摘要
烟酰胺酶（PncA）催化烟酰胺水解为烟酸，这是NAD+回收途径中的关键步骤。在莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferi中，质粒编码的gene bbe22编码一种PncA酶，这种酶对哺乳动物和蜱虫宿主的生存至关重要。先前的遗传和生化研究表明，B. burgdorferi PncA的翻译从一个罕见的非典型AUU起始密码子开始，导致产生的蛋白质比目前主要数据库中注释的序列长24个残基。尽管有这些发现，但像UniProt和KEGG这样的公共资源仍然列出了一个从第36个残基开始的截短蛋白质，该蛋白质缺乏酶活性所需的N端区域。在这里，我们报告了B. burgdorferi PncA的全长晶体结构，其分辨率达到了3.2 Å。该结构揭示了细菌烟酰胺酶的典型折叠，并且活性位点中有与烟酸（酶反应的产物）一致的电子密度。与同源PncA酶的结构比较表明，催化结构得到了保留，包括参与底物结合和催化的残基。重要的是，实验确定的结构证实了之前描述的较长N端序列对于形成正确的折叠和活性位点几何结构是必需的，而截短的注释在结构上与观察到的折叠和AlphaFold的预测不符。我们的结果提供了B. burgdorferi PncA的首次结构表征，并解决了bbe22的长期注释差异，验证了正确的蛋白质序列，并为这种关键代谢酶的烟酰胺酶活性提供了结构基础。
缩写
AFDB：AlphaFold蛋白质结构数据库
NAD+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
PncA：烟酰胺酶
RMSD：均方根偏差
莱姆病的致病菌Borrelia burgdorferi拥有一个非常不寻常的基因组，由一条线性染色体和许多线性和环状质粒组成，这些质粒编码了许多在蜱虫和脊椎动物宿主之间的流行病周期中生存所需的基因[[1, 2]]。在这些质粒编码的基因中，位于线性质粒lp25上的BBE22已被证明对B. burgdorferi的感染性和在哺乳动物中的生存至关重要[[3]]。遗传研究表明，失去lp25会消除感染性，而单独引入BBE22可以恢复螺旋体感染小鼠的能力[[3]]。BBE22编码一种烟酰胺酶（PncA），这种酶催化烟酰胺水解为烟酸，这是NAD+回收途径中的关键步骤[[3]]。对于B. burgdorferi来说，这一途径尤为重要，因为它缺乏几种从头合成NAD+所需的酶，因此严重依赖回收途径来维持NAD+的稳态[[1]]。与这种代谢依赖性一致，pncA的破坏会导致在哺乳动物宿主中的感染性丧失以及在蜱虫中的生存能力下降。尽管PncA在B. burgdorferi中的功能重要性，但其基因的注释长期以来一直存在问题。早期的基因组注释预测了一种缺乏参与细菌烟酰胺酶催化三联体的保守N端天冬氨酸残基的蛋白质[[1, 3, 4]]。随后的生化和遗传分析表明，翻译实际上是从一个罕见的非典型AUU起始密码子开始的，产生的蛋白质比最初注释的序列长约24个氨基酸。这个延长的N端区域恢复了功能性烟酰胺酶的特征性催化结构[[4]]。然而，像UniProt和KEGG这样的主要序列数据库仍然列出了截短的蛋白质版本，导致数据库注释与实验验证的序列信息之间存在持续差异。B. burgdorferi PncA的结构表征一直缺乏。来自其他细菌（包括Streptococcus pneumoniae和Bacillus subtilis）的烟酰胺酶的结构显示了一种保守的折叠和催化机制，该机制涉及金属辅助的水解反应，将烟酰胺转化为烟酸。因此，确定B. burgdorferi PncA的结构不仅对于理解这种病原体的NAD+代谢的分子基础很重要，而且对于解决正确的蛋白质注释和验证实验确定的N端延伸也很重要。在这里，我们报告了B. burgdorferi PncA的全长晶体结构，其对应于202个残基中的6-196个残基，分辨率达到了3.2 Å。该结构揭示了细菌烟酰胺酶的保守结构，并包含与活性位点中结合的烟酸和配体以及一个配位金属一致的电子密度。与同源酶的结构比较证实，延长的N端区域对于酶的正确折叠和催化构型是不可或缺的，从而提供了几个数据库中存在的截短注释不正确的结构证据。
