禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）是雏鸡肠道屏障功能障碍和腹泻的主要诱因，给家禽产业造成显著经济损失。研究人员采用体内（雏鸡）与体外（IPEC-J2细胞）结合的研究策略，探究白术多糖（Polysaccharide from Atractylodes macrocephala Koidz.，PAMK）对APEC诱导肠损伤的保护效应及机制。体内实验显示，PAMK干预显著降低剖检评分，缓解生长迟滞，改善绒毛高度/隐窝深度比值及刷状缘高度；同时降低APEC诱导的杯状细胞计数升高，上调黏蛋白2（MUC-2）mRNA表达，增强化学屏障功能。此外，PAMK抑制空肠中促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α[TNF-α]、白细胞介素-1β[IL-1β]、白细胞介素-6[IL-6]）及孔形成紧密连接蛋白Claudin-2的mRNA表达。体外实验中，PAMK预处理可抑制APEC诱导的IPEC-J2细胞中TNF-α和Claudin-2的mRNA及蛋白水平上调，该效应与PI3K抑制剂LY294002的作用表型一致。机制层面，PAMK抑制APEC诱导的Akt及其下游靶点糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化，阻断PI3K/Akt/GSK-3β信号级联。免疫组化证实APEC感染增加绒毛顶膜区域Claudin-2蛋白丰度。综上，PAMK通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β通路下调Claudin-2表达，缓解APEC诱导的肠道屏障功能障碍，可作为改善家禽生产肠道健康的潜在饲用添加剂。
研究背景与意义
禽致病性大肠杆菌（APEC）感染引发的结肠杆菌病是家禽养殖中的主要疫病之一，可导致雏鸡严重肠道炎症、腹泻及生长迟滞，造成巨大经济损失。长期以来抗生素是防控的核心手段，但抗菌药物耐药性的上升与食品安全风险，使得开发高效、天然替抗产品成为行业迫切需求。肠道上皮屏障由紧密连接（Tight Junction，TJ）蛋白（如claudins、闭锁蛋白Occludin、闭锁小带蛋白Zonula Occludens，ZO）维持，是抵御APEC等肠道病原体的关键防线。其中Claudin-2作为孔形成蛋白，其表达上调会增加细胞旁通透性，直接介导“肠漏”与炎症性腹泻。尽管已知APEC会破坏紧密连接完整性，但其在禽类模型中驱动Claudin-2过表达的具体机制尚不清楚。白术多糖（PAMK）是传统中药白术的提取物，已被证实具有抗炎与免疫调节活性，前期研究显示其可能减轻肠损伤，但针对APEC的精确分子靶点与屏障保护机制尚未明确。近期研究提示PI3K/Akt/GSK-3β信号通路是调控肠道炎症与紧密连接动态的核心通路，其激活可在肠道感染期间促进包括Claudin-2在内的孔形成claudin表达。基于此，研究人员假设PAMK通过调控PI3K/Akt/GSK-3β通路抑制Claudin-2表达，从而保护肠道屏障。本研究发表于《Poultry Science》，旨在阐明PAMK的作用机制，为其作为可持续替抗产品应用于家禽生产提供科学依据。
主要技术方法
研究人员采用体内与体外结合的整合研究策略。体内实验选用40只5日龄白来航雏鸡（雌雄各半），随机分为对照组、模型组、PAMK组与黄芪多糖（APS）阳性对照组，构建APEC口服感染模型，评估PAMK对整体肠道健康与Claudin-2表达的影响。体外实验采用IPEC-J2猪小肠上皮细胞系，结合通路特异性药理抑制（PI3K抑制剂LY294002），在细胞水平解析下游信号机制。研究涵盖组织形态学分析、免疫组化、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验、免疫荧光与蛋白质免疫印迹等技术，从转录、蛋白与信号磷酸化层面系统验证PAMK的作用靶点。
研究结果
PAMK对APEC感染雏鸡整体健康状况的影响
APEC感染（模型组）较对照组显著降低体重（P<0.01）并提高剖检评分（P<0.05）。PAMK预处理虽未完全恢复体重（P>0.05），但显著降低剖检评分（P<0.05），缓解感染诱导的生长迟滞，黄芪多糖组观察到类似保护效应。
PAMK调控肠道形态与黏膜完整性
APEC感染在所有肠段诱发明显组织病理学损伤，表现为绒毛萎缩、隐窝破坏与炎性浸润，PAMK或APS干预显著改善上述病变。形态计量分析显示，APEC显著降低十二指肠与空肠的绒毛高度/隐窝深度（VH/CD）比值（P<0.05），PAMK与APS处理均显著逆转该下降（P<0.05）。刷状缘高度呈现相似规律，感染诱导的降低（P<0.05）被多糖处理显著改善（P<0.05）。淋巴细胞计数显示节段特异性效应：APS显著降低空肠、回肠与结肠的淋巴细胞浸润（P<0.05）；PAMK则呈现双向调节作用，降低结肠浸润（P<0.05）的同时增加十二指肠计数（P<0.05），后者可能反映黏膜免疫的招募与启动，而非有害炎症。
PAMK调控黏蛋白分泌与杯状细胞应答
