吕丹|陈世尧|罗瑶玉|李旭芳|普拉萨特·莱卡纳|韩佳琪|鲜俊荣|李凡凡|何梦洲|范瑶|徐和泽|周琼|李伟|刘莉|林兴光|沈先涛|叶芳|邓东瑞
华中科技大学同济医学院同济医院妇产科
**摘要**
**目的** 本研究旨在探讨特定孕期的双酚暴露与早产（PTB）之间的关联，并探索潜在的机制。
**方法** 在同济精准出生队列（TPBC）中，使用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术测定了十种双酚的浓度。通过多变量逻辑回归模型分析特定孕期尿液中双酚暴露与自发性早产（sPTB）之间的关联。通过免疫组化技术评估胎盘中的白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达情况。以双酚A（BPA）和BPF的尿液中位浓度作为指导，进行体外实验。将HTR8和BeWo滋养层细胞系暴露于不同浓度的BPA和BPF中。使用RT-qPCR技术检测NF-κB通路相关基因的mRNA水平。
**结果** 在分析的双酚中，BPF是最常见的BPA替代物。胎盘中的BPA和尿液中的BPF与自发性早产风险相关。胎盘BPA浓度每增加一个标准差，自发性早产的风险增加38.1%（95% CI：1.023–1.866，p = 0.035）。自发性早产时，胎盘中的IL-6和TNF-α表达增加。在滋养层细胞中，低至中等浓度的BPA和BPF可能上调NF-κB通路相关基因和某些炎症标志物。
**结论** 怀孕期间接触双酚，尤其是BPA和BPF，可能与自发性早产风险增加有关。研究结果进一步表明NF-κB通路相关的胎盘炎症信号通路可能起作用。
**1. 引言**
早产（PTB）定义为妊娠37周之前的出生，是新生儿死亡的主要原因，也是5岁以下儿童死亡的第二大原因（WHO，1977；Ohuma等，2023）。这是一种病因、病理生理和临床表现复杂的综合征。由于其多因素性质，针对单一因素或病理过程的干预往往效果有限。早产导致的高发病率、死亡率和残疾给家庭带来巨大心理和经济负担，并对社会构成重大挑战。最新全球数据显示，2020年早产率为9.9%，而2010年为9.8%，表明过去十年全球范围内变化不大（Ohuma等，2023）。然而，地区间早产负担的持续存在以及对环境风险因素的日益关注，凸显了更好地了解可改变的早产因素的必要性。中国“70年妇女生殖、孕产妇、新生儿和青少年健康委员会”（Qiao等，2021）明确指出早产是实现“健康中国2030”目标的主要挑战之一。
近年来，环境因素因其可改变性而受到广泛关注。《多哈宣言》（Hanson和Gluckman，2014）强调有害环境暴露会对短期和长期健康结果产生持久影响。越来越多的证据表明，接触双酚等增塑剂可能显著增加早产风险（Patel等，2014；Weinberger等，2014；Zhang等，2021）。双酚是一类通过碳或硫原子连接两个羟基苯基的化合物，它们在生产和使用过程中会释放到环境中。双酚广泛应用于生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂等领域（Huang等，2012）。双酚A（BPA）是一种典型的内分泌干扰物，已引起全球关注。研究表明，双酚可通过呼吸系统和消化系统等途径被吸收（Geens等，2009；Zhang等，2020；Liu等，2021；Arnold等，2013）。因此，生物监测和毒理学研究对临床和公共卫生具有重要意义。
几年前首次报道了BPA暴露与早产之间的潜在联系（Wolff等，2008）。在BPA受到监管后（Draisci，2011；Lambré等，2023），关于双酚替代品（如双酚S（BPS）的研究开始出现（Wan等，2018）。然而，不同研究之间关于双酚暴露与早产关系的结果并不一致（Wolff等，2008；Cantonwine等，2015），这可能是由于采样时间点、统计模型和结果定义的差异。早期研究主要关注二元结果；但早产是一种具有复杂病因和机制的多因素综合征。许多研究指出了基于妊娠年龄分类的局限性（Lv等，无日期；Kramer等，无日期）。Patel等（2014）和Cantonwine等（2015）等研究人员率先考虑将自发性早产、早产性胎膜早破（PPROM）和胎盘源性早产作为评估早产风险的临床分类指标。
