背景与目的：血管内皮功能障碍，特别是内皮高通透性，是多种炎症性血管疾病（包括动脉粥样硬化、血管炎和脓毒症）中的关键病理过程。烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide, NMN)作为一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)的前体，在临床前模型中已显示出抗炎和血管保护作用。然而，NMN抵抗巨噬细胞来源的炎症刺激以维持内皮屏障完整性的机制尚不清楚。本研究旨在探讨NMN在促炎性巨噬细胞诱导的内皮高通透性中的潜在保护作用。
方法：研究构建了人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)与M1巨噬细胞的三维共培养模型，以模拟炎症性血管微环境。通过测量荧光标记的葡聚糖和低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL)从细胞培养小室顶端到基底侧的通过量来评估内皮通透性。
结果：与M1巨噬细胞共培养会增加HUVECs的通透性，而NMN预处理可减轻这种高通透性。机制分析表明，M1巨噬细胞释放的白细胞介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)是导致内皮高通透性的主要原因。NMN通过抑制核因子κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)信号通路的激活，从而抑制IL-1β诱导的HUVECs细胞间缝隙形成和VE-cadherin降解。这些发现表明，NMN可防止IL-1β诱导的NF-κB激活及随后的VE-cadherin降解，从而保护内皮细胞免受因细胞间缝隙形成导致的高通透性。其他NAD+前体，包括烟酰胺核苷(Nicotinamide riboside, NR)，同样可防止IL-1β诱导的高通透性和VE-cadherin降解。相反，使用NAD+依赖性去乙酰化酶Sirtuin 1 (SIRT1)抑制剂EX527或SIRT1小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)敲低，可消除NMN介导的对高通透性和VE-cadherin降解的抑制作用。因此，NMN对IL-1β介导的内皮功能障碍的保护作用依赖于NAD+-SIRT1轴。
结论：这项体外机制研究表明，NAD+-SIRT1轴参与了IL-1β诱导的内皮屏障破坏，支持了对NMN在炎症性血管疾病中进行进一步研究。
一、 研究背景、问题与研究动机
血管内皮功能障碍，特别是内皮通透性增加，是动脉粥样硬化、血管炎、脓毒症相关血管渗漏等多种炎症性血管疾病共同的基础病理过程。健康的血管内皮屏障能够严格调控溶质、大分子和免疫细胞在循环血液与周围组织之间的选择性迁移，从而维持血管稳态。内皮屏障完整性受损会导致血管过度渗漏、炎性细胞浸润和组织损伤，促进疾病的发生发展。在动脉粥样硬化中，内皮高通透性允许低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL)等成分渗入血管壁，触发氧化应激、单核细胞募集和巨噬细胞激活，是斑块形成的初始关键步骤。活化的巨噬细胞可极化为促炎的M1表型，分泌包括白细胞介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)在内的促炎细胞因子，进一步加剧血管炎症和内皮功能障碍。血管内皮钙黏蛋白(Vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)是维持内皮细胞间粘附和血管完整性的关键蛋白，其降解是导致内皮屏障破坏、通透性增加的重要机制。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)是一种参与细胞代谢过程的关键辅酶，其消耗与多种心血管疾病相关。通过补充NAD+前体来恢复NAD+水平，被视为改善内皮功能障碍的潜在策略。烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide, NMN)是重要的NAD+生物合成中间体，在临床前研究中显示出血管保护和抗炎作用。然而，NMN如何保护内皮屏障完整性以抵抗巨噬细胞来源的炎症刺激，其具体分子机制尚不完全清楚。为了阐明这一机制，研究人员开展了本研究，相关成果发表在《Frontiers in Cardiovascular Medicine》期刊上。本研究的意义在于揭示了NMN在炎症性血管疾病中保护内皮屏障的新机制，为靶向NAD+-SIRT1轴的干预策略提供了理论依据。
二、 主要关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：
- 1.
细胞共培养模型：构建了人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导分化的M1巨噬细胞之间的三维共培养模型，模拟炎症血管微环境。
- 2.
内皮通透性评估：通过测量荧光标记的70 kDa葡聚糖和500 kDa LDL从培养小室顶端向基底侧的跨内皮通量，定量评估内皮单层通透性。
- 3.
