法伊扎·詹 | 阿迪尔·加尼
印度斯利那加克什米尔大学食品科学与技术系功能性食品与营养保健品实验室，邮编190006
**摘要**
本研究使用了三种小米品种（狐尾小米、珍珠小米和黍米）提取的蛋白质。通过超声处理制备了含有α-生育酚的纳米复合物。该溶液被用作电纺法的原料，制备出直径在250.20至347.48纳米范围内的纳米纤维。分别用扫描电子显微镜（SEM）观察了狐尾蛋白、黍米蛋白和珍珠蛋白负载α-生育酚的纳米纤维（FxTN、PrTN和PeTN）的形态特征，并通过衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）进行了光谱分析。结果显示，这些纳米纤维对α-生育酚的包封效率分别为78.98%、80.32%和83.09%。还测定了这些纳米纤维在模拟胃液和肠液条件下的体外释放行为。研究发现，FxTN在抗氧化活性方面表现最佳（抑制率72.87%），PrTN在金属螯合能力方面表现最强（抑制率72.87%），并且其抗微生物活性（抑制圈直径为1.0-4.2毫米）也得到了很好的保持。
**1. 引言**
电纺是一种在外加电场作用下生成纳米纤维的有效方法，可生产出直径在纳米级别的纤维。纳米纤维具有高比表面积、孔隙间连通性、高孔隙率和均匀性等优点（Zheng等人，2022年）。这些超细纤维在工业上具有广泛应用潜力，尤其是作为包封系统（Lopez-Rubio等人，2012年）。与其他传统技术相比，纳米纤维中的生物活性成分具有更高的灵活性、成本效益和负载效率（Ding等人，2019年）。在食品工业中，人们越来越关注使用多糖、纤维素、脂质和蛋白质等天然生物聚合物来开发纳米纤维，因为这些材料可再生、可生物降解且具有生物相容性（Karami等人，2021年；Yao等人，2022年）。由于植物蛋白无毒、纯素且可生物降解，目前成为生物活性成分和缓释药物的理想载体（Lin等人，2021年；Li等人，2021年）。在这种情况下，小米是提取蛋白质的理想选择。小米是一种古老的谷物，在自然界中广泛存在。小米中的蛋白质含量较高，含有丰富的谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸（Kaur等人，2024年），同时含有较多的含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸），比水稻和小麦等主粮更多（Amadou等人，2013年）。因此，小米被视为健康的蛋白质来源替代品。小米蛋白质的结构多样性使其能够形成纳米颗粒和纳米纤维，从而提高其生物活性成分的保留率和纺丝性能。此外，小米蛋白质具有两亲性，适合作为亲脂性生物活性成分的载体（Sachdev等人，2023年）。小米还是耐气候的未充分利用作物，使其成为比玉米蛋白更可持续的选择。
维生素E最常见的生物活性形式是α-生育酚，它具有亲脂性并具有抗氧化作用，可预防心血管疾病、癌症、内分泌和神经系统疾病（Fathia等人，2017年）。此外，它还参与细胞信号传导和基因表达调控（Flohé，2006年）。然而，游离α-生育酚存在一些局限性，如疏水性、光敏感性和在胃液中的快速分解（Trombino等人，2009年）。因此，为了提高其效率和稳定性，通常需要将其包封。
基于植物的蛋白质由于链结构多样、聚合物间的排斥力及流体动力学特性，通过电纺过程生成纳米纤维的效率较低（Schiffman和Schauer，2008年）。电纺过程中使用了多种食品级聚合物，其中聚乙烯醇（PVA）是一种合成聚合物，具有水溶性、无毒、热稳定性和生物相容性。PVA通过减少分子间的排斥力、增加交联程度和提升带电生物聚合物溶液的粘度来帮助纺丝（Bonino等人，2011年）。因此，在本研究中，将小米蛋白与PVA混合以改善纳米纤维的结构性能，从而实现α-生育酚的控释和缓释。
在电纺包封过程中，壁材的选择至关重要。本研究采用纳米技术将亲脂性α-生育酚负载到疏水性小米蛋白中。电纺作为一种纳米包封方法，旨在表征这种新型纳米纤维的特性。由于狐尾小米、珍珠小米和黍米在结构、成分和功能上的差异，它们对纳米纤维的形成会产生不同影响。氨基酸组成、两亲性和疏水性的差异会影响α-生育酚的屏蔽效果。据我们所知，目前尚无相关研究探讨纳米纤维在模拟胃液条件下对α-生育酚生物活性的保护作用。
