摘要
在物种形成的最早阶段识别分类单元对于理解生殖隔离是如何产生的至关重要。在加拿大新斯科舍省，“白色”三刺鱼与常见的海洋刺鱼共存，但它们在体型、婚色、筑巢行为和亲代抚育方面存在差异，这表明它们可能代表了具有某种程度生殖隔离的独特生态型。我们结合了群体基因组学、形态测量学和稳定同位素分析来测试白色刺鱼是否代表一个独特的谱系，以及它们是否像淡水刺鱼种群一样沿着生态轴发生了分化。通过测序基因分型发现，白色刺鱼的雄性和雌性形成了一个与共存的常见刺鱼不同的基因簇，尽管存在基因流，但整体基因组分化程度非常低（FST ≈ 0.01）。基因差异分布在许多位点上，而不是局限于单一的基因组区域。形态学和同位素分析显示，在大多数经典生态特征（体型、盔甲、鳃耙或营养生态位）上没有差异。相反，白色刺鱼的体型更小、颜色更浅，刺也更短，睾丸体积较小，而卵的数量更多。这些结果表明，白色刺鱼在基因上与常见的大西洋三刺鱼不同，但在生态上没有明显分化，除了体型上的差异，这表明它们的分化是由生殖和性特征驱动的，而不是营养特化。因此，白色刺鱼为研究物种形成早期阶段的性选择、生殖策略和基因流之间的相互作用提供了一个有前景的新系统。
1 引言
理解导致新物种形成的遗传和表型变化仍然是进化生物学的主要目标（Coyne和Orr 2004；Knott等人2012）。尽管最近在基因组学方面的进展为生殖隔离（RI）的某些方面提供了见解，但关于隔离如何在自然系统中演化仍有许多未解之谜（Butlin等人2012；Noor和Feder 2006；Wu和Ting 2004）。这些未解之谜包括：在基因流存在的情况下，新物种是如何产生的？不同的自然选择在物种边界的形成中起什么作用？哪些表型和遗传变化启动了物种形成过程？本研究直接涉及这些问题中的第一个和第三个。选择研究系统来解决这些问题变得复杂，因为物种在“物种形成连续体”上的进展各不相同（Roux等人2016）。普遍认为，较年轻的物种最适合用于研究物种形成（Coyne和Orr 2004；Knott等人2012；Via 2009）。这是因为最近分化的物种避免了研究生殖隔离演化时的一个关键问题：随着分化种群向生殖隔离发展，新的生殖障碍会出现并掩盖了物种形成初期形成的障碍（Butlin等人2012；Coyne和Orr 2004；Roux等人2016；Via 2009）。这些后来形成的障碍可能有助于维持生殖隔离（例如，通过引起合子后隔离），但它们不一定能反映最初导致物种形成的关键障碍（Coyne和Orr 2004；Orr 2005；Price 2008）。例如，两个物种之间晚近演化出的致命内在不相容性可能会掩盖杂交后代生态表现不佳的作用，因为杂交后代从未形成（Butlin等人2012）。后来积累的障碍还会减弱基因流，并导致全基因组分化增加，从而降低基于分化方法检测参与生殖隔离的位点的能力（Egan等人2013；Feder等人2012；Noor和Feder 2006）。因此，通过研究最近分化的分类单元，即年轻/初期的物种，我们可以最大限度地发现启动物种形成的遗传和表型变化。在基因组学时代，共存年轻物种在识别生殖隔离方面的效用变得尤为明显（Feder等人2012；Ravinet等人2017）。这是因为年轻物种通常表现出不完全的生殖隔离，这允许基因流在同物种差异不涉及的基因组部分进行同质化，从而放大了生殖隔离位点的基因组分化特征（Rogers和Bernatchez 2006；Stephan等人2010；Wu 2001）。尽管有这些明显优势，但目前仍只有少数系统用于研究物种形成的非常早期阶段，特别是在基因流存在的情况下。一些这样的系统包括Rhagoletus苹果/山楂蝇、Littorina潮间带蜗牛、Helianthus沙丘向日葵和Timema步行虫，这些系统已经开始提供关于物种形成过程的关键见解（Feder等人2003；Le Moan等人2023；Nosil等人2005；Ostevik等人2016；Rieseberg等人2012）。要全面了解物种形成的早期阶段，需要更多的研究系统，特别是那些拥有成熟基因组资源的系统。三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）物种复合体被认为包含许多年轻物种。在五个冰后期湖泊系统中，刺鱼物种对在基因上已经分化，并表现出强烈但不完全的生殖隔离（Lavin和Mcphail 1993；Gow等人2008；Schluter等人2025）。在整个分化过程中显然发生了基因流（Wang 2018），生殖隔离主要由它们的生态差异介导（例如，对具有不匹配营养特征的杂交后代的选择；Arnegard等人2014，Thompson等人2022，Schluter等人2025）以及基于体型和形状的配对交配（Conte和Schluter 2013；Rundle等人2005；Bay等人2017）。这种沿生态轴的分化模式与基因流下的物种形成可以由强烈的、不同的自然选择引起的观点一致（例如，由不同的营养生态位提供）。然而，许多研究最充分的种群和物种对具有中等到高水平的整体基因组分化（Hohenlohe等人2010；Jones等人2012；Reid等人2021；Roesti等人2012）。因此，我们对刺鱼的分化/物种形成连续体的了解是不完整的，我们在探究物种形成关键初始阶段的遗传和表型变化方面的能力有限。为了改进这一点，需要新的系统，在这些系统中刺鱼物种最近才分化并且仍然交换基因。