方法
克隆和蛋白质表达
B. burgdorferi BBE22（UniProt: O50718）的编码序列（对应于全长蛋白质（1-202个残基）由BioCat GmbH（德国海德堡）合成。该基因从合成构建体中通过PCR扩增，并连接到编码N端6xHis标签和TEV蛋白酶切割位点的pETm-11表达载体上。连接的载体被转化到大肠杆菌XL-1 Blue细胞中，用于选择菌落、分离质粒DNA并通过PCR进行验证。蛋白质的表达方法与之前描述的B. burgdorferi PFam12成员蛋白相同[[5]]。
BBE22的纯化
通过超声波处理裂解大肠杆菌细胞后，以10000 × g离心30分钟得到的上清液应用于Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）柱上。用250 mm NaCl、50 mm NaH2PO4和300 mm咪唑溶液（pH 7.5）从柱子上洗脱结合的6xHis标记重组蛋白。为了去除N端6×His标签，将重组蛋白与TEV蛋白酶混合并在室温下过夜孵育。进行第二轮亲和层析以去除切割的6×His标签和TEV蛋白酶。将纯化和切割后的蛋白质溶液的缓冲液更换为10 mm Tris/HCl（pH 8.0）和20 mm NaCl，并使用Amicon离心过滤单元（Millipore）浓缩至6.1 mg·mL−1。
BBE22的结晶
将纯化的蛋白质（6.1 mg·mL−1，溶于10 mm Tris–HCl pH 8.0和20 mm NaCl）与100 mm烟酰胺储备溶液混合，达到最终浓度5 mm，然后在Tecan Freedom EVO100工作站（Tecan Group）准备的96孔板中通过滴加法结晶。最初的结晶试验使用JCSG-plus和Structure screen 1 & 2（Molecular Dimensions）进行筛选，随后进行优化。用于数据收集的晶体是通过混合等体积的蛋白质溶液和沉淀物（含有25% PEG 3350和0.1 M Bis-Tris（pH 5.5）来生长的。晶体通过添加10%甘油进行快速冷冻以保护，并储存在液氮中。
X射线衍射数据
X射线衍射数据是在英国牛津郡的Diamond Light Source的I03光束线上收集的。衍射图像使用XDS处理和索引，积分强度使用CCP4套件中的AIMLESS进行缩放和合并[[6, 7]]。初始相位是使用Phaser通过分子替换获得的[[8]]。使用BUCCANEER进行自动模型构建[[9]]，然后在COOT中进行迭代手动模型调整[[10]]。使用MATTHEWS确定单位细胞中的溶剂含量[[11]]。晶体学精修使用REFMAC5完成[[12]]。数据收集、精修和验证统计的总结见表1。选择3.2 Å的分辨率截止是基于CC1/2、I/σ(I)和完整性标准，因为包含更高分辨率的数据并没有改善图谱质量。键角异常值主要位于电子密度较弱的区域，特别是在灵活的环区域，并且与这一分辨率下的精修结果一致。
结果和讨论
Borrelia burgdorferi PncA的总体结构
使用X射线晶体学确定了B. burgdorferi PncA的晶体结构，分辨率为3.2 Å。精修后的BBE22模型包括全长202个残基中的6-196个残基，对应于之前描述的实验验证的全长序列[[4]]。由于电子密度较弱，N端和C端残基没有被建模。总体折叠与观察到的细菌烟酰胺酶的折叠一致，属于催化烟酰胺转化为烟酸的保守水解酶家族（图1A）。该酶采用了其他PncA同源物中观察到的特征性α/β结构，由中央的β-折叠片和两侧的α-螺旋组成，形成了酶的催化核心。这种结构在细菌烟酰胺酶中高度保守，并与之前为BBE22证明的酶活性一致[[3]]。图1（在图查看器中打开）
