综述：生物催化技术的演进：从基础酶学到基于Antonio Ballesteros学术遗产的AI引导生物催化

在近五十年的时间里，Antonio Ballesteros在无机化学主导催化研究的背景下，推动并奠定了生物催化（Biocatalysis）的发展基石。从其早期关于酶调控与固定化的工作，到后期对非水相介质、半合成酶稳定化、脂解酶与碳水化合物活性酶、宏基因组（Metagenomics）酶挖掘及定向进化（Directed Evolution）的研究，他的科研轨迹与生物催化从基础酶学演变为可持续化工过程使能技术的成熟历程高度契合。本评述以其职业生涯为框架，追溯了该领域从单一酶控制到集成催化系统设计的理念演变。除具体技术进步外，他留下的核心遗产是一种平台化愿景，将酶本身、酶的稳定化与优化以及工艺设计整合于统一的连贯策略中。这种集成方法预见了当前宏基因组学、定向进化与人工智能（Artificial Intelligence, AI）辅助探索及酶序列空间设计在生物催化领域的融合。随着生物催化进入数据驱动设计、机器学习（Machine Learning）及循环生物经济（Circular Bioeconomy）应用的时代，当前的诸多挑战——如导航庞大的序列空间、预测酶功能以及为工业部署设计稳健催化剂——均可视为他数十年前确立原则的延伸。通过回顾其科研轨迹的关键阶段，本评述同时强调了围绕生物催化的主要研究主题如何随时间演变，从经典酶学到宏基因组发现、系统级生物催化及AI辅助酶设计。因此，他的遗产连接了酶学的基础与新兴的AI赋能生物催化未来。

1. 酶催化与可持续发展目标（SDGs）

人类面临着在地球边界内维持社会与技术发展的紧迫挑战。为此，联合国于2015年采纳了可持续发展目标（SDGs）作为全球框架，旨在推进更可持续、公平和富有韧性的未来。实现这些目标需要能够在降低环境影响的同时不损害经济社会进步的技术。在此背景下，催化过程因能以低能耗、低环境负荷和高资源效率实现高效化学转化而发挥核心作用。酶催化（Enzymatic Catalysis）因其高选择性、温和操作条件及对可再生原料的兼容性而具有显著优势。天然及工程酶以及细胞工厂介导的催化可直接或间接促进多项SDGs的实现。在SDG 2（零饥饿）框架下，生物催化系统通过工艺改进、废弃物减量及农业副产品增值支持可持续食品生产。针对SDGs 7（经济适用的清洁能源）和9（产业、创新和基础设施），酶与微生物催化实现了先进生物燃料和生物基能源载体的生产，并将有机废物转化为沼气等可再生能源。生物催化还通过支持城市和工业固体废物管理及增值助力SDG 11（可持续城市和社区）。在SDGs 12（负责任消费和生产）和14（水下生物）语境下，生物催化系统提供了持久性污染物（包括合成塑料）的降解路径，促进循环生产与消费模式并减轻环境污染。SDG 6（清洁饮水和卫生设施）可通过应用于废水处理和净化的酶与微生物过程得以推进。当与生物电化学系统或厌氧微生物平台结合时，废水处理可与可持续绿氢生产耦合，同时贡献于SDGs 6、7、9和13。与此同时，SDG 13（气候行动）受益于生物催化开发的低碳生物工艺及碳捕集、利用与封存策略，有助于减少温室气体排放。从社会经济角度看，分散且具有成本效益的生物催化技术支持SDGs 1（无贫穷）、8（体面工作和经济增长）和10（减少不平等），促进清洁水获取、本地食品加工及生物基商品生产。在健康与教育领域，酶催化通过可持续生产药物和诊断工具、改善水质以及开发更安全易用的工业和实验室工艺，贡献于SDGs 3（良好健康与福祉）、4（优质教育）和5（性别平等）。SDGs 15（陆地生物）和16（和平、正义与强大机构）同样受益于生物催化过程，特别是通过土壤修复、减少危险化学品使用以及开发生态可持续技术。最后，SDG 17（促进目标实现的伙伴关系）与生物催化本质契合，因为其进展依赖于学术界、工业界和政策利益相关者之间的紧密合作。酶催化的全部潜力取决于酶挖掘、表征和工程（Protein Engineering）的进步。全球挑战要求稳健的生物催化剂能够在苛刻的工业和环境条件下运行，并需要增强其性能、稳定性和功能范围的策略。尽管近期技术有所进步，但从挖掘到应用的整个链条中，识别、表征和部署最优生物催化剂的高效方法仍然有限。在此背景下，高级生物信息学、计算建模、人工智能（AI）和高性能计算（High-Performance Computing, HPC）的整合正成为酶催化演进的核心驱动力。现代生物催化日益依赖分析和整合海量异质数据的能力，这些数据涵盖基因组信息、蛋白质结构和功能测定，并将其转化为对新生物催化剂的机制洞察和预测设计。这些方法加速了酶和工程微生物系统的发现，降低了实验成本，并实现了更精确的工程和下游应用策略。近五十年生物催化的历史演进因此获得了新的相关性。从经典酶学到固定化系统，从非水相介质到利用可聚合深共熔凝胶稳定酶的新一代可生物降解聚合物，从天然酶到半合成及全合成酶，从碳水化合物生物催化到宏基因组发现，再到最近的AI驱动酶工程，这一进程不仅仅是技术进步的序列，而是逐步塑造了一个能够应对全球可持续性挑战的学科。这一轨迹反映了Antonio Ballesteros的科学旅程，他的工作始终连接着基础酶学和生物催化。理解这些基础性发展如何展开，对于理解现代生物催化如何成为SDGs的关键使能技术至关重要。

