理解膜蛋白如何插入细胞膜并在其中折叠，是阐明多种疾病分子基础的核心，同时也支撑着生物技术领域的进展，包括针对蛋白质错误折叠疾病的疗法开发，以及提高膜蛋白高产表达的方法优化。在细胞中，几乎所有α-螺旋膜蛋白均以共翻译方式合成并插入膜中，随着新生肽链从核糖体延伸，折叠过程依次发生。该过程受到翻译机器施加的空间限制，且发生在具有复杂物理化学性质的膜环境中，与经典的全长纯化蛋白体外重折叠研究存在显著差异，凸显了改变实验策略以解析膜蛋白从头折叠机制的迫切需求。膜蛋白折叠的驱动机制仍不明确，主要归因于缺乏能够在实时及天然环境下探测这些过程的手段。本文讨论了近期在揭示膜蛋白合成与插入过程中折叠机制的研究进展，并重点介绍了已建立及新兴的生物物理与结构工具，这些工具正开始以比以往更高的机制细节解析共翻译事件。这些进展共同重塑了研究人员对膜蛋白生物发生的理解，远远超越了传统的重折叠模型。
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引言
膜蛋白约占所有蛋白质组的四分之一，且超过半数的现有药物靶点均为膜蛋白，但其折叠机制的理解远不及可溶性蛋白深入。对于α-螺旋整合膜蛋白而言，折叠并非翻译后事件：它始于新生链从核糖体共翻译延伸，结合转运体（translocon）并分配至脂质双分子层。翻译与折叠的偶联对新生链施加了独特限制：从向量式（N端到C端）合成、跨膜区段的顺序暴露，到充满分子伴侣与质量控制机器的拥挤界面。这些范式将共翻译膜蛋白生物发生与传统分离蛋白的重折叠场景区分开来，后者通常依赖重组表达。共翻译过程的紊乱是越来越多人类疾病的根源，并推动了开发能够挽救错误折叠变体的药理伴侣的研究兴趣。早期膜蛋白折叠概念模型为理解其稳定性提供了重要框架，最著名的是两阶段假说，该假说提出跨膜螺旋首先独立形成，随后侧向组装，同时热力学模型描述了其在水相、界面与烃环境中的分配规律。然而，这些模型主要基于完全合成、分离的蛋白的平衡重折叠实验，未能捕捉共翻译折叠的复杂性——在共翻译过程中，蛋白合成、转运与膜插入同步发生，多个动力学过程（包括螺旋插入、螺旋-螺旋堆积与新生链延伸）同时进行且必须紧密协调。这些速率的不平衡会导致错误折叠、聚集或动力学捕获的中间态。目前，研究人员仍缺乏对这些单个速率的直接测量，导致对共翻译膜蛋白折叠的机制理解存在重大缺口。全面理解需要定量测量单个跨膜螺旋的热力学稳定性，以及调控其合成过程中插入与组装的动力学参数。本综述聚焦于核糖体-转运体-双分子层界面的α-螺旋整合膜蛋白共翻译折叠，涵盖细菌与真核系统中转运体辅助整合的保守与分歧特征、共翻译折叠与平衡重折叠模型的差异、新兴定量研究方法，以及分子模拟对该领域的潜在贡献，最后讨论共翻译折叠机制模型对疾病理解的启示。
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背景
2.1 膜蛋白折叠基础
整合α-螺旋膜蛋白因含有疏水的跨膜结构域（TMD），必须靶向膜进行折叠，若释放至胞质则会错误折叠并聚集。经典的Popot与Engelman两阶段模型（1990年）及后续三阶段模型（2003年）指出：TMD首先在疏水效应驱动下插入脂质双分子层，随后螺旋间相互作用形成高阶结构，再进行膜外区域的折叠、结合界面形成与结构域组装。细胞内的跨膜螺旋插入后呈现两种拓扑取向：细菌的N-out（I型，第一个TM螺旋N端朝向胞质侧）与N-in（II型，N端朝向膜外侧），其中N-out拓扑占主导。“正电荷内侧规则”表明，跨膜螺旋N端附近带正电残基的分布决定最终取向，正电荷优先位于胞质侧。对于N-in拓扑蛋白，TMD可能在合成或插入过程中发生翻转，具体机制尚不清楚。脂质双分子层并非静态旁观者，而是整合膜蛋白稳定性的主动调控因子：天然生物膜包含多样的脂质种类与动态组成，细菌会响应温度、pH与压力调节脂质含量，人类的膜脂质则受饮食、应激障碍或疾病影响。脂质双分子层的侧向压力分布、曲率应力与头基相互作用共同构成折叠的自由能景观。此外，多亚基膜蛋白的四级组装机制仍待探索，例如AcrB同源三聚体的稳定环结构是否在共翻译阶段形成尚不明确，这对理解多重耐药外排泵的组装至关重要。另一类β-桶状膜蛋白主要存在于革兰氏阴性菌外膜、线粒体与叶绿体，其折叠为翻译后过程，由周质伴侣与β-桶组装机器（BAM）复合物介导，不在本综述讨论范围内。
