的粘度而向下流动（图1a）。这些观察结果表明，PEF处理促进了藻酸盐和鱼明胶之间的更强相互作用。这种流变行为的差异可能归因于PEF处理过程中电场诱导的增强交联和分子相互作用。高强度电场可以改变蛋白质构象，促进反应性功能基团的暴露，并增强蛋白质和多糖之间的静电相互作用（Taha等人，2022；Wang等人，2023）。在其他生物聚合物系统中也报告了由于交联密度增加而导致的粘度和凝胶稳定性的类似改善（Muguda等人，2021；Vinner和Malik，2018）。这些机制可能有助于形成PEF处理过的藻酸盐-鱼明胶材料中观察到的更稳定的凝胶结构。
3.1 交联藻酸盐-鱼明胶系统的物理性质
通过PEF处理和均质化处理获得的交联藻酸盐-鱼明胶系统的物理性质。(a) 粘度数据和处理后样品的代表性外观；照片是在制备后12小时拍摄的。(b) 动态光散射（DLS）分析。上述PEF处理和均质化处理的交联藻酸盐-鱼明胶化合物在25°C下保持12小时后的粘度差异。新鲜制备的溶液在粘度上表现出显著变化（图1a）。从20°C到30°C的温度范围有助于获得通过PEF处理得到的交联藻酸盐-鱼明胶化合物的粘度，远高于通过均质化处理得到的粘度。交联藻酸盐-鱼明胶材料的粘度是使用Brookfield粘度计在受控温度条件下测量的，如第2.7节所述。如图1a所示，粘度值是在加热曲线（20°C–40°C）期间以20 rad s−1的剪切率记录的稳态测量值。例如，在25°C时，PEF处理过的样品的粘度约为1.1 Pa s，而均质化处理过的样品的粘度显著较低，约为0.2 Pa s，表明PEF处理过的材料形成了更强的凝胶网络。研究表明，增加的交联有助于提高交联生物聚合物的粘度和粘性（Muguda等人，2021）。通过使用高浓度的藻酸盐在改性淀粉中制备的高内相乳液，可以实现更高的交联程度，从而显著增加粘度和剪切模量，随着藻酸盐浓度从0%增加到2%（w/w）（Vinner和Malik，2018）。藻酸盐含量的增加还导致方法后形成了高内相乳液。液体从滴落变为附着在容器末端的固体凝胶的变化与本研究中的情况相似（图1a）。使用藻酸盐制备混合超分子纳米纤维时也展示了类似的结果（Kupferberg等人，2024）。从图2a可以看出，与均质化处理相比，PEF处理显著增强了藻酸盐对鱼明胶的交联能力。
3.2 扫描电子显微镜（SEM）
使用SEM分析了交联藻酸盐-鱼明胶的结构尺寸，如图2所示。在不同处理平台上生产后立即捕获的SEM图像显示了不同的结构：均质化处理产生了聚集的棒状结构（图2a），而PEF处理产生了封闭的、针状结构（图2b）。PEF处理由于其独特的作用机制而形成了封闭的、针状结构。PEF涉及对材料施加短时间的高电压电场，这可以在分子和微观水平上引起多糖（如淀粉）的显著物理和结构变化（Maniglia等人，2021）。PEF中的高强度电场会导致电穿孔，使生物聚合物形成临时孔隙。这可以导致分子的重新分布，促进藻酸盐和明胶等生物聚合物结构重新组织成特定模式。此外，PEF可以通过促进离子迁移和相互作用来影响交联，特别是在依赖离子交联的系统中，如藻酸盐（Abourehab等人，2022）。这些机制可能有助于形成更稳定的凝胶结构。图1a显示，粘度值是在加热曲线（20°C–40°C）期间以20 rad s−1的剪切率记录的稳态测量值。例如，在25°C时，PEF处理过的样品的粘度约为1.1 Pa s，而均质化处理过的样品的粘度显著较低，约为0.2 Pa s，表明PEF处理过的材料形成了更强的凝胶网络。研究表明，增加的交联有助于提高交联生物聚合物的粘度和粘性（Muguda等人，2021）。通过使用高浓度的藻酸盐在改性淀粉中制备的高内相乳液，可以实现更高的交联程度，随着藻酸盐浓度从0%增加到2%（w/w），粘度和剪切模量都有显著增加（Vinner和Malik，2018）。藻酸盐含量的增加还导致方法后形成了高内相乳液。液体从滴落到附着在容器末端的固体凝胶的变化与本研究中的情况类似（图1a）。使用藻酸盐制备混合超分子纳米纤维时也展示了类似的结果（Kupferberg等人，2024）。从图2a可以看出，与均质化处理相比，PEF处理增强了藻酸盐对鱼明胶的交联能力。