胎盘作为母亲和胎儿之间的界面，在营养和气体交换中起关键作用，也可能成为环境污染物影响的靶点。母体血液通过螺旋动脉进入胎盘绒毛间隙，由绒毛外滋养层（EVT）重塑。妊娠第一个月时，母体血液直接接触被合胞滋养层（STB）覆盖的绒毛表面。滋养层细胞是胎盘中的主要细胞类型（Garcia-Flores等，2024），这些细胞的损伤会损害胎盘功能。环境因素的典型特征是诱导氧化应激，从而导致炎症（Peters等，2021）。转录核因子kB（NF-κB）是响应中的主要调控因子，驱动下游细胞因子和趋化因子的转录（Peters等，2021）。这可能导致胎盘功能障碍、血流改变以及胎儿营养和氧气供应不足（Salafia等，2024；Osman等，2024）。
在这项基于同济精准出生队列（TPBC）的前瞻性研究中，我们旨在探讨母体尿液和胎盘组织中测量的BPA及其替代品与早产（特别是自发性早产）之间的关联，并初步探讨双酚暴露是否与涉及NF-κB信号通路的胎盘炎症反应有关。
**2. 材料与方法**
**2.1. 参与者**
TPBC是一个始于2019年的前瞻性队列，随访同济医学院同济医院妇产科的妊娠情况。符合条件的参与者包括：1）年龄大于20岁；2）具备读写能力；3）超声检查显示宫内妊娠。参与者需提供书面知情同意书，并在每个孕期完成结构化问卷调查。同时鼓励他们在每个孕期提供尿液样本，分娩后立即收集胎盘组织。该研究获得了华中科技大学同济医院伦理委员会（TJ-IRB20191230，2019年12月27日）的批准。所有参与者均被告知研究目的、数据使用方式及参与风险。截至2023年6月，共招募了857名孕妇。
**2.2. 结果定义**
早产定义为妊娠37周之前的出生。早产类型分为自发性早产（sPTB）和医源性早产（iPTB）。由于临床进展中自发性早产和PPROM可能重叠，因此在主要分析中将两者合并以减少分类错误并提高统计效力。医源性早产指因母体或胎儿原因引起的早产，包括妊娠高血压综合征、胎儿窘迫、胎盘早剥和胎儿生长受限。足月分娩定义为妊娠37周及以上的出生。这些最终分析类别互斥。
**2.3. 协变量**
协变量根据既往文献和数据可用性预先选定。在多变量模型中，调整了母体年龄、种族、教育水平、妊娠方式、年收入、妊娠体重增加量和产次等因素。母体年龄分为<35岁和≥35岁。妊娠体重增加量作为连续变量处理。种族分为汉族和其他族裔。教育水平分为≤12年教育和≥12年教育。年收入分为<20万元和≥20万元。妊娠方式分为自然妊娠和辅助妊娠。产次分为初产和多产。
**2.4. 尿液样本和胎盘组织中双酚的检测与定量**
尽可能在每个孕期使用50毫升聚丙烯容器收集参与者的尿样。尿样分装后冷冻于-80°C以备后续分析。分娩后立即收集胎盘组织并测定双酚含量。总双酚浓度（游离态和结合态）采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS，Agilent 1260 Infinity III）进行测定。详细操作步骤见补充材料（表S1-2）。低于检测限（LOD）的值视为缺失；介于LOD和定量限（LOQ）之间的值在统计分析中用LOQ除以2的平方根替代。为提高研究结果的可靠性，采取了以下措施：1）所有样本由受过培训的人员处理，确保从采集到分装的时间内不超过4小时；2）同一人的所有样本使用相同的质谱仪器进行分析；3）虽然未独立验证，但先前的研究（Padmanabhan等，2008）表明双酚从容器泄漏到液体中的量小于0.5 ng/mL。