2. Antonio Ballesteros：生物催化的一生

A. Ballesteros（1940–2024）是将生物催化引入欧洲催化界的先驱之一。在获得化学和药学训练后，他在美国、英国、日本和德国的顶尖实验室工作了五年，随后于1969年在西班牙国家研究委员会（CSIC）的催化与石油化学研究所创建了首个生物催化小组。当时该研究所专注于多相无机催化，将酶视为真正催化剂并纳入同一技术框架的想法远非显而易见。自1969年起，A. Ballesteros建立了一个最终发展到约40名研究人员规模的部门，并担任了一系列领导职务：欧洲生物技术联合会（EFB）固定化生物催化与应用生物催化工作组的西班牙代表、EFB应用生物催化分会（ESAB）主席，以及《Biocatalysis and Biotransformation》的执行编辑及随后的主编。这些角色使他处于欧洲生物催化界的核心，正值固定化酶、非水相生物催化、蛋白质工程、宏基因组学以及随后的AI变革该领域之时。在他的整个职业生涯中，他的研究跨越多个领域，包括组氨酸操纵子研究、固定化核酸酶、氢化酶、脂肪酶和糖酰化、半合成酶、天然及修饰的固定化碳水化合物活性酶、通过糖苷酶和糖基转移酶制备益生元寡糖、用于生物修复的酶、抗氧化剂的酶法修饰、来自宏基因组文库的酶以及通过定向进化工程化的酶。这些研究方向与现代生物催化的连续“浪潮”相平行，涵盖了1970年代固定化酶的兴起、1980年代向非水相介质的拓展、2000年代定向进化与宏基因组学的巩固，以及最近生物催化在可持续化学和生物经济中的整合。尽管A. Ballesteros并未直接在AI领域工作，但他对严格功能表征、结构-功能关系以及集成酶-工艺优化的强调，为当今AI驱动的生物催化奠定了概念基础。