1.1 白色刺鱼
来自加拿大新斯科舍省的“白色”三刺鱼可能就是这样一个系统（Blouw和Hagen 1990）。白色刺鱼似乎与常见的海洋刺鱼（以下简称“常见刺鱼”）不同，这两种类型在新斯科舍省的海洋和河口环境中广泛共存（Blouw和Hagen 1990）。白色刺鱼的雄性在岸边（有时在潮间带）筑巢，并使用丝状藻类而不是沙子和砾石作为筑巢材料（Jamieson等人1992a，1992b；Macdonald等人1995）。在繁殖地，白色刺鱼的雄性表现出醒目的珍珠白色繁殖颜色，而不是更常见的橄榄色/蓝色（Blouw和Hagen 1990）。有趣的是，白色刺鱼的雄性还缺乏常见刺鱼雄性典型的亲代抚育行为：它们在受精后不会照顾卵，而是将卵从巢中带走（通常完全离开它们的领地），将卵分散到周围的藻类中，然后返回寻求与雌性的交配（Blouw 1996；Jamieson等人1992b）。白色刺鱼的雄性平均体型比常见刺鱼的雄性短约20%，因此在两种刺鱼都存在的地点，雄性的体型呈现出双峰分布（Blouw和Hagen 1990）。最近的研究探讨了白色刺鱼和常见刺鱼之间的多种表型和遗传差异。雄性婚色的差异似乎是由于白色刺鱼皮肤中黑色素细胞的密度和范围减少所致（Haley等人2019）。在求偶和亲代抚育阶段，白色刺鱼和常见刺鱼的雄性在总基因表达上也存在差异（Barbasch等人2024），这似乎是由大脑特定区域表达的变化所导致的（Dan等人2024）。亲代抚育行为的差异也被映射到特定的QTL上（Behrens，Maciejewski等人2025；Behrens，Tucker等人2025），这意味着存在遗传基础。最后，实验室培育的白色刺鱼和常见刺鱼的F1和F2杂交后代也表现出越界和可能不适应的亲代抚育行为，包括减少的扇动行为、混合的常见和白色刺鱼的亲代抚育策略（例如，筑巢时不扇动，反之亦然），以及增加的卵食行为（Behrens，Maciejewski等人2025；Behrens，Tucker等人2025）。尽管我们对这个系统的理解正在增加，但仍然不清楚白色刺鱼和常见刺鱼代表的是不同的生态型还是初期的物种。在高级实验室杂交中，白色刺鱼和常见刺鱼是完全可交配的（Behrens，Maciejewski等人2025；Behrens，Tucker等人2025；Blouw 1996），这表明几乎没有内在的合子后隔离，尽管从现有证据来看很难确定，而且生态上的合子后隔离尚未得到正式测试。一项同工酶研究没有发现两种类型之间的遗传分化证据（Haglund等人1990）。然而，在有小型白色刺鱼雄性的地点总是能找到一类小型雌性（Blouw和Hagen 1990；Jamieson等人1992a）。配偶选择实验和野外观察表明，这些小型雌性和雄性是配对的（Jamieson等人1992b，1992a）。这与其他三刺鱼中体型在配偶选择中的作用一致（Conte和Schluter 2013），并表明这个系统中可能存在交配前的基因流障碍。这些发现表明，白色刺鱼可能是一个研究近期和正在进行中的物种形成的有希望的系统。然而，评估物种形成的阶段（近期还是早期）以及是否存在持续的基因流，需要使用现代工具详细研究白色刺鱼和常见刺鱼之间的遗传关系。在这里，我们利用遗传、形态和同位素数据来探索白色刺鱼的进化历史。我们采用了两个先验标准来评估白色刺鱼和常见刺鱼是否代表具有不完全生殖隔离的独特谱系：（1）全基因组的遗传分化分布在多个染色体上，而不仅仅是在一个位点；（2）尽管广泛共存，但没有检测到早期代的杂交个体。我们试图回答以下两个主要问题：
首先，白色刺鱼代表一个新兴的物种还是一个复杂的群体内多态性？为了回答这个问题，我们检查了野外捕获的白色刺鱼和常见刺鱼的遗传多态性模式。如果白色刺鱼和常见刺鱼代表在广泛共存中的不同谱系，我们预计在整个基因组中会有分化，而不仅仅是在一个位点，就像在社会和生殖多态性中看到的那样（例如，Küpper等人2016）。其次，白色刺鱼和常见刺鱼是否沿着营养生态轴分化，就像湖沼-底栖物种对一样？为了回答这个问题，我们检查了已知与其他三刺鱼物种对中的饮食和栖息地差异相关的形态特征和稳定同位素。如果白色刺鱼和常见刺鱼像其他刺鱼物种对一样沿着营养轴分化，我们预计它们会在生态形态特征和同位素比率上显示出显著差异。通过回答这些问题，我们希望更好地理解刺鱼的早期物种形成阶段，并为将白色刺鱼发展为一个完整的研究系统奠定基础。
2 方法
2.1 样本收集
2012年和2014年5月初至7月期间，我们在加拿大新斯科舍省的16个地点收集了白色和常见三刺鱼（表S1）。地点包括新斯科舍省大陆附近的11个地点和布雷德奥尔湖（Bras d'Or Lake）内的5个地点，布雷德奥尔湖是布雷顿角岛（Cape Breton Island）上的一个内陆海。我们根据Jamieson等人（1992a）提供的地点列表来确定地点。我们专注于根据Blouw的环境分析，在繁殖季节最有可能共存的地点：有丰富丝状藻类的半咸水区域。这种采样方案最终使我们能够检查新斯科舍省南部海岸可以通过汽车或短途徒步到达的每一个可进入的淡水河口，从雅茅斯（Yarmouth）到安蒂戈尼什（Antigonish）的坎索海峡（Strait of Canso）。在布雷德奥尔湖（仅2014年），我们采样了河口地点（河流或其他淡水水体与海洋混合的地方），这些地点位于以惠科科马格镇（Whycocomagh）为中心的约100公里半径范围内（图1C）。