**2.5. 基于网络的毒理学分析**
为了系统评估复杂的生物学过程，整合了来自多个生物信息学来源的数据，包括ChEMBL（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）、STITCH（http://stitch.embl.de/）、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、MalaCards（https://www.malacards.org/）、DisGeNET（https://disgenet.com/）、Gene Ontology（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）。这种整合使我们能够绘制暴露-基因调控-通路激活-细胞表型-临床结果的网络图。
**2.6. 细胞培养与处理**
人类滋养层细胞系HTR-8/SVneo（武汉大学细胞收集中心）在RPMI-1640培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，添加10%胎牛血清（Cellmax，北京）和1%青霉素/链霉素（Servicebio，武汉）。人类绒毛膜癌细胞系BeWo（Procell，武汉）在Ham’s F-12营养混合培养基（Gibco，Thermo Fisher Scientific）中培养，添加12%胎牛血清（Cellmax）和1%青霉素/链霉素。细胞达到适当密度后，暴露于BPA（MedChemExpress，Monmouth Junction，美国）和BPF（Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国）的不同浓度下，分别持续24、48和72小时，培养基不含血清。暴露浓度参考了我们队列中观察到的双酚水平，旨在涵盖环境相关及更高暴露范围。选择50 nM和500 nM浓度以模拟人体生物监测中的实际水平，同时包括5 µM浓度以评估高剂量下的潜在效应。
**2.7. CCK-8细胞计数试剂盒检测**
根据制造商说明，使用CCK-8试剂盒（Abbkine，武汉）检测细胞增殖、毒性和活力。将HTR-8/SVneo细胞以每孔6×10^3个细胞的密度接种到96孔板中，在37°C、5% CO2培养箱中培养24小时。细胞贴壁并达到适当密度后，暴露于BPA和BPF的不同浓度下，分别持续24、48和72小时，培养基不含血清。BPA和BPF溶解在DMSO中，培养基中的最终DMSO浓度低于0.1%。对照组使用含有相同DMSO浓度的无血清培养基。处理后加入100 µL 10% CCK-8溶液，培养板在37°C下孵育30分钟（HTR-8/SVneo细胞）或2小时（BeWo细胞），然后使用TECAN平板读数仪（Männedorf，瑞士）在450 nm处测量吸光度。所有实验重复三次。
**2.8. 定量实时PCR**
使用裂解缓冲液（Vazyme，南京）从细胞培养板中提取总RNA，然后按照制造商说明进行逆转录生成cDNA。定量实时PCR在Quant Studio 7 Flex系统（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）上进行，使用SYBR Green（Vazyme，南京，中国）来分析IKBKB、RELA、TNF和IL-6。所有实验均重复三次。用于定量实时PCR的引物如下：IKBKB（正向：5’-GTCTTTGCACATCATTCGTGGG-3’ 和反向：5’-GTGCCGAAGCTCCAGTAGTC-3’），RELA（正向：5′-ATGTGGAGATCATTGAGCAGC-3’ 和反向：5′-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3’），TNF（正向：5′-CAAGGACAGCAGAGGACCAG-3’ 和反向：5′-GCCGTGGGTCAGTATGTGAG-3’），IL-6（正向：5′-CCACCGGGAACGAAAGAGAA-3’ 和反向：5′-GAGAAGGCAACTGGACCGAA-3’），以及ACTB（正向：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’ 和反向：5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’）。ACTB被用作内参以标准化mRNA表达水平。相对mRNA表达通过2−ΔΔCt方法确定。