3. 基础：从操纵子酶学到固定化酶

3.1 早期酶学与调控

Ballesteros的科学生涯始于多相催化，但很快转向经典酶学和代谢调控。他的早期工作集中在沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和大肠杆菌（Escherichia coli）的组氨酸操纵子酶，特别关注ATP磷酸核糖基转移酶及控制组氨酸生物合成的反馈调控机制。这些研究植根于1960至1970年代分子生物学革命中对细菌基因调控和操纵子控制的更广泛分析。这一阶段使他处于基础酶学的中心，涵盖动力学、变构调控、四级结构以及利用光谱和热力学工具理解酶功能。重要的是，这种深刻的机制理解很快演变为对酶修饰和人工酶设计的兴趣，例如他对黄素基-木瓜蛋白酶物种作为新型“人工”酶的合成贡献，标志着从研究自然调控系统向工程化催化功能的早期转变。这项基础工作的意义远超其历史背景。对酶功能的深刻机制理解对于解释代谢调控、预测系统水平行为以及工程化稳健生物催化剂仍然至关重要。事实上，对催化参数、构象动态、调控机制和结构-功能关系的认知构成了现代酶挖掘、蛋白质工程和计算预测的概念支柱。然而，尽管经过数十年的生化研究，即使在特征明确的生物体中，酶注释仍存在大量空白，这凸显了我们对于酶功能及其对代谢网络贡献的理解尚不完整，同时也揭示了生物催化的巨大机遇。虽然当代方法日益依赖结构预测和AI来推断酶活性，但这些计算进展仍需严格的生化验证和定量功能测定。即使在当前高通量测序和AI时代，可靠的进展仍取决于对酶如何运作、如何响应环境变化以及如何整合入复杂代谢网络的实验性深入洞察。此外，当前正努力将单分子动力学和分子多样性与序列水平信息联系起来，进一步增强预测酶功能的能力。从这个意义上说，Ballesteros早期对严格功能表征的坚持预示了一个持续定义该领域的原理：生物催化的变革性进展最终依赖于对酶功能的精确定量理解。

3.2 固定化核酸酶与固定化生物催化剂的兴起

与日本1960年代末L-氨基酸酰化酶等工业相关固定化酶的发展并行，Ballesteros开启了对固定化核酸酶的长期研究。从1974年至1991年，他的团队研究了固定在琼脂糖及其他载体上的核酸酶，研究涵盖其制备、物理化学表征、扩散限制下的动力学以及在去除单细胞蛋白浓缩物中核酸的应用。他的工作解决了固定在琼脂糖上的核酸酶的制备与性质、载体活化（如溴化氰和对甲苯磺酰化）的影响以及有机溶剂对活性和稳定性的影响。在该领域的更广泛背景下，这一阶段恰逢固定化酶作为连续过程技术催化剂的巩固、载体结合和无载体系统的发展，以及考虑工艺限制的首次生物催化剂设计系统框架的建立。Ballesteros的工作是该时代的象征：它连接了基础动力学和面向工艺的表征，并且是基于一类并非典型工业水解酶但对食品和生物技术应用高度相关的酶（核酸酶）。自早期关于固定化酶的报道以来，该领域经历了深刻变革。最初作为一种提高操作稳定性和重复使用性的策略，现已发展为一门成熟的学科，其中固定化已成为生物催化过程强化的核心工具。固定化长期以来被认为是提高工业应用中酶稳定性、可回收性和操作稳健性的关键使能技术。当代方法现在利用共价有机框架等先进材料共固定化全细胞和酶，实现空间组织、更高的催化效率和集成系统中改善的可重用性。此外，现代策略远远超出了简单的载体结合。纳米结构载体、杂化材料和日益由AI辅助的数据驱动设计的整合，现在允许对酶取向、微环境和传质特性进行精细控制，有助于克服扩散限制和活性损失等经典局限。最近，基于深共熔体系和共熔凝胶的创新固定化基质为定制生物催化剂的物理化学微环境开辟了新途径。这些材料结合了溶剂和结构功能，提供了可调的极性、粘度、水活性和氢键网络，可在苛刻条件下增强酶的稳定性和活性。同时，超分子和杂化材料的进步，包括生物基聚合物、分级多孔载体和刺激响应基质，进一步扩展了固定化工具箱。对酶-载体相互作用理性设计的贡献，包括界面激活策略、多点共价附着和杂多功能载体，在将这些概念转化为稳健的工业生物催化剂方面发挥了关键作用。此外，酶超分子工程概念已成为超越传统固定化的有力策略。这种方法不仅仅是将酶锚定在固体载体上，而是侧重于理性设计和调节生物催化剂周围的纳米环境以调控其催化行为。通过在固定化酶周围设计合成壳和超分子基质，可以控制底物可及性、局部极性、水合水平和空间约束，从而在不改变蛋白质一级结构的情况下重塑催化选择性。例如，对混杂酶的超分子裁剪表明，仔细修饰周围纳米结构可以诱导对映选择性，同时保持广泛的底物范围并在有机溶剂中显著提高稳定性。此类策略说明纳米环境如何被工程化为一个额外的调控层，有效地将天然混杂酶转化为定制的纳米生物催化剂。在这种背景下，固定化不再仅仅是一种稳定技术，也是一个功能重编程的平台，材料科学、超分子化学和蛋白质工程在此交汇，为工业相关应用微调催化性能。由此可见，Ballesteros早期关于固定化核酸酶和扩散-反应体系的工作显得极具前瞻性。他强调理解传递现象、载体化学以及分子性质与生物催化剂性能之间的关系，预示了支撑当今先进固定化生物催化剂的概念框架。改变的不是基础原理，而是复杂程度：现代固定化策略完善并扩展了早已存在于他科学愿景中的理念。