图1：白色刺鱼的雄性和雌性形成了一个独特的基因型簇。（A）来自GBS读取的约8000个LD修剪SNP的主成分分析。颜色表示K均值聚类分组（K = 3）。（B，C）加拿大新斯科舍省基因型簇的地理分布图。饼图部分表示每个地点属于A中每个基因型簇的个体比例。地点标签：AL = 安蒂戈尼什登陆（Antigonish Landing），BR = 黑河（Black River），CL = 运河湖（Canal Lake），CP = 船长池塘（Captain's Pond），GC = 吉利斯湾（Gillies Cove），LN = 小狭窄（Little Narrows），MH = 米尔福德港河（Milford Haven River），MR = 中河（Middle River），PP = 波珀池塘（Porper Pond），PQ = 波姆奎特（Pomquet），RR = 右河（Rights River），RT = 蒂拉德河（River Tillard），SF = 圣弗朗西斯港（St. Francis Harbor），SH = 舍特港（Sheet Harbour），SK = 斯凯河（Skye River），SR = 鲑鱼河（Salmon River）。在所有研究地点，我们通过在观察到雄性鱼追求雌性鱼的浅水区域设置无饵的“Gee”品牌1/4英寸网眼不锈钢小鱼陷阱来捕捉鱼类。这些陷阱的设置方法遵循Schluter和McPhail（1992年）描述的一般方法。在回收陷阱后，我们均匀地采集了表型为白色的雄性和普通雄性鱼（通过繁殖颜色进行识别），并保留了所有雌性鱼（通过妊娠状态进行识别），直到每个地点分别收集到大约16条每种类型的雄性鱼和32条未分类的雌性鱼。如果无法通过颜色或妊娠状态判断个体的性别，或者雄性的繁殖颜色已经褪色，我们就不会采集这些个体。所有鱼类都使用0.5克/升的三氯甲烷磺酸（MS-222）在海水中进行安乐死处理。我们将每个地点的所有个体放入一个1升的Nalgene容器中，容器内含有未变性的95%乙醇，然后在最多6小时内将每条鱼转移到一个单独的50毫升Falcon试管中，试管中也含有95%乙醇。从野外返回后（采集后的4-6周），我们切除了每个个体的胸鳍和尾鳍，并将鳍片放入装有95%乙醇的1.5毫升微量离心管中。
2.2 基因分型
我们使用Peichel等人（2001年）描述的协议从切下的鳍片中提取DNA。简要来说，首先用蛋白酶K消化尾部组织，然后使用标准的酚-氯仿提取法分离DNA。我们将得到的DNA用1×TE缓冲液洗脱，并使用Qiagen Corp（德国）的Qubit荧光计检测DNA浓度。在完成DNA质量控制后，我们保留了365个个体的DNA。随后，我们使用Elshire等人（2011年；Mondon等人（2018年）修改后的原始协议准备了三个用于基因组测序（GBS）的文库。第一个文库包含了2012年的96条雄性的DNA，这些雄性被随机分配到96孔板的各个位置。根据2012年数据中鉴定出的高质量变异数量，我们将第二个和第三个文库的个体数量增加到了148条。后两个文库包含了2014年的总共296条雄性和雌性的DNA，这些个体也被随机分配到文库、孔板和96孔板的各个位置。我们目标是将插入片段的大小控制在300-400个碱基对，并使用凝胶提取法对文库中的片段进行大小筛选。最后，我们使用Agilent Technologies（加利福尼亚）的Bioanalyzer确认了最终的片段大小分布。完成文库制备后，我们在不列颠哥伦比亚大学的Biodiversity Next Gen Sequencing设施中，使用Illumina HiSeq 2000仪器对每个文库进行了测序。
2.3 变异体识别
我们使用从GATK 3.3.0最佳实践指南（DePristo等人，2011年；McKenna等人，2010年）改编的流程来识别变异体。在使用Perl脚本对数据进行解复用后，我们使用Trimmomatic版本0.32（Bolger等人，2014年）对序列进行修剪和质量过滤。接着，我们使用BWA版本0.7.10的“mem”算法（Li和Durbin，2010年）将过滤后的读段与刺鱼参考基因组v3（Glazer等人，2015年）对齐。然后，我们使用GATK版本3.3.0的RealignTargetCreator和IndelRealigner重新对齐这些读段。最后，我们使用HaplotypeCaller识别变异体，并使用GenotypeGVCFs对整个数据集进行基因分型。为了便于需要外群的数据分析（例如TREEMIX），我们还从丹麦的六个海洋个体的全基因组数据（Ferchaud等人，2014年）以及西海岸的多个种群数据（Catchen等人，2013年；Samuk等人，2017年）中识别了变异体。