2.9. 免疫组化（IHC）染色
胎盘组织用4%甲醛固定，脱水后包埋在石蜡中。切片切割、脱蜡、重新水化，然后使用链霉亲和素-过氧化物酶-生物素（SP）方法进行染色。用5% BSA封闭后，切片与一级抗体孵育过夜：抗TNF-α兔pAb（1:800稀释，Servicebio）和抗IL-6兔pAb（1:800稀释，Servicebio）。二级抗体在37°C下孵育60分钟。染色结果用二氨基联苯胺显示，然后用苏木精复染。棕色颗粒的存在被解释为阳性染色。使用ImageJ软件评估五个不重叠的区域。计算平均光密度（AOD）以评估蛋白质表达强度。
2.10. 统计分析
连续变量以平均值±标准差（SD）或中位数（四分位数范围，IQR）表示；分类变量以数量（百分比）表示。根据数据分布，使用参数或非参数检验进行组间比较。尿中双酚浓度的分布特征通过检测率（DR）、定量率（QR）、几何平均值和选定的百分位数进行总结。为了减少由于尿液稀释引起的测量误差，使用以下公式调整尿中双酚浓度：Pc=P × (SGTi-1)/(SG-1)，其中Pc是校正后的双酚浓度，P是未校正的浓度，SGTi是每个孕期的中位尿比重，SG是每个样本的比重（Wan等人，2018年；Cantonwine等人，2015年）。由于尿中双酚浓度呈右偏态，因此对其进行对数转换以进行回归分析。基于总体检测和定量性能（大于50%），BPA、BPB、BPF、BPS和BPZ被纳入主要尿相关分析（Zhang等人，2021年；You等人，2024年）。在评估尿中双酚暴露与sPTB关联的分析中，排除了iPTB病例，足月分娩作为参考组。使用多变量逻辑回归模型估计特定孕期的尿中双酚浓度与sPTB的关联。BPs进行对数转换并分为四分位数，最低四分位数作为参考组。通过将四分位数作为有序变量进行趋势检验。模型调整了母亲年龄、教育水平、种族、受孕方式、年家庭收入、妊娠体重增加和产次。由于一些协变量有缺失值，使用链式方程多重插补（MICE）处理缺失的协变量数据。共生成了20个插补数据集，每个数据集迭代10次（种子=1234）。sPTB和BPs以及用于趋势分析的有序变量未进行插补。在每个插补数据集中分别拟合逻辑回归模型，并使用Rubin规则获得汇总估计值。
对于胎盘分析，仅包括有可用胎盘样本的女性。排除iPTB病例后，使用逻辑回归模型检查胎盘BPA与sPTB的关联，以足月分娩作为参考组。胎盘BPA在回归分析中标准化为Z分数。
所有统计分析均使用SPSS版本26.0（IBM，美国阿蒙克）和R Studio（版本2024.12.0+467）进行。统计显著性定义为p值小于0.05。为了控制假阳性并提高多重比较的检测能力，使用Benjamini-Hochberg（BH）方法调整假发现率（FDR），显著性阈值设为q < 0.05（Glickman等人，2014年）。
3. 结果
3.1. 参与者的人口统计特征
共有857名孕妇前瞻性地参与了这项研究。他们的人口统计特征总结在表1中。平均母亲年龄为32岁（SD 4.0），186名参与者（21.7%）年龄在35岁或以上。大多数参与者（91.5%）为汉族，75.5%具有较高的教育水平。总体而言，164名女性（19.1%）经历了早产，包括78例早产（9.1%）和86例医源性早产（10.0%）。
表1. 857名参与者的 demographic 信息。
变量 平均值（SD）/ N (%)
母亲特征 年龄（岁） 32.0 (4.0) < 35 67 1 (78.3)
≥ 35 186 21.7
种族 汉族 78 4 (91.5) 其他 31 3.6
缺失 42 4.9
教育水平（年） ≤ 12 206 24.0 > 12 64 7 (75.5)
缺失 4 0.5%