（A）B. burgdorferi BBE22的晶体结构，从N端的蓝色到C端的红色进行着色。显示了β-链（β1-β5）和α-螺旋（α1-α4）。活性位点中显示了烟酸（棒状表示）和催化锌离子（灰色球体），以及参与配体协调的选定残基。（B）2Fo-Fc电子密度图在1σ处进行等高线显示，显示了活性位点中的烟酸和锌离子。活性位点中的电子密度与烟酸一致。
通过检查电子密度图，发现活性位点口袋内有明显的密度，对应于结合的小分子。蛋白质与烟酰胺共结晶；然而，观察到的密度与烟酰胺一致，这是烟酰胺酶反应的产物（图1B），表明在结晶过程中发生了酶促转化。将烟酸建模到这个密度中产生了很好的拟合，没有空间冲突，并且与周围残基的化学相互作用合理。此外，在活性位点中观察到了与Zn2+离子一致的电子密度，由Asp52、His54和His73残基配位，这与之前表征的烟酰胺酶结构一致。
为了评估B. burgdorferi PncA的结构保守性和配体在活性位点的结合，将结构与之前确定的细菌PncA同源物的晶体结构进行了叠加，包括来自Leishmania infantum[[13]]、Streptococcus pneumoniae[[14]]、Acinetobacter baumannii[[15]]和Bacillus subtilis的酶（图2A）。图2（在图查看器中打开）
（A）B. burgdorferi BBE22（残基6-196，蓝色）的晶体结构与L. infantum的PncA（PDB ID 3R2J；金色；RMSD 1.24 Å）、S. pneumoniae的PncA（PDB ID 3O94；橙色；RMSD 1.53 Å）、A. baumannii的PncA（PDB ID 2WT9；灰色；RMSD 1.28 Å）和B. subtilis的PncA（PDB ID 5ZN8；绿色；RMSD 1.46 Å）的晶体结构进行了叠加。（B）B. burgdorferi BBE22（蓝色）的晶体结构与AlphaFold预测的PncA结构进行了叠加，来自T. brucei（UniProt: Q38FD5；棕色；平均pLDDT 96.2；RMSD 1.11 Å）、K. pneumoniae（UniProt: A0A0H3GRH4；绿色；平均pLDDT 96.2；RMSD 1.22 Å）、S. typhimurium（UniProt: Q8ZPV8；粉色；平均pLDDT 96.3；RMSD 1.19 Å）、S. dysenteriae（UniProt: Q32GB2；灰色；平均pLDDT 96.3；RMSD 1.20 Å）和N. gonorrhoeae（UniProt: Q5F5J1；金色；平均pLDDT 98.0；RMSD 1.52 Å）的晶体结构进行了叠加。（C）B. burgdorferi BBE22的活性位点（蓝色）与L. infantum（金色）、S. pneumoniae（橙色）和A. baumannii（灰色）的实验确定的PncA-烟酸复合物进行了叠加。活性位点中显示了烟酸和催化金属离子。残基编号对应于B. burgdorferi BBE22。进一步的DALI服务器[[16]]分析针对AlphaFold数据库（AFDB2）显示与AlphaFold[[17]]预测的来自各种生物体的PncA结构有高相似性，其中最高相似性显示为Trypanosoma brucei、Klebsiella pneumoniae、Salmonella typhimurium、Shigella dysenteriae、Escherichia coli和Neisseria gonorrhoeae的PncA（图2B和表2）。表2。BBE22的DALI服务器分析结果。这些结构对应于AlphaFold蛋白质结构数据库（AFDB）中的AlphaFold预测模型。
蛋白质
生物体 UniProt Z-score RMSD (Å) 同一性 (%)
1. 烟酰胺酶 Trypanosoma brucei Q38FD5 30.2 1.5 35
2. 烟酰胺酶 Klebsiella pneumoniae A0A0H3GRH4 29.2 1.5 34
3.烟酰胺酶
沙门氏菌鼠伤寒亚种
Q8ZPV8