我们使用相同的流程处理这些数据，但运行了GenotypeGVCFs的单独流程。我们使用bcftools（Li等人，2009年）中的“merge”函数合并了新斯科舍省样本和外群样本的最终VCF文件。为了简化后续分析，我们只包括了具有双等位基因单核苷酸多态性（SNPs）的位点。对于所有分析，我们还要求至少80%的个体在所有位点上都有基因型调用结果。我们对这个最终数据集使用了略有不同的筛选标准（如下所述）。这些筛选标准旨在减少偏差和/或便于特定的统计分析（例如，通过减少数据之间的相互依赖性）。除非另有说明，否则我们排除了等位基因频率（MAF）小于0.05的SNPs（根据Linck和Battey，2019年的研究）。对于需要统计独立位点的分析，我们使用R包SNPRelate中的snpgdsLDpruning()函数修剪数据集，以减少位点间的连锁不平衡（LD）。该函数计算了基因组上5个SNP窗口内的成对连锁不平衡（r2），并逐个SNP窗口递增。如果窗口内的任何SNP超过LD阈值（0.2），则随机选择一个SNP作为该窗口内SNPs的代表，其余的SNP被丢弃。这减少了由于物理连锁导致的SNPs之间的统计相互依赖性，这对于大多数系统发育和人口统计推断是不希望出现的。最终数据集包含19,000-55,000个高质量SNPs，涉及354个个体，具体数量取决于应用的筛选方法和包含的种群。三刺鱼具有染色体性别决定机制，雄性为异配性别（编码为XY，与人类相同）。雄性性染色体还与X染色体共享一个小伪常染色体区域（White等人，2015年）。由于我们对Y染色体的代表性较低且测序质量较差，因此选择不将其纳入分析。关于这些种群Y染色体的更详细分析将在即将发表的论文中呈现（Sumarli等人，2025年）。
2.4 遗传聚类：PCA、fastSTRUCTURE和TREEMIX
为了评估白色刺鱼是否代表一个独特的基因型群体，我们首先使用R包snpRelate（Zheng，2012年）通过主成分分析（PCA）对修剪后的SNP数据进行了排序。我们还使用Raj等人（2014年）描述的方法检验了fastSTRUCTURE模型对遗传数据的拟合情况。为了进一步补充聚类分析并评估基因流的存在，我们还使用TREEMIX（Pickrell和Pritchard，2012年）进行了树结构和迁移边估计。我们使用2014年收集的个体数据以及来自丹麦和不列颠哥伦比亚省的外群样本（来自Samuk等人，2017年）进行了这项分析。为了评估树的拓扑结构的可靠性，我们使用TREEMIX中包含的自举模式对树结构进行了1000次自助法复制。然后，我们将自助法得到的树合并成一个共识树。为了检测混合信号，我们使用丹麦样本作为外群，估计了一个基础树，随后逐步添加迁移边（从0开始）。对于每个新的迁移边，我们使用似然比测试（Pickrell和Pritchard，2012年）比较了新树与之前树的拟合优度。我们将“最佳”树定义为似然度显著增加的最后一个树。总体而言，PCA和fastSTRUCTURE的结果高度一致（图1，图S2），因此为了简洁起见，我们选择了PCA的结果。
2.5 定位分化特征
在存在基因流的情况下，参与两个种群间生殖隔离的位点预计会表现出异常高的分化程度，例如更高的FST值。此外，如果单个大区域或单个位点负责两个种群之间的分化，这些极端值应该在基因组中高度局部化——例如，在一个倒置区域中聚集（例如Küpper等人，2016年）。为了定位白色刺鱼和普通刺鱼之间分化涉及的基因组区域，我们使用R包OUTFLANK（Whitlock和Lotterhos，2015年）进行了FST异常值分析。该方法使用参数化自助法推断FST的预期中性分布（通过将卡方分布拟合到修剪后的SNP集合上来推断），并将观察到的FST值与这一预期进行比较，以确定每个SNP的异常状态。我们还分别对X染色体（XIX号染色体）进行了同样的分析，仅使用来自雌性个体的SNP。这样做是为了考虑（a）有效种群大小和（b）XIX号染色体上的雄性-雌性覆盖率的差异。
2.6 体型测量
为了测量体型，我们使用ImageJ（Rasband，2012年）在收集当天（在乙醇固定之前）拍摄的新鲜安乐死个体的数字照片上确定了形态学标志点的坐标。我们使用了Sharpe等人（2008年）描述的标志点；见图4B。然后，我们将这些标志点的坐标导入R语言中，并使用geomorph 2.0包（Sherratt等人，2014年）进行分析。我们进行了广义Procrustes分析来对标志点进行对齐和缩放，接着使用主成分分析来识别主要的变异轴。我们检查了前六个主成分，它们解释了体型变化的大部分（77%）。正如其他研究（Albert等人，2008年）发现的那样，第一个主成分（PC1）代表了由于保存条件导致的标本弯曲程度的差异。因此，我们将分析限制在PC2-5之间。
2.7 骨骼特征测量
为了测量骨骼特征，我们首先按照Arnegard等人（2014年）的协议使用Alizarin red对鱼类进行了染色。然后，我们拍摄了染色标本的数字照片，计数了侧向装甲板的数量，并使用ImageJ（Rasband，2012年）测量了棘刺的长度。为了计数鳃耙，我们解剖了第一个鳃弓并在解剖显微镜下进行了观察。然后，我们再次按照Arnegard等人（2014年）的方法计数了短鳃耙和长鳃耙的数量。