年家庭收入（元） ≤ 200,000 445 51.9 > 200,000 286 14.7
妊娠体重增加（kg） 14.0 5.2
受孕方式 自然 68 7 (80.2) 辅助 170 19.8
产次 多次 30 2 (35.2) 无 55 64.8
妊娠结局 胎儿生长受限 否 82 7 (96.5) 是 30 3.5
早产 否 69 3 (80.9) 是 164 19.1
自发性早产 否 77 9 (90.8) 是 78 9.1
医源性早产 否 77 1 (90.0) 是 86 10.0
分娩方式 阴道 256 29.9 剖宫产 60 1 (70.1)
新生儿性别 男性 47 4 (55.3) 女性 38 3 (44.7)
注：自发性早产包括自发性早产劳动和PPROM。
3.2. 不同孕期的尿中BPs分布及其与早产的关联
图S1-3和表S3-S5展示了调整后的尿中双酚浓度在三个孕期的分布。为了描述目的，补充的箱形图根据妊娠年龄类别和PTB临床亚型展示了浓度。总体而言，尿中双酚浓度显示出显著的个体间变异性和右偏态分布；因此，在后续的回归分析中应用了对数转换。
图1显示了在排除iPTB病例后，不同孕期的尿中BPA、BPB、BPF、BPS和BPZ浓度与足月分娩作为参考组的关联。在第二孕期，BPF第三四分位数的女性（OR = 6.002，95% CI: 1.197, 30.110）的sPTB风险高于第一四分位数的女性。在其他孕期，未观察到其他双酚的显著关联。
3.3. 胎盘BP分布及其与sPTB的关联
在283个胎盘中检测到10种双酚，其中BPA的检测率最高（99.62%），其次是BPF（29.23%），表明BPF是胎盘中最常见的检测到的BPA类似物。分析主要集中在BPA上，因为其检测和定量率最高（表S6）。排除65例iPTB后，分析了剩余218个胎盘中的胎盘BPA水平，其中包括36例sPTB和182例足月分娩。自发性早产组的胎盘BPA中位数水平（1334.55 ng/g）高于足月分娩组（708.27 ng/g），尽管这种差异没有达到统计显著性（P = 0.146）。图表显示两组中都存在几个极端异常值（图S4）。为了确保数据分析的可靠性，移除了超出平均值±3个标准差的异常值，导致自发性早产组中排除了一例，足月分娩组中排除了五例。排除前后基线特征的分析显示两组之间没有显著差异（表S7）。
最终分析包括35例自发性早产和177例足月分娩。在母亲年龄、产次或其他基线特征方面没有观察到显著差异。逻辑回归分析表明胎盘BPA水平与自发性早产的风险有显著正相关。胎盘BPA每增加一个标准差，sPTB的风险增加38.1%（95% CI: 1.023, 1.866；P = 0.035）。
3.4. 基于网络的毒理学分析
鉴于尿液和胎盘组织中BPA和BPF的相对较高的检测和定量频率，以及它们与sPTB的观察到的关联，选择了这两种双酚进行进一步实验验证。第一步是识别相关的生物途径。从ChEMBL、STITCH和SwissTargetPrediction数据库中检索了7341个与BPA和BPF相关的基因。此外，从DISGENET和MalaCards中检索了2850个可能与早产相关的基因。其中，741个基因被交叉并使用Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）途径在R中进行进一步分析。GO分析中最富集的术语是“对外来物质刺激的反应”。因此，我们将KEGG分析集中在“环境信息处理”部分，其中VEGF、ErbB、TNF、FoxO和NF-κB等信号通路显著富集。鉴于早产主要被认为是由炎症驱动的，并且NF-κB通路在这方面已被广泛研究（Romero等人，2014年），我们旨在进一步探讨BPs是否通过NF-κB信号通路促进早产。
3.5. IL-6和TNF-α在胎盘组织上的定位和表达
IHC染色表明IL-6和TNF在胎盘绒毛上都有表达，并观察到棕色染色（图2A-B）。半定量分析平均光密度（AOD）显示，与对照组相比，sPTB组的IL-6和TNF-α表达水平显著更高（图2C-D）。