2.2 细菌中的共翻译膜蛋白折叠
体内绝大多数细菌膜蛋白通过蛋白传导通道——转运体实现共翻译插入。过程起始于新生多肽从核糖体延伸，多数整合膜蛋白含有N端信号序列，被细菌信号识别颗粒（SRP，革兰氏阴性菌由Ffh蛋白与4.5S RNA组成）识别。SRP随后被其受体FtsY识别，FtsY通过其无序A结构域与细菌转运体及周围磷脂相互作用，将新生链从SRP传递至转运体，促进蛋白插入膜中。结构研究表明，细菌核心转运体为SecYEG三元复合物：SecY含10个TMD，呈假对称排列，TM1–5与TM6–10形成中心孔道，分泌蛋白可通过该孔道进入膜外侧；膜蛋白插入时，SecY在核糖体-新生链结合后发生侧向移动，打开侧向门，促进跨膜区段进入脂质双分子层；SecE维持复合物结构完整性，SecG为非必需亚基，可提升转运效率。除SecYEG外，部分膜蛋白（尤其是单跨膜的小蛋白）可通过YidC以不依赖Sec的方式插入膜中：YidC的亲水沟负责结合底物亲水区域，“油脂滑道”负责疏水区域的侧向移动。对于多跨膜的大蛋白，YidC可与SecYEG、SecDF、YajC组成全转运体（HTL），形成脂质腔室，为膜蛋白插入、折叠与可控释放提供保护微环境。
2.3 真核生物中的共翻译膜蛋白折叠
哺乳动物细胞中，除靶向线粒体或过氧化物酶的膜蛋白外，其余膜蛋白的生物发生始于内质网（ER），随后经高尔基体转运至目的地（如质膜）。该过程整体机制与细菌相似，但更为复杂。新生多肽关联复合物（NAC，由NACα与NACβ/BTF3b组成的异二聚体）首先结合核糖体，通过竞争SRP防止胞质或线粒体靶向蛋白错误定位于ER；若NAC的球状β结构域检测到ER信号序列，复合物发生构象重排，将SRP招募至新生链附近，完成RNC向ER的递送。靶向ER的RNC被SRP递送至Sec61转运体，后者由Sec61α、Sec61β与Sec61γ三个亚基组成：Sec61α形成中心孔道与侧向门，负责信号序列结合与构象开放；Sec61β可能辅助核糖体对接与转运体稳定；Sec61γ作为“夹子”稳定Sec61α的两半结构。Sec61还可与多种附属复合物协作：ER膜蛋白复合物（EMC，含9个蛋白亚基，部分属于OxaI插入酶家族）协助低疏水性TMD的插入；多跨膜转运体（MPT）由RNC:Sec61与GET-和EMC样（GEL）、转运体相关蛋白（PAT）、Sec61背部（BOS）复合物组成，介导多跨膜蛋白的插入，且不依赖Sec61侧向门；TRAM复合物决定膜蛋白的最终拓扑与定位；转运体相关蛋白复合物（TRAP）引导特定信号序列的初始插入，并与寡糖基转移酶（OST）协作参与N-糖基化；信号肽酶复合物（SPC）则介导信号序列的切割。
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折叠的体外研究
为解析促进正确从头折叠的机制，需先理解膜蛋白折叠所处的环境基础。早期工作多通过体外方法探究脂质环境的全局与化学性质，以及新生膜蛋白的疏水特性，主要采用“批量”重折叠策略，利用不同膜模拟体系中的纯化蛋白开展研究。生物膜由数千种脂质分子组成，脂质组成差异显著：细菌与真核膜、不同细胞器、不同细胞周期阶段的脂质组成均不同，胆固醇在不同真核膜中的浓度变化会改变双分子层堆积、流动性与厚度。脂质组成通过调控双分子层性质（侧向压力、表面电荷、厚度、流动性）影响TMD取向、插入效率与早期折叠事件：带负电脂质富集的膜可促进跨膜区插入，而增加侧向链压力的脂质则可能阻碍插入但在嵌入后稳定蛋白。由于体内无法直接测量这些参数，体外重折叠研究成为解析膜蛋白折叠物理原理的重要手段。