2.8 体色亮度
我们通过从数字照片中裁剪出每条鱼侧面1平方厘米的片段，并在恒定光照条件下使用ImageJ量化了该片段的亮度。然后，我们使用ImageJ获取了这些片段的平均RGB值（每个通道0-255），并计算了整体亮度得分：R + G + B / (255*3)。
2.9 睾丸和卵质量
我们首先从每个保存的雄性个体中解剖出睾丸，并将其在含有颗粒干燥剂的玻璃干燥器中干燥36小时。然后使用XS3DU微天平（Mettler-Tolledo，俄亥俄州）称量干燥后的睾丸重量。当两个睾丸都发育成熟后，我们同时称量两个睾丸并取平均值；否则，我们只称量一个发育成熟的睾丸。我们通过从每个雌性个体中提取最多十个卵并采用相同的方法进行称重来量化卵的大小。我们将最终重量除以测量的卵的数量，得到每个雌性的平均卵重量。需要注意的是，乙醇保存过程会从组织中提取脂质，这可能会减少睾丸和卵的总体重量，并可能降低这些测量值在生态型内的变异性。然而，由于两种生态型都是以相同的方式保存的，任何这样的脂质提取都会对两者产生相同的影响，不会偏倚生态型间的差异方向。脂质含量本身也可能是生态型间卵质量的一个生物学上有意义的变异轴，这个问题留待未来的研究。
2.10 形态数据的统计分析
我们使用线性模型（协方差分析）比较了白色刺鱼和普通刺鱼之间的每个形态特征。由于我们测量的许多特征与体型有很强的相关性，我们首先使用R包smatr（Warton等人，2012年）通过标准化主轴回归（即模型II回归）检查了体型（通过标准长度或Procrustes分析得到的“质心大小”值，以较完整的方式）与每个特征之间的关系。如果某个特征与体型至少有中等强度的显著相关性（R2 > 0.4，p < 0.05），则所有进一步的分析都使用smatr和体型作为协变量进行标准化主轴回归。否则，对于连续特征，我们使用标准线性模型，对于基于计数的特征则使用Poisson模型。当特征在两性中都有测量时，我们还包括了性别（M/F）作为协变量。为了比较不同特征，我们使用R函数scale()减去平均值并除以组合数据集的标准差来标准化所有特征值。需要注意的是，白色刺鱼和普通刺鱼在体型上存在差异（Blouw和Hagen，1990年），这使得完全控制体型变得困难。在某些样本中，两种生态型的体型重叠有限，因此在统计控制后，生态型间特征差异的回归估计将不可避免地受到体型差异的影响。上述结合主轴和标准回归的方法虽然改善了这一问题，但无法完全消除它。因此，以这种方式控制体型可能会导致对体型无关的生态型差异的低估。在未来的研究中，一种解释方法是考察这些特征在生命各个阶段的发育情况，包括白刺鱼和普通刺鱼。
2.11 稳定同位素
我们按照Reimchen等人（2008年）描述的一般方法，量化了白刺鱼和普通刺鱼的碳-13/碳-12以及氮-15/氮-14同位素比率。研究表明，这两种元素的同位素比率与沿海海洋生态系统中的营养位置和饮食有关（France 1995；Lerner等人2022）。碳同位素比率可以区分食草动物所消耗的初级生产者的类型，而氮同位素比率可以指示营养级别（France 1995；Lerner等人2022）。我们首先从每条鱼中提取背肌，如前所述将其干燥，然后用微量天平精确称量出1.00毫克的干燥组织。我们将每个单位的干燥组织放入单独的镍胶囊中，然后将这些胶囊放入96孔板中，并送往加州大学戴维斯分校的稳定同位素设施进行碳-13/碳-12和氮-15/氮-14比率的测定。我们没有获取环境样本来进行同位素比率的校准，而是专注于白刺鱼和普通刺鱼之间的相对同位素差异。我们使用R语言中的manova()函数进行了MANOVA分析来比较碳和氮比率的差异（R Core Team 2018）。我们还包括了采样地点作为协变量，以控制同位素丰度的地理变异。
3 结果
3.1 基因型聚类
我们对基因组数据的主成分分析的前两个轴显示了数据集中的三个不同的基因型簇（图1A）。其中一个簇中的雄性（图1A中的白点）都是在2012年和2014年野外被我们分类为“白色”的个体（浅色繁殖特征，并且在有丝状藻类的区域捕获）。两个基因型簇（即白刺鱼和普通刺鱼）在新斯科舍省的许多地点同时出现（图1B,C），这表明它们不代表中性的地理结构。我们没有发现明显的中间类型，这表明我们的采样没有识别出任何早期代的杂交个体，尽管由于遗传分化程度极低以及白刺鱼和普通刺鱼之间缺乏诊断性差异，无法进行正式的杂交状态可视化（例如，三角图分析）。第三个簇（图1A中的绿点）仅包含来自地理上分离的Bras d'Or地区的刺鱼。这个簇中也包含三个在野外被我们分类为“白色”的雄性，这表明要么是我们的野外分类有误，要么是Bras d'Or种群中存在少量的白色雄性个体。值得注意的是，自最初观察以来，我们和其他研究白刺鱼的研究人员从未在Bras d'Or湖地区观察到白刺鱼（C. Behrens, A. Dalziel和F. Chain，个人交流）。PCA的一般结果与fastSTRUCTURE的结果非常吻合（图S2），最佳K值为3，由Evanno等人（2005）的方法确定。这三个簇中的两个再次对应于来自大陆的表型为白色或普通的样本（雄性和雌性）。