3.6. BPA和BPF处理后NF-κB通路相关基因的表达
如图3面板I所示，在HTR8细胞中暴露于BPA 24小时后，NFκB通路中的关键分子IKBKB和RELA的相对表达随着BPA和BPF浓度的增加而显著增加。TNF-α和IL-6的相对表达仅在50 nM浓度时显著升高。在48小时和72小时的暴露后，不同BPA浓度下的NFκB通路分子和TNF-α表达没有显著差异；然而，在48小时时，IL-6的表达在50 nM浓度时显著增加。对于BPF暴露（图3面板I），24小时时IKBKB和RELA的表达与BPA暴露时相似。然而，TNF-α的表达在0至500 nM浓度范围内显著增加，然后在5 μM时显著降低。在48小时和72小时时，不同BPF浓度下的NFκB通路分子和TNF-α表达没有显著差异，除了IL-6在48小时时在50 nM时升高，与BPA相似。
3.7. HTR8/SVneo和BeWo细胞中BPA和BPF处理后的IL-6和TNF-α的表达
如图3面板I所示，在HTR8细胞中暴露于50 nM浓度的BPA 24小时后，IKBKB的相对表达显著增加。在BeWo细胞中暴露于500 nM浓度的BPA 24小时后，IKBKB的相对表达显著增加。在BPF暴露（图3面板I）中，24小时时IKBKB和RELA的表达与BPA暴露时相似。然而，在50 nM浓度时TNF-α的表达显著增加。在48小时和72小时时，不同BPF浓度下的NFκB通路分子和TNF-α表达没有显著差异，除了IL-6在48小时时在50 nM时升高。
3.7. CCK8在HTR8/SVneo和BeWo细胞中的结果
如图4所示，在50 nM至5 μM浓度范围内暴露于BPA 24小时后，细胞活力没有显著变化。然而，在50 μM浓度下观察到明显的细胞活力下降，表明在这个较高剂量下具有显著的细胞毒性。在BeWo细胞中观察到的BPF暴露模式大致相似，除了在50 μM浓度下细胞活力相对较高，表明BPF在这个剂量下的细胞毒性相对较低。这些发现表明，根据我们队列中检测到的双酚水平选定的较低浓度并未显著损害细胞活力，因此适合进一步评估与炎症相关的反应。下载：下载高分辨率图像（330KB）下载：下载全尺寸图像图4. HTR8/SVneo（A和B）和BeWo（C和D）细胞系在暴露于不同浓度（50 nM、500 nM、5 μM和50 μM）的BPA（A和C）和BPF（B和D）24小时、48小时和72小时后的细胞活力。4. 讨论本研究揭示了与其他人群相比，BPA和BPF的浓度显著升高。三个孕期的BPA中位数浓度分别为11.72、15.62和17.55 ng/mL。对于BPF，中位数浓度分别为3.99、6.19和3.20 ng/mL。考虑到检测率和浓度，这些发现表明BPF是本研究中检测到的最常见的BPA替代物。我们还发现了BPA和BPF暴露与早产风险之间的显著关联。网络毒理学分析，结合早产儿中TNF-α和IL-6的胎盘表达上调，表明双酚暴露可能通过IBKBKB和RELA的上调激活NFκB信号通路。这与另一项研究结果一致，该研究发现BPF是最常见的BPA替代物（Yang等人，2021年）。此外，这些发现也与Veiga-Lopez等人（2015年）的研究结果一致，他们也报告了妊娠晚期BPA水平高于妊娠早期。Yang等人（2006年）在非职业暴露的韩国人群中进行的研究中，BPA的中位数浓度高达7.86 ng/mL。You等人（2024年）进行的一项涉及5696人的多暴露组研究显示，区域差异是影响暴露水平的最重要因素，不同地区的环境污染物积累情况不同。在我们的队列中，尿液中的BPA和BPF浓度通常高于先前发表的几项妊娠生物监测研究中的浓度（表S10），尽管由于采样年份和窗口期、研究人群、分析方法和暴露背景的差异，直接比较应谨慎对待。Weinberger等人（2014年）报告了72名有异常产科史和/或妊娠并发症的早产高风险孕妇的BPA水平范围较广，最高达到180.1 ng/mL。然而，Weinberger等人没有根据共病情况进行分层分析，我们推测在共病患者中BPA暴露可能更高。