4. 扩展工具箱：氢化酶、脂肪酶与非水相介质

4.1 氢化酶与生物能学生物催化

1976年至1990年间，Ballesteros团队广泛研究了来自固氮和非固氮微生物的氢化酶，包括大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）和莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）。他们的研究涉及氧化还原电位、催化产氢与耗氢、氧敏感性以及控制生物产氢热力学约束等基础物理化学和机制方面。在当时生物催化仍主要由用于合成和食品相关应用的水解酶主导的时期，这种对氢化酶的关注代表了向氧化还原酶和能源导向催化的有意拓展。历史上，1970年代末至1980年代初标志着该领域从主要将酶视为选择性水解工具向认识到其在电子转移和生物能过程中的潜力的过渡。尽管结构复杂且对环境条件敏感，氢化酶代表了分子水平上生物能量转化的潜力。Ballesteros的工作有助于形成这样一种认识：酶可以参与传统上与电化学和无机催化相关的过程，从而拓宽了生物催化的概念边界。在机制层面，氢化酶是最复杂的氧化还原酶类别之一。主要分为三种类型：[FeFe]-氢化酶、[NiFe]-氢化酶和[Fe]-氢化酶，每种在活性位点结构、催化偏向性和氧耐受性方面有所不同。[FeFe]-氢化酶通常表现出最高的可逆H₂转化周转频率，但对氧极度敏感，限制了其操作稳定性。相比之下，许多[NiFe]-氢化酶更为稳健，且通常偏向于H₂氧化，在微生物能量代谢中发挥核心作用。一个特别有前景的亚群，[NiFeSe]-氢化酶，结合了相对较高的催化效率和较低的产品抑制及部分氧耐受性，使其成为可持续H₂生产的有吸引力的候选者。然而，大多数氢化酶对O₂的内在敏感性，以及与辅因子成熟、电子转移耦合和整合到电化学系统相关的挑战，历来制约了其工业部署。现代策略旨在通过蛋白质工程、合成成熟途径、导电材料固定化以及整合到微生物电解池和生物燃料电池等生物电化学装置中来克服这些限制。这些努力说明了1980年代解决的基础物理化学问题——即氧化还原电位调节、催化可逆性、热力学效率和环境敏感性——仍然是开发基于氢化酶的绿色制氢和生物电催化技术的基础。尽管这一时期氢化酶的大规模工业应用有限，但获得的科学见解被证明是后续发展的基础。氢化酶目前在生物制氢、酶电催化、生物杂交光电化学系统和可持续能源转化技术研究中占据核心地位。工程化氢化酶和合成生物平台正在被探索用于绿色制氢、整合到电极界面以及与光捕获材料耦合。从这个意义上说，早期对氢化酶的机制探索预示了当前将酶学与可再生能源战略整合的努力。曾经属于探索性的研究路线，现已成为当代氧化还原生物催化的支柱，说明了关于酶热力学和电子转移的基础研究如何塑造长期技术轨迹。