分子生物学技术：使用实时定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction, qPCR)检测基因表达，酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞因子水平，蛋白质印迹(Western blot)检测蛋白表达，免疫荧光染色观察蛋白定位和细胞骨架。
- 4.
药理学与基因干预：使用SIRT1特异性抑制剂EX527进行药理学阻断，以及利用小干扰RNA (siRNA)转染技术敲低HUVECs中的SIRT1基因表达，验证特定信号通路的作用。
- 5.
NAD+定量：使用商业试剂盒检测细胞内NAD+水平。
三、 研究结果
NMN减轻了与M1巨噬细胞共培养诱导的HUVEC高通透性
研究人员成功构建了HUVEC与M1巨噬细胞共培养模型，并证实M1巨噬细胞可时间依赖性地增加HUVEC对70 kDa葡聚糖和500 kDa LDL的通透性。预先用NMN处理HUVEC 24小时，可显著抑制这种由M1巨噬细胞诱导的内皮高通透性。
NMN降低了M1巨噬细胞释放的IL-1β诱导的高通透性
ELISA检测显示M1巨噬细胞释放IL-1β和肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)。通过使用重组细胞因子和中和抗体的实验，研究人员确定在实验条件下，M1巨噬细胞释放的IL-1β是导致内皮高通透性的主要因素，而TNF-α的作用有限。NMN预处理能以剂量依赖的方式抑制重组IL-1β诱导的内皮高通透性。
NMN抑制了M1巨噬细胞释放的IL-1β诱导的缝隙形成和VE-cadherin降解
免疫荧光染色显示，M1巨噬细胞上清或重组IL-1β处理会导致HUVEC细胞间形成缝隙，而NMN预处理能显著抑制这种缝隙的形成。蛋白质印迹和免疫荧光染色结果进一步表明，IL-1β刺激会降低VE-cadherin蛋白水平并破坏其在细胞连接处的连续分布，而NMN预处理可防止IL-1β诱导的VE-cadherin降解和定位紊乱，但对VE-cadherin的mRNA水平无影响，提示NMN的作用在于抑制其蛋白降解而非影响其表达。
NMN通过抑制NF-κB激活来降低IL-1β诱导的高通透性
使用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(Pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)可抑制IL-1β诱导的内皮高通透性和VE-cadherin降解，表明NF-κB通路参与其中。机制上，NMN预处理可减少IL-1β刺激引起的NF-κB/p65核转位，并下调其下游靶基因血管细胞粘附分子-1 (Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、环氧合酶2 (Cyclooxygenase 2, COX2)、IL-6和IL-1β的mRNA表达。
NMN通过NAD+-SIRT1轴依赖机制抑制IL-1β诱导的VE-cadherin降解和高通透性
使用SIRT1抑制剂EX527或siRNA敲低SIRT1，可消除NMN对IL-1β诱导的内皮高通透性和VE-cadherin降解的保护作用，表明NMN的效应依赖于SIRT1。此外，其他能提升细胞内NAD+水平的前体物质，如烟酰胺核苷(NR)和还原型NMN (NMNH)，同样能抑制IL-1β诱导的内皮高通透性，且其保护效力与提升NAD+的能力正相关（NMNH > NMN = NR），进一步证实了NAD+-SIRT1轴的核心作用。
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四、 讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员将研究发现整合为一个机制模型：在血管炎症部位，M1巨噬细胞释放IL-1β，激活内皮细胞中的NF-κB通路，导致下游炎症因子表达上调，进而引起VE-cadherin降解、细胞连接破坏和内皮高通透性。NMN通过提升细胞内NAD+水平，增强SIRT1活性，SIRT1通过去乙酰化抑制NF-κB/p65的转录活性，从而维持VE-cadherin稳定性和内皮屏障功能。
研究也指出了本工作的几点局限性：使用了HUVECs而非疾病相关血管床的内皮细胞；共培养模型处于静态条件，未模拟血流剪切应力；需在疾病相关模型和体内系统中进一步验证。尽管如此，该研究为理解NMN在炎症条件下保护血管内皮的机制提供了重要见解。
研究结论：这项体外机制研究表明，NAD+-SIRT1轴参与了IL-1β诱导的内皮屏障破坏，支持了对NMN在炎症性血管疾病中进行进一步研究。