**2. 材料与方法**
2.1 **材料**
黍米、狐尾小米和珍珠小米从印度斯利那加的当地市场购买。蛋白质提取方法参照先前研究（Jhan等人，2021年）。通过凯氏定氮法（Kjeldahl法，N×5.71）测定，提取的小米蛋白干基蛋白质含量分别为83.02%、88.5%和79.87%。α-生育酚（纯度98%）、聚乙烯醇（PVA）及其他实验用化学品均为分析级，购自伊朗德黑兰的Sigma Chemical公司。
2.2 **α-生育酚负载小米蛋白溶液的制备**
α-生育酚负载的小米蛋白溶液的制备方法参考Jhan等人（2022年）的研究，并稍作修改：将5克蛋白质溶解在250毫升硼酸盐缓冲液中，同时将0.5克α-生育酚溶解在无水乙醇中至总体积50毫升，两者按1:5（v/v）比例混合。混合物在直径为12毫米的超声仪（Cole-Parmer，24711–35，印度孟买）中超声处理约1小时，以促进疏水复合体的形成并减小样品颗粒大小。超声参数为220V，处理时间为30分钟。处理后，将样品在3220×g条件下离心10分钟。随后向超声处理后的样品中加入1%聚乙烯醇（25毫升），在200转/分钟下搅拌均匀后备用。
2.3 **电纺过程**
将α-生育酚负载的小米蛋白通过电纺设备（E spin nanotech，印度）纺成纳米纤维，电压为22 kV，进料速率为0.4毫升/小时，针头与收集器之间的距离为12厘米。使用不锈钢针头（16号）将5毫升样品溶液注入注射器中。带正电的样品溶液从针头移动到涂有铝箔的收集表面。设备置于封闭室内，环境温度和相对湿度（RH）控制在60%。
2.4 **场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）**
使用FE-SEM（Gemini SEM 500 8203017193，英国/英国）对纳米纤维进行形态分析。图像在10 kV加速电压下记录。利用ImageJ软件（美国马里兰州）从SEM显微照片中测量100根纳米纤维的平均直径和分布。
2.5 **衰减全反射红外光谱（ATR-FTIR）**
使用傅里叶变换红外光谱仪（Cary 630，Agilent Technologies）对纳米纤维进行光谱分析，检测范围为4000–400 cm⁻¹，分辨率为4 cm⁻¹。
2.6 **包封效率**
参考Noor等人（2022年）的方法测定纳米纤维对α-生育酚的包封效率，并进行适当修改：将20毫克α-生育酚负载的纳米纤维与无水乙醇混合，然后在3500×g条件下离心3分钟以去除表面附着的α-生育酚。回收的颗粒重新悬浮在无水乙醇中，超声处理10分钟以释放包封的α-生育酚，再离心。取上清液并用Whatman 1号滤膜过滤。使用UV–Vis分光光度计（Hitachi，日本，型号U2900）在245 nm处测量上清液的吸光度，根据已知α-生育酚浓度的校准曲线计算维生素E含量。
**2.7 α-生育酚在模拟胃液条件下的释放行为**
按照Jhan等人（2022年）的方法研究纳米纤维对α-生育酚的释放行为：首先配制模拟胃液条件（SMC），将α-淀粉酶（0.2%）溶解在pH 7的磷酸盐缓冲液中。将纳米纤维（20毫克）置于SMC中5分钟后离心5000 g，测量上清液的吸光度。回收的颗粒置于模拟胃液条件（SGC）下，使用pH 7的NaCl（9 g/mL）和胃蛋白酶（3 g/L）在37°C水浴中处理1.5小时。样品在3500 g条件下离心8分钟，每隔30和60分钟测量一次上清液的吸光度。随后将颗粒置于模拟肠液条件（SIC）下，使用pH 7.5的磷酸盐缓冲液和胆盐（3 g/L）及胰酶（10 g/mL）处理2小时，期间每隔30、60和120分钟测量一次上清液的吸光度。
2.8 **电纺小米蛋白负载α-生育酚纳米纤维的生物活性**
在模拟胃肠条件下评估纳米纤维的生物活性：将200毫克样品纳米纤维分散在10毫升模拟胃液和肠液溶液中。最终上清液用于抗氧化和抗微生物活性分析。同时，将游离α-生育酚（2毫克/毫升，相当于每毫升纳米纤维粉末中的α-生育酚含量）也按照相同方法进行体外模拟胃肠条件测试，以比较其抗氧化活性。