4.2 脂肪酶、甘油三酯与酶在有机介质中的出现

从1980年代中期开始，Ballesteros越来越多地转向脂肪酶作为水解和合成的多功能催化剂。他与Francisco J. Plou等合作者一起研究了来自皱落假丝酵母（Candida rugosa）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）和疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的脂肪酶，重点关注复杂介质中的催化行为、表面活性剂效应、单甘酯和二甘酯及其他结构脂质以及糖的区域选择性酰化的合成。这些努力被置于“非水相介质中的生物催化”这一新兴概念框架内，包括胶束系统、油包水微乳液和低水有机环境。在酶仍主要与水性转化相关联的时代，证明脂肪酶可以在此类介质中保持活性，且在某些情况下表现出增强的选择性和稳定性，标志着合成生物催化的概念转折点。历史上，这一时期可被视为当今工业生物技术中最重要的酶家族之一的起源。如今，脂肪酶在基础研究和工业应用中仍占据核心地位。例如在工业应用和可持续性方面，脂肪酶被广泛用于通过温和条件下的甘油三酯酶促转酯化生产生物柴油，这是绿色化学替代大规模过程中苛刻化学催化的关键例证。它们还应用于食品脂质改性以及合成对映纯药物、化妆品、香料、营养保健品和可生物降解聚合物。脂肪酶的相关性并未减弱，反而在科学和工业上都得到了扩展，正日益被开发和定制用于循环生物经济过程和下一代绿色制造。Ballesteros积极参与欧洲研究网络及其关于非水相中酶的综述贡献，使他处于这一转型的中心。他的工作不仅描述了特定的工业相关工艺，包括涉及蔗糖脂肪酸酯和单油酰甘油的使用，还解决了关于酶适应非水环境、界面激活和操作稳健性的基本问题。通过关注基础现象和应用结果，他的研究帮助确立了脂肪酶作为能够在其自然栖息地之外发挥功能的模型生物催化剂。一个特别具有说明性的例子是证明了仅通过调整双溶剂体系中助溶剂的比例即可调节脂肪酶的区域选择性。在1999年的一项研究中，他与合作者表明，改变溶剂组成改变了蔗糖的区域选择性酰化模式，首次实现了用长链脂肪酸酰化这种高度官能化糖的次级羟基。这一发现表明，反应介质的微小变化可引起酶的微妙全局或活性位点构象调整，从而在没有遗传修饰的情况下调整底物定位和催化结果。这项工作预示了一个此后成为生物催化核心的概念：酶的选择性（区域选择性、化学选择性和甚至对映选择性）可以通过控制反应微环境的操纵来调节。如今，通过溶剂工程、水活度控制和介质效应调节选择性是脂肪酶研究和工业生物转化的关键策略，突显了这些早期研究的前瞻性。曾经通过经验手段实现的目标——调整溶剂组成、水活度或界面条件——如今正在完全不同的分辨率水平上被重新审视。早期观察到反应介质的细微变化可以改变区域选择性，指向了一个更深层的原理：催化结果不仅受一级序列支配，还受酶的全三维结构的几何和物理化学组织的支配，特别是活性位点及其周围的微环境。这些几何和物理化学约束现已成为现代生物催化机器学习的核心设计参数。计算蛋白质设计的近期突破说明了这一轨迹的进展程度。丝氨酸水解酶的经典催化三联体和氧阴离子洞长期以来在脂肪酶和酯酶中得到了研究，最近被用作从头构建具有可编程几何结构的人工酶的模板。通过沿着反应坐标明确模拟活性位点预组织并将催化基序嵌入新生成的蛋白质支架中，现已有可能设计出具有可测量催化效率和不同于其自然对应物的折叠的丝氨酸水解酶。这些研究表明，改变的不是催化的基本逻辑，而是我们能够审视和操纵它的规模和精度，现在允许对支持多种催化转化的合成酯酶和脂肪酶活性位点进行理性构建。如果A. Ballesteros的工作预示了酶可以在水环境之外运行，并通过仔细控制其周围环境适应工业环境，那么当前时代则将这一愿景扩展到分子和数字领域。同样的集成哲学——将基础酶学与技术应用于连接——继续塑造现代生物催化，现在的这种方法因AI、结构设计和系统级工程而更加丰富。从这个意义上说，从溶剂工程脂肪酶到AI引导的催化结构的轨迹，并不是对过去的断裂，而是他所帮助建立的概念框架的自然延续。