同样，Strømmen等人（2021年）报告了早产新生儿尿液中BPA的中位数浓度为11.3 ng/mL，这与本研究中观察到的孕妇BPA暴露水平一致，表明与早产相关的医源性治疗也可能导致BPA暴露。Aker等人（2019年）首次报道了妊娠期间BPF暴露及其与早产的关联。然而，由于检测率相对较低（44.2%）和暴露水平较低（中位数值为0.14 ng/mL），他们在分析中将BPF建模为二元变量（检测到/未检测到）。他们发现，在24-28周时检测到BPF与根据妊娠年龄分类的早产风险降低有关。表S10总结了关于妊娠期间BPs的研究。先前的研究并未一致观察到BPs与妊娠长度之间的显著关联。可能有几个因素解释了这些差异：1）采样点有限：BPs暴露可能有敏感的时间窗口。一些研究在分娩住院时收集尿液样本，这可能会引入选择偏差，并未能捕捉到特定孕期的影响。2）采样时间差异：如表S10所示，大多数研究是在2010年之前进行的。因此，本研究的贡献之一是提供了2019年至2023年间孕妇的BPs暴露数据。尽管这是一项单中心研究，可能限制了结果的普遍性，但它提供了关于妊娠期间最近暴露水平的初步数据。3）不同的暴露浓度可能产生不同的生物学效应：现实世界中的BPs暴露水平通常远低于毒理学实验中使用的浓度。许多用于BPA毒性研究的动物模型使用的浓度高达µM水平（Song等人，2020年），这表明需要更高的浓度才能观察到积极的毒性效应。相比之下，大多数现实世界的暴露水平在nM范围内。这种暴露浓度和方法学的差异可能解释了关于BPs暴露生物学效应的一致性缺乏。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种由免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞和成纤维细胞）分泌的促炎细胞因子。它在调节免疫反应、炎症和细胞凋亡中起核心作用。妊娠期间TNF-α水平升高与早产和胎盘功能不全有关（Dai等人，2022年；Tao等人，2024年）。同样，白细胞介素-6（IL-6）是一种参与免疫调节和炎症的多效细胞因子，也被发现与不良妊娠结局有关。动物研究表明，阻断IL-6受体可以预防早产（Farias-Jofre等人，2023年）。这一证据突显了炎症在塑造妊娠结局中的重要作用，并提出了潜在的治疗靶点以减轻不良出生事件。IHC结果显示这两种细胞因子在胎盘组织中均呈阳性表达，sPTB组的TNF-α和IL-6水平显著高于对照组，支持胎盘炎症在sPTB发病机制中的作用。此外，内分泌-免疫相互作用也可能相关。Fucic等人（2020年）报告了雌二醇水平与IL-6之间的显著关联，并提出在疑似外源性雌激素暴露的情况下，雌激素和IL-6之间的相互作用可能有助于免疫调节。鉴于BPA和BPF的内分泌干扰特性，这一观察结果提出了除了NF-κB激活之外，内分泌-炎症相互作用也可能参与双酚相关胎盘炎症的可能性。在我们的体外实验中，BPA和BPF在24小时急性暴露后显著上调了IBKBKB和RELA的表达，表明这些化合物通过经典的IBKBKB/RELA磷酸化级联激活NF-κB信号通路（Hayden和Ghosh，2012年）。TNF-α和IL-6的表达增加滞后于IBKBKB和RELA的上调，只有在浓度高于50 nM时才观察到显著变化，这与NFκB通路介导的细胞因子转录调节的特征动力学一致（Liu等人，2017年），进一步支持了这一信号通路的主导作用。暴露24小时后，低浓度的BPA和BPF（50–500 nM）激活了NFκB通路，由于BPF的亲脂性较高，其效应可能与BPA相似（Rochester和Bolden，2015年）。Lan等人报告称，100 nM-1μM的BPA暴露对HTR8细胞的增殖和死亡率没有显著影响（Lan等人，2017年）。然而，低至1 nM的BPA就能诱导胎盘外植体中β-hCG分泌和caspase-3表达的增加，表明非常低的BPA浓度就能破坏功能性蛋白质，从而先于细胞活力的变化。