2.8.1 **抗氧化活性**
2.8.1.1 **DPPH清除活性**
参照Qi等人（2024年）的方法测定纳米纤维和游离α-生育酚的体外抗氧化活性，稍作修改：取每个样品（5毫升）与60 mM DPPH溶液（3.9毫升）混合，置于25°C下避光反应30分钟。使用UV–Vis分光光度计（UV-2450，Shimadzu，日本）在515 nm处测量样品溶液的吸光度，丁基羟基茴香醚（BHA）作为阳性对照。抗氧化活性（%）的计算公式为：
**DPPH自由基清除活性（%）= (Ac−−As)/Ac × 100**
其中，Ac为样品在515 nm处的吸光度，Ac′为无样品时的吸光度。**金属螯合活性**
根据Nazir等人的方法（Nazir等人，2024年），评估了样品的金属螯合能力以确定其抗氧化能力。取每个样品（1mL），与0.1 mL氯化亚铁（2mM）和3.7 mL甲醇（80%）混合，并涡旋约6分钟。向混合物中加入0.2 mL铁氰化物以启动反应，然后孵育10分钟。使用UV-2450分光光度计（Shimadzu，日本）在562 nm处测量最终混合物的吸光度。丁基羟基甲苯（BHT）被用作阳性标准品。金属螯合百分比通过以下公式计算：
**%螯合活性 = (Ac − As) / Ac × 100**
其中，**Ac**为样品在562 nm处的吸光度，**As**为对照组在562 nm处的吸光度。
**抗菌活性**
使用圆盘扩散法（Jhan等人，2022年）评估了样品提取物的抗菌活性。使用了两种细菌菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）来评估抗菌活性。简要来说，将0.1 mL细菌细胞悬浮液（密度为100–110 CFU/mL）接种在营养琼脂上。使用一个抗生素圆盘和两个无菌圆盘进行实验。将50 μL样品提取物涂在无菌圆盘上，另一个圆盘保持未处理状态。培养皿在37°C下孵育24小时。孵育期结束后，以毫米（mm）为单位测量抑制圈的大小。
**统计分析**
数据使用统计软件包（SPSS，Inc，芝加哥，IL，美国）进行分析。实验重复三次（n=3），结果以平均值±标准差表示。使用方差分析（ANOVA）和Duncans事后检验确定显著差异。差异在p≤0.05时被认为是统计学上显著的。
**结果与讨论**
3.1 **扫描电子显微镜**
图1显示了嵌入α-生育酚纳米纤维的小米蛋白的地形图像。纳米纤维呈随机分布，形态光滑均匀。未发现纤维中形成珠状结构。负载α-生育酚的纳米纤维的平均直径分别为PeTN 347.48 nm、FxTN 273.9 nm和PrTN 250.20 nm。纳米纤维的形态特性和直径主要受电纺溶液的电导率、表面张力和粘度的影响（Bhardwaj和Kundu，2010年）。通过施加电压使聚合物溶液拉伸，从而产生不同直径的纳米纤维。一些细纤维具有较窄的直径，某些小纤维与相邻纤维形成交联，形成连续的支架。向蛋白质溶液中添加α-生育酚可能增强了结合力和粘度，从而成功制备纳米纤维（Mishra等人，2024年）。
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图1. 珍珠小米（PeTN）、狐尾小米（FxTN）和普通小米（PrTN）负载α-生育酚的纳米蛋白的表面地形图像和直径分布。数据使用Origin 8.5软件（Origin Lab corporation，美国）绘制。
3.2 **衰减全反射红外光谱（FTIR）**
红外光谱用于确认α-生育酚在电纺小米纳米纤维中的封装情况，并研究生物活性成分与纤维壁之间的潜在相互作用，如图2所示。α-生育酚的光谱在3500、2927和2868 cm−1处显示出吸收带，分别对应于–OH、CH2和CH3。此外，在1461 cm−1、1460 cm−1、1378 cm−1、1262 cm−1、1086 cm−1、919 cm−1处的吸收带分别表示苯骨架、甲基弯曲（不对称）、甲基弯曲（对称）、CH2、苯平面弯曲和trans=CH2伸缩（Man等人，2005年）。