图2 显示了通过PEF处理和均质化处理的交联藻酸盐-鱼明胶结构的SEM图像。所有样品都是通过滴涂在硅片上制备的，然后干燥（过夜或冷冻干燥），并在SEM分析前用铂溅射涂层。(a) 均质化处理，烘干。(b) PEF处理，烘干。(c) 均质化处理，冷冻干燥。(d) PEF处理，冷冻干燥。通过DLS（图1b）分析了通过PEF和均质化过程制备的交联藻酸盐-鱼明胶的颗粒尺寸，发现PEF处理的颗粒尺寸约为80 nm，而均质化处理的颗粒尺寸约为250–550 nm。这突显了PEF实现显著更小颗粒尺寸的能力。
3.2 扫描电子显微镜（SEM）
使用SEM分析了交联藻酸盐-鱼明胶的结构尺寸，如图2所示。在不同处理平台上生产后立即捕获的SEM图像显示了不同的结构：均质化处理产生了聚集的棒状结构（图2a），而PEF处理产生了封闭的、针状结构（图2b）。PEF处理由于其独特的作用机制而形成了封闭的、针状结构。PEF涉及对材料施加短时间的高电压电场，这可以在分子和微观水平上引起多糖（如淀粉）的显著物理和结构变化（Maniglia等人，2021）。PEF中的高强度电场会导致电穿孔，生物聚合物会形成临时孔隙。这可以导致分子的重新分布，促进藻酸盐和明胶等生物聚合物结构重新组织成特定模式。此外，PEF可以通过促进离子迁移和相互作用来影响交联，特别是在依赖离子交联的系统中，如藻酸盐（例如，钙离子）。这也促进了紧凑、封闭结构的形成（Abourehab等人，2022）。我们注意到，PEF技术已被证明可以显著影响蛋白质-糖类的相互作用，从而增强食品系统的功能特性。先前的研究表明，PEF处理可以诱导蛋白质和蛋白质-多糖系统中的几种特定结构变化。高强度电场可以通过破坏弱非共价相互作用（如氢键和静电相互作用）部分展开蛋白质分子，从而暴露出隐藏的疏水残基和反应性功能基团（Taha等人，2022）。这些结构重排可以改变蛋白质的二级结构，通常减少α-螺旋含量，同时增加β-折叠或无规卷曲结构（Wu等人，2016）。这些功能基团的暴露增强了分子间的相互作用，包括疏水相互作用、静电吸引和蛋白质与多糖之间的潜在共价交联。在基于藻酸盐的系统中，PEF还被报道可以促进离子迁移，并促进带负电的藻酸盐链和带正电的蛋白质域之间的更强离子交联，从而形成更紧凑和稳定的生物聚合物网络。这些综合结构效应有助于形成PEF处理过的藻酸盐-鱼明胶材料中观察到的更稳定的凝胶结构。
3.2 扫描电子显微镜（SEM）
使用SEM分析了交联藻酸盐-鱼明胶的结构尺寸，如图2所示。在图2中，不同处理平台上生产后立即捕获的SEM图像显示了不同的结构：均质化处理产生了聚集的棒状结构（图2a），而PEF处理产生了封闭的、针状结构（图2b）。PEF处理由于其独特的作用机制而形成了封闭的、针状结构。PEF涉及对材料施加短时间的高电压电场，这可以在分子和微观水平上引起多糖（如淀粉）的显著物理和结构变化（Maniglia等人，2021）。PEF中的高强度电场会导致电穿孔，生物聚合物会形成临时孔隙。这可以导致分子的重新分布，促进藻酸盐和明胶等生物聚合物结构重新组织成特定模式。此外，PEF可以通过促进离子迁移和相互作用来影响交联，特别是在依赖离子交联的系统中，如藻酸盐（例如，钙离子）。这也促进了紧凑、封闭结构的形成（Abourehab等人，2022）。我们注意到，PEF技术已被证明可以显著影响蛋白质-糖类的相互作用，从而增强食品系统的功能特性。先前的研究表明，PEF处理可以诱导蛋白质和蛋白质-多糖系统中的几种特定结构变化。高强度电场可以通过破坏弱非共价相互作用（如氢键和静电相互作用）部分展开蛋白质分子，从而暴露出隐藏的疏水残基和反应性功能基团（Taha等人，2022）。