第三个独特的簇包含了所有在Brad d'Or湖中采样的个体。在K=3时，所有簇中的大多数个体都具有较低的混合血统水平，尽管没有明显的F1或回交杂交个体，其q值约为0.5或0.25/0.75（图S2，K=3）。与PCA和fastSTRUCTURE一样，共识TREEMIX树也恢复了新斯科舍刺鱼的三个群体（图2）。白刺鱼、普通刺鱼和Bras d'Or刺鱼群体都得到了强烈的单系支持，并且白刺鱼和大陆普通刺鱼作为相对年轻的姐妹群体的支持也很强（图2A，0.85–1.00自助法支持）。新斯科舍/丹麦树的最佳迁移边数是三个（图2A，似然比测试：χ21=15.52，p=0.000081）。最强的迁移边将西部的白刺鱼种群（Canal Lake）与东部的另一个白刺鱼种群（Sheet Harbour）连接起来（图2B，红色边）。其余两条边将白刺鱼群体与Guysborough的普通刺鱼种群连接起来，这与fastSTRUCTURE分析中的潜在混合信号一致（图2B，黄色边）。
3.2 FST异常值分析
由于我们主要关注白刺鱼和普通刺鱼之间的分化本身，而不是Bras d'Or湖的地理障碍的影响，我们选择将FST分析限制在仅来自大陆的白刺鱼和普通刺鱼上。这些白刺鱼和普通刺鱼之间的遗传分化发生在基因组的许多位点上（图3）。在整个基因组范围内，我们估计这些群体之间的Weir和Cockerham FST约为0.01（95%置信区间0.0102–0.0110）。从绝对值来看，这表明白刺鱼和普通刺鱼之间的分化非常小：与共域底栖和浮游物种对之间的0.4值相比（Taylor和McPhail 2000；Samuk等人2017）。一些异常位点显示出异常高的FST值，其中一个超过了0.4（图3，第八染色体）。有趣的是，这些FST异常值分布广泛，出现在每个染色体的许多位点上（图3）。也没有迹象表明白刺鱼和普通刺鱼之间的分化是由单一的连锁块（例如，倒位）引起的。这两种类型之间的分化似乎是一个全基因组现象，表明白刺鱼和普通刺鱼并不是单一多态性种群的简单形态变体。
3.3 形态特征
白刺鱼和普通刺鱼在大多数与三刺鱼生态差异相关的形态特征上没有差异，包括体型、装甲板和鳃耙（图4A）。我们注意到这些“经典”的生态关联主要是在淡水湖种群中建立的；在这里研究的海洋环境中，不同的特征可能具有生态相关性。尽管如此，白刺鱼和普通刺鱼在许多其他形态特征上仍显示出中等到大的差异（图4A）。与之前的研究一致，我们发现白刺鱼平均比普通刺鱼小约1.5个标准差（约1.5厘米）。白刺鱼的雄性和雌性在整体颜色上也明显更亮，背刺和腹刺也相对较小，尽管这种差异对体型大小的统计控制非常敏感（见方法部分）。最后，白刺鱼和普通刺鱼在繁殖相关特征上表现出一些显著差异：白刺鱼的睾丸和卵较小，但考虑到体型大小后，白刺鱼的卵数量更多（图4A）。
3.4 稳定同位素
白刺鱼和普通刺鱼的碳和氮同位素比率谱没有差异（图5）。两种生态型的样本显示出C和N比率的广泛重叠分布，在多变量分布上没有显著差异（MANOVA，物种项：Pillai's Trace=0.048，Approximate F2,106=2.0，p=0.088）。相比之下，采样地点对C和N比率有显著影响，Bras d'Or种群的13C和15N比率明显较低（图5，MANOVA位置项：Pillai's Trace=1.18，Approximate F8,214=39，p<2×10^-16）。
4 讨论
处于遗传分化早期阶段的新兴物种为我们提供了了解物种形成原因的独特窗口。然而，识别这样的系统本质上是困难的。在这里，我们使用了现代群体基因组学方法，试图澄清新斯科舍省的“白色”三刺鱼——一种已知超过40年的表型独特形式——是否代表一个遗传上不同的谱系。我们发现了令人信服的证据，表明白刺鱼在遗传上是不同的，但与普通的大西洋海洋刺鱼生态型非常接近。较低的基因组范围遗传分化可能是由于持续的基因流和/或这两种类型之间的最近分化所致。我们还发现，白刺鱼和普通刺鱼在大多数与刺鱼营养分化相关的形态特征上没有差异，除了体型大小。这两种形式在体型和鳃耙方面相似，与共域的浮游和底栖物种不同（Hatfield 1997）。它们的生态相似性反映在它们广泛重叠的稳定同位素比率上。相反，白刺鱼主要在雄性体型、颜色和繁殖相关特征以及防御性刺方面有所不同。因此，与共域刺鱼物种对和其他所有邻域形式（如海洋-溪流和湖泊-溪流刺鱼对）不同，白刺鱼似乎沿着不同的、可能非生态的特征轴分化。我们注意到，未检测到生态差异并不意味着不存在我们未测量的生态分化；可能存在许多其他生态相关的轴（例如，迁移策略、微生境利用、温度耐受性），白刺鱼和普通刺鱼在这些轴上有差异。一个更简单的解释是，这两种生态型是异域分化的，通过突变顺序效应积累了差异，而不是通过不同的选择，最近才进入共域。最近的研究提供了直接证据，表明亲代抚育的差异在这个系统中起到了新的隔离机制的作用（Behrens, Maciejewski等人2025）。因此，性选择和/或生态介导的选择可能是驱动这些种群分化的机制。据我们所知，在三刺鱼中，这种由这些机制驱动的物种形成没有类似的例子。然而，关于因果关系有一个重要的注意事项：观察到的繁殖行为差异也可能是二次接触的结果，而不是初始分化的原因。例如，亲代抚育的差异可能在接触后作为强化形式进化出来，或者是对繁殖干扰的直接反应（例如，生态型之间的卵食行为；Behrens, Maciejewski等人2025）。区分这些替代解释需要仔细的人口统计和实验工作。