3.1 膜生物物理与膜蛋白
膜蛋白生化研究中，胶束常被用作增溶剂以维持高阶蛋白结构，便于纯化与结构解析，但更复杂的膜生物物理认知推动了更多两亲性化合物与脂质双分子层模拟体系的发展，以更接近天然脂质环境。脂质双分子层组装（如脂质体、双细胞结构、聚合物-脂质纳米盘）可通过调整脂质混合比例模拟膜复杂性。两亲分子的形状可由堆积参数（P）分类：P值对应0型（层状）、1型（正曲率）与2型（负曲率），决定组装体的曲率倾向。当两个弯曲的单层堆叠形成双分子层时，会因消除空隙空间产生扭矩张力，储存弹性自由能（gc），形成不同的侧向压力分布，直接影响嵌入膜蛋白的折叠。例如，增加侧向链压力（通过掺入非层状脂质）会降低α-螺旋在共翻译折叠中的插入效率，而这些“批量”膜性质相互关联，需谨慎选择膜模拟体系以避免误导性结论。
3.2 膜模拟体系
3.2.1 去污剂胶束
常用去污剂包括非离子型（如十二烷基-β-D-麦芽糖苷DDM、NP-40衍生物、吐温）与两性离子型（CHAPS、CHAPSO），相比带电去污剂（如SDS）更不易引起蛋白变性。但天然层状膜与普通胶束的差异限制了其在共翻译折叠动力学研究中的应用，膜蛋白功能常因胶束环境受损，需在重建双分子层后恢复。胶束的小尺寸使其适用于冷冻电镜与核磁共振结构解析，但目前膜蛋白纯化仍未完全摆脱去污剂依赖。
3.2.2 双细胞结构
双细胞是由层状脂质与去污剂样两亲分子（如CHAPS、DHPC）组成的20–50 nm平面圆盘，去污剂屏蔽疏水边缘，层状双分子层占主要部分。其内部脂质动力学（侧向扩散）与脂质体相似，但因尺寸限制无膜波动。双细胞主要用于翻译后表征，但采用“软”去污剂的双细胞已支持无细胞表达（如细菌视紫红质），显示出用于共翻译折叠研究的潜力。
3.2.3 脂质体
脂质体（脂质囊泡）是球形囊泡，由单层脂质双分子层包裹水相核心，直径从数十纳米到100微米不等。其可通过合成脂质重建确定的膜环境，允许系统探究主要脂质类别：层状脂质（如磷脂酰胆碱PC、磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰甘油PG、鞘磷脂SM）与非层状脂质（如磷脂酰乙醇胺PE、心磷脂CL）。脂质体可用于研究膜蛋白折叠、结构、活性与稳定性，以及膜曲率、弹性应力、侧向压力分布等性质对整合α-螺旋膜蛋白插入、折叠、功能、拓扑与稳定性的影响。例如，PE赋予单层自发曲率，在平面双分子层中受挫时会积累曲率弹性应力，导致疏水核心压力升高、界面头基区域压力降低的特征性侧向压力分布偏移。通过组成调控可精确调整这些参数，是解析脂质组成、双分子层力学与蛋白折叠互作的关键工具，尽管其简化混合物无法完全模拟天然膜的复杂性。
3.2.4 聚合物-脂质纳米盘
聚合物-脂质纳米盘通过将蛋白直接从细胞膜提取至周围脂质双分子层的小片段中，保留天然膜环境，形成10–20 nm、水溶性、热稳定、单分散的复合物。最早使用的苯乙烯-马来酸（SMA）共聚物已发展出多种化学修饰变体，如二异丁烯-马来酸（DIBMA）具有更低远紫外吸收、更少干扰脂质酰链有序性、更强抗阳离子沉淀能力，其形成的DIBMALP比SMALP更能保留双分子层性质。该体系避免了去污剂胶束的干扰，保留了蛋白结构、功能与关键脂质相互作用，适用于结构生物学、膜蛋白生化与药物发现研究。
3.3 膜蛋白的体外重折叠