纯PVA的ATR-FTIR光谱显示主要吸收峰位于3320 cm−1（OH）、2940 cm−1（CH2）、1430 cm−1（CH-OH）、1736 cm−1（C-O）、1090 cm−1（C-O）和850 cm−1（C-C）（Charernsriwilaiwat等人，2010年）。天然小米蛋白的FTIR光谱在3400（酰胺A）、1550（酰胺I）、1200和900 cm−1处显示出明显的官能团（Jhan等人，2022年）。所有三个样品的纳米纤维垫均显示出所有特征吸收峰，表明存在蛋白质、PVA和α-生育酚。光谱带中没有观察到化学键的显著变化或位移。仅在3000-3600 cm-1附近发现宽化，这可能是由于纳米纤维之间形成了氢键（Chen等人，2007年）。
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图2. 纯α-生育酚（T）、聚乙烯醇（PVA）、珍珠小米（PeTN）、普通小米（PrTN）和狐尾小米（FxTN）负载α-生育酚的蛋白质纳米纤维的结构解析。数据使用Origin 8.5软件（Origin Lab corporation，美国）绘制。
3.3 **封装效率**
α-生育酚在基于小米蛋白的纳米纤维中的保留率分别为PeTN 78.98%、FxTN 80.32%和PrTN 83.09%。每个样品的总体封装效率存在显著差异（p ≤ 0.05）。可能的原因是维生素E在蛋白质溶液中的高溶解度。静电作用、疏水相互作用和氢键在将维生素E保持在蛋白质纳米纤维基质中起着重要作用。先前的研究也显示了类似的维生素E在玉米蛋白粉纳米纤维中的封装效率（Mishra等人，2024年）。
3.4 **维生素E在模拟胃条件下的释放行为**
使用模拟胃条件评估了维生素E从纳米纤维中的释放情况（图3）。根据消化各阶段的吸光度数据计算累积药物释放百分比。在模拟口腔条件下，α-生育酚从小米纳米纤维中的释放量在最初5分钟约为PeTN 1.2 ug/mL、FxTN 2 ug/mL和PrTN 1.4 ug/mL。原因可能是α-生育酚完全被纳米纤维基质包裹，表面维生素E含量低。口腔内的pH值（7.2）可能无法破坏纳米纤维结构，导致维生素释放量较少。在模拟胃条件下，前30分钟内，PeTN、FxTN和PrTN的释放量分别为16、17和15 ug/mL。然而，在接下来的一个小时内观察到缓慢释放，这可能是由于pH值降低导致纳米纤维膨胀。因此，封装的α-生育酚被保留在纤维基质内，防止其降解（Cheow等人，2014年）。纳米纤维的三维网络吸收水分，从而逐渐释放生物活性成分（Follain等人，2005年）。然而，在模拟肠道条件下，随着时间的推移，α-生育酚的释放量显著增加，即30分钟、60分钟和120分钟，这可能是由于酰胺键断裂导致其水解。此外，在肠道pH条件下，pH值的变化导致纳米纤维解离，维生素E的释放量增加（Noor等人，2018年）。
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图3. 普通小米（PrTN）、狐尾小米（FxTN）和珍珠小米（PeTN）纳米纤维中α-生育酚的体外释放曲线。数据使用Origin 8.5软件（Origin Lab corporation，美国）绘制。
3.5 **α-生育酚负载蛋白质纳米纤维的生物活性**
3.5.1 **α-生育酚负载蛋白质纳米纤维的抗氧化活性**
在模拟胃条件下，α-生育酚负载蛋白质纳米纤维的抗氧化活性存在显著差异（p ≤ 0.05），如表1所示。DPPH和金属螯合活性的抗氧化活性表明，自由形式的α-生育酚在模拟胃肠条件下活性显著降低。对于α-生育酚负载蛋白质纳米纤维，DPPH抑制活性分别为PeTN 68.03%、FxTN 59.94%和PrTN 72.87%。α-生育酚是一种重要的维生素，通过作为强效抗氧化剂抑制自由基来维持人体健康（Luo等人，2011年）。研究表明，与自由形式相比，α-生育酚的抗氧化活性在纳米纤维中得到了很好的保留。高抗氧化活性也可能与纳米纤维的大表面积有关，这保护了α-生育酚的生物活性，使其更容易被DPPH吸收。另一项研究报告称，含有α-生育酚的聚己内酯纳米纤维具有高抗氧化活性（10-96%）（Aytac和Uyar，2016年）。