4.1 白刺鱼作为一个独特的生态型
虽然我们使用的群体遗传学方法表明白刺鱼在基因型上与普通刺鱼不同，但它们仍然与共域的普通刺鱼非常接近。新斯科舍省的白刺鱼和普通刺鱼之间的总体FST仅为约0.01。对于一个在表型上可区分的生态型来说，这一数值异常低，相比之下，同域生活的底栖生物和浮游生物之间的FST值约为0.4（Taylor和McPhail 2000）。它远低于不列颠哥伦比亚省湖泊生态型和溪流生态型之间的FST值（约0.2），后者的生殖隔离程度相对较低，且尚未达到完全同域的状态（Roesti等人2012）。我们需要注意的是，FST是一个相对指标，其值会随着种群内部多样性的变化而变化；因此，在不同有效种群规模或突变率的情况下比较FST值时应谨慎解读。根据TREEMIX分析的结果，这种高程度的遗传相似性似乎是最近分化的结果——很可能比大西洋东西部分裂的时间（17-37千年前）要近得多（Fang等人2018）。我们注意到，Fang等人（2018）对大西洋-太平洋刺鱼分裂时间的估计受到了广泛质疑，Fang等人（2020）自己也承认这一估计可能偏低。这一分化时间估计还可能受到白刺鱼和普通刺鱼之间持续基因流的影响，需要更高分辨率的基因组数据来揭示它们的完整进化历史。鉴于最近的分化以及基因流的存在，令人惊讶的是在我们的样本中似乎没有出现任何早期代的杂交个体。例如，如果白刺鱼和普通刺鱼之间的遗传差异很多且遍布整个基因组，那么杂交个体应该在PCA投影中表现为中间类型，或者在fastSTRUCTURE图中显示出大量（F1代约50%）的混合血统。对于缺乏杂交个体的现象，有几种可能的解释。首先，我们没有收集到外观模糊的雄性个体，而这些个体可能更有可能是杂交个体。然而，这并不能解释为什么没有发现雌性杂交个体。也有可能是我们的采样方法在某种程度上偏向于无法发现杂交个体。例如，杂交个体可能在筑巢地点或交配时间上有特殊的偏好（正如Behrens、Tucker等人2025年所研究的那样）。最后，白刺鱼和普通刺鱼之间的生殖隔离虽然是在最近才进化出来的，但可能已经接近完全隔离。事实上，Jamieson（1992a）的实验室和野外试验表明，白刺鱼和普通刺鱼之间存在近乎完美的配型交配。如果交配前的隔离确实像这些实验所显示的那样强烈，那么我们没有检测到任何早期代的杂交个体也就不足为奇了。我们还要指出，图1A中位于白刺鱼和普通刺鱼群体边缘的个体可能代表的是后期代的回交杂交个体，而不是纯类型个体（参见Dean等人2024）；即使存在基因流，强烈的选择压力也能有效地从同域种群中清除第一代杂交个体（Schluter等人2025）。一个关键的未解问题是当前同域状态是如何形成的。白刺鱼显著的地理分布——仅限于新斯科舍省的南岸，并与普通刺鱼共存，而普通刺鱼则单独分布在北岸——这与多种进化历史相符。一种可能的情景是异域分化后的二次接触：普通刺鱼可能通过坎索海峡（大约在6000年前还是干涸的；Vacchi等人2018）扩散，并与一个在隔离状态下分化的芬迪湾“白刺鱼”种群发生了二次接触（参见Kitano等人2007, 2009）。另一种可能是这两种生态型在当前同域范围内分化时存在持续的基因流。在一篇相关的全基因组研究中（Sumarli等人2025），通过人口统计模型比较了这些情景，发现连续基因流的分化模型比二次接触模型更能符合数据，从而支持了后一种解释。尽管如此，我们仍然认为这两种情景都是可能的，因为人口统计模型在区分近期二次接触和长期存在基因流的分化方面能力有限，需要进一步的研究来完全解决这个问题。
4.2 生殖策略多态性？我们在这里提出的假设是，白刺鱼代表了一个与普通大西洋三刺鱼不同的物种（Blouw和Hagen 1990）。另一种解释是，这两种形式的刺鱼代表了雄性生殖策略的多态性（Gross 1996；Taborsky等人2008；Mank 2023）。白刺鱼可能代表三种类型的雄性替代生殖策略：遗传性的、发育过程中的和条件依赖性的。我们将在下面讨论每种策略的证据。白刺鱼不太可能代表由遗传因素决定的替代雄性策略。替代雄性策略预计具有简单的遗传基础，从而避免了重组导致的策略崩溃（Gross 1996；Kopp和Hermisson 2006；Taborsky等人2008）。实证证据支持这一预测，所有已知的复杂遗传交配策略多态性案例都与一个大的非重组区域相关（Kopp和Hermisson 2006；Küpper等人2016；Purcell和Brelsford 2025）。然而，白刺鱼和普通刺鱼之间的全基因组差异并不符合这种遗传结构。相反，尽管它们处于同域状态，但白刺鱼和普通刺鱼在许多位点上显示出遗传变化，并且基因流总体上减少——这符合不完全和/或非常近期生殖隔离的情况。相比之下，纯粹条件依赖的策略（例如，低身体状况触发策略转换）如果不存在遗传多态性，则不会与遗传差异有很强的关联（Gross 1996）。然而，我们观察到，在每个地理地点采样的白刺鱼和普通刺鱼对在多个染色体上都具有遗传差异，这强烈反对了这种可能性。最后，白刺鱼很可能不是由发育过程决定的策略（例如，第一年与第二年繁殖的雄性），因为这种多态性与遗传差异没有很强的关联。此外，我们在白刺鱼和普通刺鱼基因簇之间看到的遗传差异随时间保持稳定（例如，“白刺鱼”PCA簇包含2012年和2014年的白刺鱼），排除了群体效应作为原因的可能性。因此，我们的结果与Blouw和Hagen（1990）的原始假设一致，即白刺鱼和普通刺鱼代表的是部分（或最近完全）生殖隔离的谱系，而不是替代雄性策略。