传统体外重折叠研究通过化学变性剂（如SDS、尿素）破坏纯化蛋白结构，再通过稀释、透析或色谱法去除变性剂，利用圆二色谱（CD）、差示扫描量热法（DSC）或辅因子结合追踪折叠过程，需在合适的膜模拟体系中开展。研究对象包括细菌视紫红质（bR）、小分子多药转运蛋白（EmrE）、质子-半乳糖同向转运蛋白（GalP）、乳糖通透酶（LacY）等。这类研究可测量膜蛋白结构的热力学稳定性，通过点突变与停流技术鉴定螺旋间关键接触位点与折叠中间态，例如bR的螺旋堆积顺序与体内TMD插入顺序一致，是目前唯一将体外重折叠与细胞TMD插入折叠直接关联的工作。此外，立体阻遏法通过链霉亲和素结合诱导膜内蛋白解折叠，再通过荧光生物素竞争促进重折叠，揭示了bR在DMPC/CHAPS双细胞中的高动力学稳定性；单分子力谱（如磁镊、光镊）通过精准控制机械力解析折叠路径，发现GlpG的插入通过快速连续的螺旋发夹进行，最后两个螺旋的插入为限速步骤，且脂质环境显著影响其稳定性；原子力显微镜（AFM）与氢氘交换质谱（HDX-MS）也被用于表征膜蛋白折叠动力学与脂质环境影响，但这些体外研究均为翻译后状态，与共翻译过程的生理相关性存在差异。
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面向膜蛋白共翻译折叠研究
4.1 无细胞蛋白合成
无细胞蛋白合成（又称体外转录/翻译，IVTT）允许蛋白完全在体外转录翻译，是研究共翻译折叠与膜蛋白插入的重要工具，可克服活细胞中膜蛋白过表达的毒性问题，无需细胞壁或细胞膜，支持实时操控与监测蛋白合成。通过在反应中添加膜模拟体系，并掺入放射性标记或非天然氨基酸，可实现新生链行为的实时监测，直接耦合合成与翻译，提取驱动共翻译膜蛋白折叠非平衡过程的动力学参数。不同IVTT平台各有优势：PURE系统成分纯净，适合精准控制翻译、折叠与脂质组成；大肠杆菌S30提取物通量高、产量高，保留部分内源伴侣活性；小麦胚芽提取物（WGE）适用于真核多结构域蛋白，可规模化制备；哺乳动物裂解液（如兔网织红细胞裂解液RRL、HeLa、CHO裂解液）则能生产具有天然折叠、翻译后修饰与生物活性的膜蛋白。翻译延伸速率是影响共翻译折叠的关键因素：大肠杆菌体内延伸速率约为10–20个氨基酸/秒，真核约为3–8个氨基酸/秒，而多数IVTT系统速率更低（PURE系统约0.13个氨基酸/秒），这种偏离可能影响折叠轨迹，因此需在解释体外结果时谨慎考量延伸动力学的生理相关性。
4.2 核糖体结合新生链复合物
人工停滞的核糖体-新生链复合物（RNC）是解析共翻译折叠中结构中间体的重要工具，可在定义的翻译节点停滞蛋白，避免与核糖体解离。RNC通常通过天然停滞肽序列生成：细菌常用SecM基停滞序列，真核可使用hCMV uORF2或Xbp1序列，也可通过抑制密码子对、氨基酸缺失、poly(A) tracts或截短mRNA在无细胞系统中生成。膜蛋白RNC的制备需兼顾膜环境与核糖体完整性，常用去污剂、MSP纳米盘或聚合物纳米盘进行溶解与纯化。纯化的RNC已与冷冻电镜（Cryo-EM）结合，解析核糖体-转运体复合物的结构，揭示转运体在双分子层环境中的构象变化，以及SecY对多跨膜螺旋插入的陪伴作用。但去污剂纯化会剥离天然脂质，MSP纳米盘仍需去污剂重组，而聚合物纳米盘可直接从膜中提取RNC，更好地保留天然脂质环境，是未来构建接近体内折叠环境RNC样品的重要方向。
4.3 新生链的探测
4.3.1 生化研究
4.3.1.1 半胱氨酸可及性、糖基化与蛋白拓扑
早期通过膜不通透的4-乙酰氨基-4'-马来酰亚胺基二苯乙烯-2,2'-二磺酸（AMS）标记跨膜易位的半胱氨酸，结合35S-甲硫氨酸脉冲追踪，可追踪多跨膜蛋白的插入速率，例如揭示bR的N端易位与第一TM插入为共翻译过程，而FG环易位为翻译后过程。半胱氨酸标记还可用于证明脂质组成影响TMD拓扑：大肠杆菌中PE缺失会导致12跨膜的LacY前6个TM发生翻转。糖基化也可作为拓扑标记：若工程化糖基化位点被细胞机器修饰，说明其位于ER腔侧，反之位于胞质侧，该方法已用于修正STT3蛋白的跨膜螺旋数目预测。