表1. 模拟体外消化过程中纳米纤维对α-生育酚抗氧化活性保留的影响。
| 序号 | 抗氧化活性测试 | α-生育酚（WSGID） | α-生育酚（SGID） | PeTN | PrTN | FxTN |
|------|-----------|-------------|-----------|--------|--------|
| 1 | DPPH抑制活性（%） | 92.34±0.21a | 39.21±0.14e | 63.03±0.11c | 59.94±0.20d |
| 2 | 金属螯合活性（%） | 90.23±0.19a | 33.87±0.09d | 49.32±0.05c | 55.78±0.20b |
表中数值为平均值±标准差（n=3）。同一行中不同上标的平均值在p ≤ 0.05时具有显著差异（Duncans检验）。PeTN、FxTN和PrTN分别代表珍珠小米、普通小米和狐尾小米负载的α-生育酚蛋白质纳米纤维。α-生育酚WSGID表示模拟胃肠条件前的天然自由α-生育酚，α-生育酚SGID表示模拟胃肠条件后的天然自由儿茶素。
3.5.2 **α-生育酚负载蛋白质纳米纤维的抗菌活性**
在模拟胃条件下，评估了α-生育酚负载蛋白质纳米纤维对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌活性。参考图像见图4。结果表明，所有样品在模拟消化条件下均显示出显著的抑制区（p ≤ 0.05），表明负载α-生育酚的纳米纤维的生物活性得到了很好的保留（表2）。样品的杀菌效果可能是由于α-生育酚的存在（Naguib和Valvano，2018年）。α-生育酚的亲脂性质导致细菌细胞膜破坏，从而降低膜电位，引起细胞色素C、蛋白质、离子和自由基的泄漏，导致质子泵崩溃和细胞内ATP水平下降（Tintin等人，2016年）。
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图4. α-生育酚负载蛋白质纳米纤维对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗菌活性抑制区（代表性图像）。
表2. α-生育酚负载小米蛋白质纳米纤维的抗菌活性。
| 序号 | 病原体 | 抑制区（mm） |
|------|-----------|-----------|
| 1 | 大肠杆菌（Escherchia coli） | 4.2±0.01d |
| 2 | 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） | 2.78±0.03d | 1.0±0.14a | 4.09±0.07c |
表中数值为平均值±标准差（n=3）。同一行中不同上标的平均值在p ≤ 0.05时具有显著差异（Duncans检验）。PeTN、FxTN和PrTN分别代表珍珠小米、普通小米和狐尾小米负载的α-生育酚蛋白质纳米纤维。
**4. 结论**
成功开发了负载α-生育酚的基于小米蛋白的电纺纳米纤维。所开发的纳米纤维具有光滑均匀的形态，直径在纳米范围内。在模拟胃条件下的体外释放行为表明，基于小米的纳米纤维可以作为有前景的药物载体和递送系统。纳米纤维的生物活性评估表明，α-生育酚在恶劣胃条件下的中性药物特性得到了保留。与已报道的玉米蛋白和花生蛋白分离物纳米纤维相比，小米蛋白品种由于两亲性醇溶蛋白的性质和二硫键交联，表现出更好的封装效率。因此，值得强调的是，小米蛋白纳米纤维可以作为生物活性物质或亲脂化合物的壁材料。观察到的特性，如封装效率、成本效益、环保性和纯素性质，使其在未来的功能性食品和生物医学应用中具有可持续性。然而，仍需在未来研究中解决一些限制，如纳米纤维技术在工业规模上的放大、小米蛋白中的抗营养素（单宁/植酸）以及体内有效性等问题，以验证这项技术。
**伦理声明**
“本研究未涉及任何人类参与者或动物，因此不需要伦理批准。”
**作者贡献声明**
Faiza Jhan：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、方法学、资金获取、概念化。
Adil Gani：监督。