4.3 新斯科舍省内的遗传结构
我们的分析显示，来自内陆海布拉斯多尔湖的普通刺鱼与外海岸（“大陆”）的普通刺鱼有所不同。这与人们对加拿大东部刺鱼种群表型和遗传多样性的日益重视是一致的，而这些种群通常研究不足（Haines 2023）。有趣的是，尽管Blouw及其同事之前在布拉斯多尔湖发现了白刺鱼，但从布拉斯多尔湖采集的个体在基因型上似乎与大陆上的白刺鱼并不相似。更奇怪的是，我们在这些种群中表型上鉴定为“白色”的少数雄性个体未能与大陆上的其他白刺鱼聚类在一起。一种可能性是，导致白刺鱼婚配颜色的等位基因在海洋环境中的布拉斯多尔湖种群中发生了分离。也许布拉斯多尔湖与大陆上的白刺鱼之间存在持续的基因流（直接或通过大陆上的普通刺鱼）和/或平衡选择，从而维持了这种颜色多态性，而不受其他决定白刺鱼生态型的位点和特征的影响。进一步研究白刺鱼和普通刺鱼之间的遗传差异，并在布拉斯多尔湖地区进行更广泛的采样，有望阐明这些问题。
4.4 白刺鱼研究系统的潜力
我们的发现表明，白刺鱼是一个研究近期物种形成的遗传学方面的优秀候选系统。实际上，已经有研究开始探讨白刺鱼和普通刺鱼之间某些特征差异的遗传基础（Behrens、Maciejewski等人2025）。此外，白刺鱼还可以作为检验生态选择和性选择在物种形成中相互作用理论的理想模型。白刺鱼在许多交配和/或生殖相关特征上出现了分化，而在大多数典型的生态特征上没有分化。如果确实如此，性选择可能是该系统中生殖隔离进化的重要驱动力。例如，白刺鱼的雄性体色可能作为性信号与筑巢地点偏好的变化共同进化。虽然理论认为在基因流存在的情况下，仅通过性选择进行物种形成是困难的（Servedio和Bürger 2014；Servedio和Kopp 2012），但一些模型表明，资源的空间变异（例如筑巢地点）可以显著增加通过性选择进行物种形成的概率，亲代抚育可能是选择的目标（M'Gonigle等人2012；Reyes等人2025）。
5 结论
在这里，我们使用全基因组基因分型、形态测量和稳定同位素分析来探讨白刺鱼是否代表一个在生态上有所分化、遗传上不同的生态型。我们发现，白刺鱼在遗传上与普通刺鱼不同，这种差异涉及多个染色体上的多个基因组区域：尽管整体基因组分化程度较低且存在基因流，但白刺鱼的雄性和雌性形成了一个独特的基因型类别，与同域的普通刺鱼不同。因此，白刺鱼不太可能代表由遗传因素决定的雄性交配策略多态性，也不是年轻或身体状况较差的雄性，而是一个具有尚未完全生殖隔离的独特生态型（以及潜在的新物种）。最后，我们发现白刺鱼没有表现出所有典型的淡水刺鱼物种对所具有的生态分化特征。性选择（可能通过筑巢地点偏好介导）可能是该系统中生殖隔离的关键驱动因素。
作者贡献
Kieran Samuk：概念化（主导）、数据管理（主导）、正式分析（主导）、资金获取（支持）、调查（主导）、方法论（主导）、项目管理（主导）、资源（支持）、软件（主导）、可视化（主导）、写作——初稿（主导）、写作——审阅和编辑（支持）。Dolph Schluter：概念化（平等参与）、正式分析（支持）、资金获取（主导）、方法论（支持）、资源（支持）、软件（支持）、监督（主导）、写作——审阅和编辑（平等参与）。Hannah Visty：数据管理（支持）、调查（支持）、方法论（支持）、写作——审阅和编辑（支持）。
致谢
我们感谢Max Blouw对这一系统的原始研究，以及他在野外工作和重新定位新斯科舍省研究地点方面提供的建议和指导。Anne Dalziel、Laura Weir和Bill Marshall在新斯科舍省的工作中提供了关键的支持和材料。Kate Ostevik在新斯科舍省的野外工作中提供了重要帮助。Kate Ostevik、Greg Owens和Kristin Nurkowski在准备GBS文库用于测序时提供了重要帮助。Jacob Best在鳃耙计数样本染色方面提供了专业协助。Diana Rennison、Seth Rudman和Sara Miller以及Schluter实验室的成员对本文的原始版本进行了有益的编辑。
资金
本研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）的发现基金支持。KS还获得了NSERC的加拿大研究生奖学金。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
数据可用性声明
本文的所有代码和数据可通过以下Github仓库获取：https://github.com/samuk-lab/ws_ecology。
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