这些结构重排可以改变蛋白质的二级结构，通常减少α-螺旋含量，同时增加β-折叠或无规卷曲结构（Wu等人，2016）。这些功能基团的暴露增强了分子间的相互作用，包括疏水相互作用、静电吸引和蛋白质与多糖之间的潜在共价交联。在基于藻酸盐的系统中，PEF还被报道可以促进离子迁移，并促进带负电的藻酸盐链和带正电的蛋白质域之间的更强离子交联，从而形成更紧凑和稳定的生物聚合物网络。这些综合结构效应有助于形成更小的颗粒和更有组织的微观结构，如本研究中DLS（图1b）和SEM（图2）结果所反映的。通过均质化技术处理的总面积是不规则的，具有较大的孔隙率/表面积，约为31,300 m2（图2c），孔隙用黄色方块标出。相比之下，通过PEF形成的冷冻干燥原型的总面积具有更平滑和规则的表面积，孔隙率/表面积约为2600 m2（图2d），孔隙用红色方块标出。图2a,b）和冷冻干燥过程（图2c,d）之前和之后的原型显示出明显不同的结构。PEF处理由于能够控制分子相互作用和对齐，从而促进了蛋白质-多糖相互作用中更规则的微观结构。PEF产生的强电场影响带电分子（如蛋白质和多糖）的对齐。这些场可以诱导偶极子对齐，帮助分子以更有序的方式排列。蛋白质通常带有表面电荷，而多糖（如藻酸盐）通常是多阴离子的。PEF通过 aligning charges 来增强它们的相互作用，促进一致的结合并减少随机聚集（Zhou和Pang，2018）。此外，电脉冲可以在界面产生微流，促进蛋白质和多糖的混合和相互作用。这种动态相互作用防止了相分离，并促进了均匀的微观结构组装（Xu等人，2023）。通过利用这些机制，PEF可以精确控制分子相互作用，从而在蛋白质-多糖系统中形成规则和定义明确的微观结构。这对于需要一致纹理和功能特性的应用特别有利。从图2b可以看出，与均质化处理产生的具有不同大小和开放结构的棒状样品相比，这些规则的、针状和圆形结构更为明显。图2c,d）中显示的PEF处理后的均匀、针状形态表明了定义明确的形态的重新组装，具有小的孔隙。图2d中显示的细长、清晰且均匀的轮廓与图2b中交联和封装元素的直径一致。尽管如此，均质化技术处理后的原型（图2a）具有不同异常形状的棒状和开放结构，其孔隙较大，没有清晰的边界（图2c）。正如Szerlauth等人（2023）所指出的，PEF处理过程中的处理材料具有各种物理特性，具有严格的、绝对的和均匀的粉碎，组分中间没有任何化学相互作用（键的形成），这与均质化过程不同。这种相互作用通过FT-IR分析藻酸盐-鱼明胶复合材料观察到（图3）。检测到了与酰胺I（~1650 cm−1）和酰胺II（~1540 cm−1）相对应的特征性明胶带，而藻酸盐显示出典型的羧酸基团伸缩带，大约在~1600 cm−1和~1410 cm−1。在复合样品中，这些峰的轻微位移和强度变化表明了藻酸盐的羧基团与明胶的氨基团之间的静电相互作用。此外，宽OH/NH伸缩区域（~3200–3400 cm−1）的变化表明了两种生物聚合物之间的氢键形成。这些光谱变化证实了交联材料中明胶和藻酸盐之间的分子相互作用。
图3 显示了通过PEF处理（上图）和均质化（下图）获得的藻酸盐-鱼明胶相互作用系统的FTIR光谱。通过BET表征量化了冷冻干燥后这些元素的整个面积和孔隙率。均质化处理的原型总面积（8230.2 m2/g）大约是PEF处理的原型（4678.3 m2/g）的两倍。在孔隙率方面也观察到了类似的行为，通过均质化技术处理后的原型样品的孔隙率为0.2366 cm³/g，而通过PEF处理后的样品孔隙率为0.09732 cm³/g。将当前的PEF方法与之前报道的用于生物分子系统的涡流流体装置（VFD）处理方法进行比较也是很有意义的（Joseph 2021）。VFD处理能够产生强烈的剪切应力以及薄膜微流控环境，从而增强混合和分子相互作用。相比之下，PEF处理通过电场驱动的机制（如电穿孔、偶极子定向和带电生物分子之间的静电相互作用）来诱导结构改变。这些不同的机制可能导致不同的微观结构结果。在本研究中，PEF处理产生的结构更加紧凑，孔隙率降低，且营养物质的捕获能力增强，这表明PEF诱导的电物理相互作用可能为构建蛋白质-多糖网络提供了另一种途径。从工艺工程的角度来看，PEF在可扩展性方面也具有优势，因为PEF系统已经广泛应用于工业食品加工中，用于连续处理液体和半液体材料（Taha等人2022）。相比之下，VFD处理通常依赖于实验室规模的旋转管系统，这可能需要更复杂的工程改造才能实现大规模生产。因此，使用PEF可能为食品和生物材料应用中蛋白质-多糖交联材料的大规模制造提供更实用的途径。