29.2
1.6
34
218
4. 烟酰胺酶
志贺氏菌痢疾亚种
Q32GB2
29.1
1.6
36
219
5. 烟酰胺酶
大肠杆菌
P21369
29.1
1.5
35
213
6. 烟酰胺酶
淋病奈瑟菌
Q5F5J1
26.4
1.7
26
211
活性位点位于由连接中央β-折叠片与周围螺旋的环状结构形成的口袋内。Asp14、Phe19、Leu25、Trp70、Lys98、Tyr107、Phe143和Cys144这些残基构成了底物结合口袋，而Asp52、His54和His73则协同作用以调控催化金属离子。与来自L. infantum、S. pneumoniae和A. baumannii的PncA结构进行比对后，发现催化核心和底物结合口袋具有高度保守性（图2C）。关键残基排列紧密，表明催化机制在不同物种间是保守的。此外，B. burgdorferi PncA模型中的烟酸位置与实验确定的复合物中的配体位置非常吻合。这些结构观察结果与先前的生化研究一致，证明BBE22具有烟酰胺酶活性，并能补充NAD生物合成缺陷的沙门氏菌突变体[[3]]。基于结构的序列比对进一步显示了PncA同源物中关键催化和底物结合残基的保守性（图3）。
确定B. burgdorferi PncA结构的一个关键动机是解决实验验证的蛋白质序列与数据库注释之间的差异。早期研究表明，pncA基因由罕见的AUU起始密码子翻译，导致生成的蛋白质长度比数据库注释的长度更长[[4]]。然而，这种截短的注释仍然存在于多个公共数据库中，例如UniProt（条目O50718）和KEGG中的B. burgdorferi条目BBE22，包括UniProt中提供的AlphaFold预测的截短B. burgdorferi PncA结构。与基于截短数据库序列的AlphaFold预测相比，发现基于完整序列的模型能够更好地再现实验观察到的结构（图4A）。
（A）BBE22的晶体结构（残基6–196，蓝色）与UniProt中的截短AlphaFold预测（红色；RMSD 0.67 Å）重叠。晶体结构中缺失的N端片段用黄色标示。N端和C端也进行了标注。（B）全长BBE22序列与UniProt和KEGG数据库中注释的BBE22序列进行比对。全长蛋白质中额外的N端残基用黄色背景突出显示。由于电子密度较低而在晶体结构中未观察到的N端和C端残基用红色标示。晶体结构清楚地支持了更长的蛋白质序列。N端区域有助于形成稳定的催化口袋结构框架，这为先前的生化观察结果提供了结构解释，即延长的N端对于酶活性是必需的[[4]]。如截短注释所暗示的，去除这一区域会破坏整体结构，并消除催化元件正确定位所需的残基（图4B）。
这些结构观察结果直接证明当前注释的截短序列是不正确的，B. burgdorferi中的功能性PncA酶实际上对应于之前描述的从AUU密码子开始的较长形式[[4]]。鉴于PncA在B. burgdorferi感染周期中的关键作用，准确注释这一蛋白质对于研究细菌代谢以及潜在的NAD回收途径治疗具有重要意义。这些结果首次提供了BBE22的结构特征，验证了正确的序列，并确立了B. burgdorferi PncA的结构框架，解决了主要蛋白质数据库中长期存在的注释差异。
本工作得到了欧盟“恢复与韧性机制”项目（项目编号5.2.1.1.i.0/2/24/I/CFLA/001“拉脱维亚有机合成研究所与拉脱维亚生物医学研究及研究中心的整合”）的支持。
我们感谢英国牛津郡的Diamond Light Source（光束线MX39641）以及I03光束线工作人员在晶体测试和数据收集方面的协助。
作者声明没有利益冲突。
KB负责设计并规划研究，执行实验，分析并解释数据，获取资金，并撰写手稿。
本文的同行评审历史可访问：https://www.webofscience.com/api/gateway/wos/peer-review/10.1002/2211-5463.70268。
B. burgdorferi BBE22的坐标和结构因子已存入蛋白质数据库，访问号为29IV。
打赏