5. 稳定化、半合成酶与溶胶-凝胶生物催化剂

贯穿Ballesteros科学生涯的一个反复出现的主题，是与Francisco J. Plou密切合作开展的通过化学和基于材料的策略稳定和功能增强酶的研究。从1989年到2006年，半合成酶的制备成为他团队的核心研究路线。这一努力转化为对水解酶化学修饰的大量研究，包括枯草杆菌蛋白酶和脂肪酶的酰化和聚乙二醇化（PEGylation），以提高其在表面活性剂或有机溶剂等苛刻条件下的活性、热稳定性和操作稳健性。与此同时，Ballesteros探索了溶胶-凝胶封装和酶-聚合物纳米复合材料，将酶嵌入硅酸盐或杂化基质中以生成高度稳定的生物催化剂。1998年由Elsevier出版的《生物催化剂的稳定与稳定化》（Stability and Stabilization of Biocatalysts）一书巩固了酶稳定化的概念和实践方面，并成为该领域后续发展的参考框架。历史上，这项工作恰逢通过定向进化和理性诱变进行的蛋白质工程的兴起，正如Willem Stemmer和Frances H. Arnold的开创性研究所例证的那样。他们证明了酶可以通过定向进化和蛋白质工程进行适应，以在非水环境中运行并执行新的催化功能。虽然随后的主导范式强调遗传多样性和筛选，但Ballesteros追求了一条互补的路线：通过化学修饰和材料科学定制酶性能。他的半合成酶和溶胶-凝胶生物催化剂预示了这样一个理念：酶的功能不仅可以在序列水平上调节，还可以通过控制蛋白质表面和微环境的修饰来调节。这些策略的相关性在近年来变得更加明显。当代生物催化日益依赖将蛋白质工程与化学和基于材料的稳定化相结合的混合方法。现代例子包括设计用于增强溶剂耐受性的酶-聚合物偶联物、用于连续流催化的纳米结构封装系统，以及保护酶免受极端pH、温度或氧化条件影响的硅基生物杂化材料。同样，溶胶-凝胶衍生基质内的酶固定化已在生物传感器、电催化界面和环境修复技术的背景下重新兴起。PEG化和其他共价修饰现在不仅广泛用于工业酶，也用于治疗性蛋白质，以提高其半衰期和抗变性能力。在这种格局下，Ballesteros奠定的概念基础——即通过化学修饰和工程化微环境可以理性改善酶性能的理念——显得极具当代性。曾经被视为辅助手段的稳定化技术，现已被认为是多级酶优化的组成部分，补充了AI引导的序列设计和先进的蛋白质工程。