3.3 海藻酸-鱼明胶相互作用材料的抗氧化活性
使用FRAP和ABTS测定法评估了通过PEF和均质化处理制备的海藻酸-鱼明胶相互作用材料的抗氧化活性（图4）。结果表明，这两种复合材料的抗氧化活性都高于单独的海藻酸，表明海藻酸和鱼明胶之间的相互作用增强了系统的抗氧化能力。
3.4 交联海藻酸-鱼明胶的营养物质捕获能力
表1展示了不同交联海藻酸-鱼明胶分子在冷冻和干燥过程中捕获的矿物质和维生素的情况。颜色越深表示捕获的营养物质越多。通过PEF处理的样品捕获的矿物质和维生素的补充剂颜色比通过均质化技术处理的样品更深，这表明PEF处理显著提高了海藻酸-鱼明胶分子的营养物质捕获能力。使用能量分散X射线光谱技术的SEM技术对营养物质捕获进行了表征。定量结果（表2和表3）与表1中展示的原型结果高度一致。通过PEF处理的样品中捕获的矿物质样品的颜色变化最为显著，这体现在表1中原子百分比总和的显著差异上（均质化样品为21%，PEF样品为33%），其中P（从13%增加到7%）、Si（从9%增加到6%）、Mg（从4%增加到3%）和Zn（从8%增加到5%）分别增加了6%、3%、1%和3%。许多研究已经强调了提高凝胶系统中矿物质捕获能力的方法，这些方法涉及高度关键的浸渍过程（Mao等人2020）。图4和表1中展示的PEF方法证明了另一种提高矿物质捕获能力的技术。与矿物质相比，通过PEF处理的维生素样品的颜色变化非常小，如表3所示。原子百分比的总变化仅为9%，其中维生素H和B1（从11%增加到8%）、维生素B6（从6%增加到4%）和维生素B13（从7%增加到3%）分别增加了3%和4%。由于维生素B6（与P结合）、维生素H和B1（与S结合）以及维生素B13（与Co结合）的形态学变化，因此利用钴（Co）、硫（S）和磷（P）的百分比来展示维生素B13、维生素H和B1、维生素B6的百分比成为了一种流行的方法，这是通过SEM结合能量分散X射线光谱技术实现的（Redan等人2024）。
4 结论
开发了使用PEF技术的交联海藻酸-鱼明胶，以捕获营养物质，并将其与标准化的均质化技术进行了比较。通过SEM观察到，使用PEF处理的样品中形成了闭合环状的交联结构，而通过均质化处理的样品中形成了开放的棒状交联结构。SEM图像还显示，使用PEF处理产生的样品的孔隙总面积和孔隙率都显著低于通过均质化技术处理的样品。通过PEF处理的交联海藻酸-鱼明胶材料的抗氧化活性和捕获矿物质及维生素的能力都显著增强。总体而言，结果表明PEF技术在增强海藻酸-鱼明胶相互作用材料的抗氧化活性方面比传统均质化技术更有效，这可能是由于PEF诱导的结构改变和分子相互作用增强所致。
作者贡献
梁佳：软件、可视化。詹巧霞：概念化、方法论、研究、正式分析、撰写——初稿。何珊：监督、资金获取、项目管理、撰写——审阅和编辑。马特·杰勒科：资源、数据管理、验证。
致谢
开放获取出版由查尔斯达尔文大学提供支持，这是通过Wiley - 查尔斯达尔文大学协议与澳大利亚大学图书馆协会的合作成果。资金支持
本工作得到了中国国家重点研发计划（项目编号2024YFD2101204）的资助。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
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