AB-PAS染色显示APEC感染广泛激活肠道黏膜杯状细胞应答，模型组各肠段AB-PAS阳性细胞数量显著增加且染色加深（P<0.01）。PAMK与APS干预有效减弱该升高，维持黏膜稳态。节段特异性效应表现为：在十二指肠与回肠，两者均显著降低杯状细胞数至对照组水平（P<0.01）；在空肠与结肠，两者均显著抑制感染诱导的杯状细胞增殖（P<0.01），计数恢复至对照组水平（P<0.05）。
PAMK对雏鸡空肠Claudin-2、MUC-2及炎性细胞因子mRNA表达的影响
qPCR分析显示，APEC感染显著上调空肠促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达（P<0.05），PAMK预处理显著减弱该上调（P<0.05）。APEC感染同时显著增加孔形成紧密连接蛋白Claudin-2的mRNA表达（P<0.05），PAMK干预有效抑制该上调（P<0.05）。此外，APEC感染显著降低黏蛋白MUC-2的mRNA表达（P<0.05），PAMK处理后恢复至对照组水平（P<0.05），表明PAMK在转录水平增强化学屏障功能。
PAMK对IPEC-J2细胞活力的影响
CCK-8法检测显示，12小时处理时仅100μg/mL PAMK显著提高细胞活力（P<0.05）；24小时处理时50~200μg/mL PAMK呈浓度依赖性显著提升活力且无细胞毒性；48小时处理时无显著差异。基于活力>90%的标准，选择200μg/mL作用24小时用于后续实验。
PAMK抑制APEC诱导的IPEC-J2细胞TNF-α与Claudin-2表达
细胞经PAMK（200μg/mL，24小时）或LY294002（20μM，2小时）预处理后感染APEC（MOI=40，2小时）。qPCR结果显示APEC显著上调TNF-α与Claudin-2的mRNA表达（P<0.05），PAMK与LY294002预处理均抑制该升高（P<0.05），两组间无显著差异（P>0.05）。ELISA显示APEC增加TNF-α蛋白分泌（P<0.05），PAMK与LY294002均降低该水平（P<0.05），组间无差异。免疫荧光显示APEC增强细胞连接处Claudin-2荧光强度（P<0.05），该效应被两者减弱（P<0.05），组间无差异。
PAMK抑制APEC诱导的PI3K/Akt/GSK-3β通路激活与Claudin-2蛋白表达
Western blot结果显示，APEC感染显著触发Akt（Ser473 ，P<0.05；Thr308 ，P<0.05）及其下游靶点GSK-3β（P<0.05）的磷酸化，伴随Claudin-2蛋白显著上调（P<0.05）。PAMK预处理显著抑制p-Akt（Ser473 ）与p-GSK-3β的磷酸化，效应与LY294002相当（P>0.05），表明PAMK主要通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号级联调控Claudin-2表达。
PAMK对空肠Claudin-2定位与分布的影响
免疫组化显示APEC感染显著增加绒毛顶膜区域Claudin-2的定位（P<0.05）。PAMK处理较模型组呈现中等程度的Claudin-2蛋白丰度数值下降，但未达统计学显著性（P>0.05），提示在复杂的雏鸡肠道环境中，已建立的蛋白基质周转可能需要更长的干预周期。
讨论与结论
讨论部分指出，PAMK是多靶点保护剂，同步修复物理、化学与免疫屏障。其恢复肠道形态是第一道防线，更重要的是纠正了黏膜防御的无效代偿：APEC诱导杯状细胞增殖却抑制MUC-2转录，提示宿主试图通过快速招募杯状细胞应对黏膜损伤，但这些细胞可能处于未成熟状态，无法达到合成黏蛋白的功能容量；PAMK通过恢复MUC-2转录水平，确保化学屏障的功能性而非单纯数量增加。研究的核心突破是确定抑制孔形成蛋白Claudin-2是PAMK的关键机制，不同于封闭型紧密连接，Claudin-2促进细胞旁阳离子与水泄漏，是分泌性腹泻的标志。体外LY294002实验证实APEC诱导的TNF-α/Claudin-2激增依赖PI3K/Akt/GSK-3β级联，PAMK通过抑制该信号过度激活，削减Claudin-2转录，从而减轻“肠漏”综合征。体内Claudin-2 mRNA抑制与蛋白水平未显著下降的分离现象，可能源于成熟肠道上皮连接的肌动球蛋白细胞骨架稳定性高，现有蛋白基质周转缓慢，PAMK发挥的是“预防性加固”——在转录水平遏制新合成，防止屏障进一步降解，而非立即清除已有膜蛋白，IPEC-J2模型中的蛋白下调证实了分子机器的功能性，其在体内的显现可能被组织基质的周转动力学延迟。PAMK的节段特异性效应（增强十二指肠淋巴细胞招募、抑制结肠炎症）体现了中药多糖典型的“双向调节”，提示其并非简单抑制免疫系统，而是“启动”黏膜监视同时平息病理性过度炎症。研究同时指出局限性：需进一步探究Claudin-2的转录后动态与蛋白周转、明确杯状细胞的功能状态、补充直接通透性实验量化“渗漏途径”动力学，并在原代禽上皮细胞中验证机制以增强转化相关性。
研究结论
综上，PAMK通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，下调Claudin-2表达，恢复杯状细胞功能，增强肠道屏障完整性，有效缓解APEC诱导的雏鸡肠损伤。这些发现为PAMK改善家禽生产肠道健康、减少抗生素依赖提供了机制基础。
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