这一观察结果与我们的研究结果一致。Benachour等人（2009年）发现，0.88至876 nM的BPA暴露引发了细胞凋亡（M30测定）、坏死（腺苷激酶测定）和TNF-α mRNA的增加。然而，在≥2 μg/mL的浓度下，观察到细胞凋亡稳定和坏死减少，表明较高浓度可能触发未知的补偿机制。24小时后，尽管NF-κB通路分子的表达下降，但在BPF暴露48小时后IL-6仍然升高，表明炎症细胞因子的释放可能存在正反馈调节（Lawrence，2009年）。相比之下，BPA的炎症效应在同一暴露持续时间后逐渐减弱，表明作为BPA替代物的BPF可能通过其他不同的机制延长炎症反应的持续时间。这种差异可能归因于BPF的代谢速率更快或诱导了适应性应激反应（Eladak等人，2015年）。总之，BPA及其替代物BPF对滋养层细胞表现出潜在的时间、剂量和细胞类型依赖性的细胞毒性效应。BPF暴露引起的持续炎症反应值得进一步研究其作用机制。本研究的一个主要优势是将流行病学关联与初步实验验证相结合，旨在识别与环境相关的双酚暴露与不良妊娠结局相关的生物标志物。然而，必须解决几个限制：1）提供所有三个孕期连续尿样样本的参与者数量有限，这排除了重复测量分析的可能性。此外，由于内分泌干扰化学物质可能具有性别特异性生物学效应，未来需要更大样本量的研究来进一步评估产前双酚暴露与早产相关结局之间的潜在性别特异性关联。2）由于双酚是非持久性化学物质，尿样可能无法完全捕捉长期暴露情况，即使进行了特定孕期的采样和比重调整，也可能导致暴露分类错误。此外，测量的双酚浓度代表了总浓度，包括游离形式和结合形式。这种分析方法无法区分未结合和结合的双酚物种，因此可能高估了生物活性的游离部分。未来需要结合游离和结合双酚的形态分析的研究来提高机制的可解释性。3）孕妇通常还会暴露于许多其他化学物质，如其他增塑剂、持久性有机污染物和非持久性有机污染物；因此，我们的双酚重点分析可能未能完全捕捉到可能的混合效应。4）此外，本研究中的机制证据主要依赖于mRNA表达变化和下游炎症标志物，而没有直接验证NF-κB通路的蛋白质水平或功能。5. 结论在这项前瞻性队列研究中，我们发现BPA及其主要替代物BPF的暴露普遍存在，并与sPTB的风险增加有关。我们的初步机制发现表明，BPA和BPF可能通过TNF-α、IL-6和NF-κB信号通路参与胎盘炎症反应。通过整合生物监测、网络毒理学和细胞测定，本研究支持双酚在sPTB中的潜在作用。我们的发现强调了监测新兴双酚替代物（如BPF）的重要性，并支持持续努力减少妊娠期间的环境BPA暴露。未来需要结合更广泛的化学暴露评估和更先进的机制模型（如胎盘类器官）的研究，以进一步阐明潜在的生物学途径。致谢作者贡献声明周琼：验证、资源。吕丹：撰写——原始草稿、可视化、软件、方法学、调查、正式分析、概念化。李伟：验证、资源。陈世尧：撰写——原始草稿、可视化、软件、方法学、调查、正式分析。刘莉：监督、数据管理。罗瑶玉：撰写——审阅与编辑、验证、资源。林星光：验证、资源。李旭芳：调查、概念化。李凡凡：验证、资源。何梦洲：验证、资源。范瑶：验证、资源。徐和泽：验证、资源。沈贤涛：监督、数据管理。Leakana Praseth：验证、资源。韩家琪：验证、资源。叶芳：验证、监督、项目管理、方法学、正式分析、数据管理、概念化。邓东瑞：撰写——审阅与编辑、验证、监督、项目管理、概念化。鲜俊荣：验证、资源。资助这项工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号81873843）、中国“十二五”期间国家科技支柱计划（项目编号2014BAI05B05）、中央高校基本科研业务费（项目编号2017KFYXJJ102和2019KFYXKJC053）、新疆维吾尔自治区自然科学基金（项目编号2024D01A01）以及海南省自然科学基金（项目编号824MS166）的支持。
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