4.3.1.2 有限蛋白酶解
通过蛋白激酶K等酶的部分消化，以溶剂可及性为指标反映螺旋插入与蛋白拓扑，常用于可溶性蛋白与膜蛋白研究。例如，水通道蛋白（AQP）1的拓扑研究发现，翻译至TM4–6后，TM3会发生180°旋转，拉动TM2与TM4形成6 TM拓扑；囊性纤维化跨膜传导调节器（CFTR）的研究则揭示其折叠分为两个阶段：共翻译阶段TMD与NBD1折叠至近天然结构，翻译后阶段NBD2折叠并与TMD组装形成终结构。
4.3.1.3 力谱分析（FPA）
利用停滞肽作为体内力传感器，当新生链与转运体相互作用或TMD分配至膜中产生的力足够大时，可克服停滞释放新生链。通过测量停滞蛋白（A）与全长蛋白（FL）的比例，可构建残基水平的力谱，近似反映膜蛋白插入的自由能。该方法已用于Lep、CaiT、NhaA、EmrD等蛋白，揭示N端TM螺旋可辅助C端螺旋插入，带电残基、脯氨酸、再进入环等特征会影响插入力，但仍无法直接提供动力学信息。
4.3.2 荧光-based方法
荧光共振能量转移（FRET）已被用于监测膜蛋白通过Sec转运体的共翻译插入：将受体荧光团置于新生链N端，供体置于SecY的胞质或周质环，结果显示I型膜蛋白呈“头先”插入模式，II型膜蛋白则依赖核糖体与带电残基的相互作用维持第一跨膜段。单分子FRET还揭示了SecYEG侧向门的高度动态性，以及SRP与核糖体-新生链复合物的结合亲和力与构象变化。但目前荧光方法多标记核糖体、转运体或伴侣机器，难以直接标记新生链本身，因此无法直接观察双分子层内的折叠动力学。
4.3.3 表面增强红外吸收光谱（SEIRAS）
SEIRAS可在无细胞系统表达膜蛋白时，实时监测其次级结构形成，时间分辨率可达5–10秒，对应每翻译1–10个氨基酸采集一次光谱。其原理是利用硅芯片上的薄金层将表面6–10 nm内的红外信号增强10–100倍，仅检测膜内信号，排除水与IVTT组分的干扰。通过分析酰胺I带（1600–1700 cm–1，主要反映C=O伸缩）与酰胺II带（反映C–N伸缩与N–H弯曲），可解析α-螺旋形成与螺旋堆积的动态过程。研究已揭示bR、GlpG、DsbB等蛋白的共翻译折叠阶段：从无规多肽插入、α-螺旋积累到三级结构组装，且辅因子（如bR的视黄醛）对正确折叠至关重要。SEIRAS是目前少数能实时追踪膜内结构获得与折叠速率的技术之一，但仍缺乏残基水平分辨率，且未整合转运体环境。
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迈向计算新生链建模
蛋白质结构预测的计算方法有显著进展，AlphaFold与RosettaFold等深度学习工具在CASP14中表现优异，但这些工具训练所用的实验结构（X射线晶体学、NMR、冷冻电镜）常忽略脂质效应，导致膜蛋白初始预测与细胞内动态构象存在差异。分子动力学（MD）模拟可在原子水平解析膜蛋白与环境的互作，探索折叠路径。目前全原子MD模拟Sec转运体的全过程仍受限于时间尺度，但粗粒度（CG）MD已可研究SecY-心磷脂互作，Go-like模型可探索核糖体存在下的折叠路径， steered MD可模拟新生链离开核糖体隧道的稀有事件。计算模拟与实验技术的结合，将为共翻译折叠机制提供更完整的动态视角。
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膜蛋白折叠在疾病中的意义
蛋白质结构与功能的整合关系早已明确，错误折叠会导致细胞功能紊乱，野生型人PMP22蛋白的体内折叠效率仅约20%，轻微 destabilizing 突变即可使错误折叠成为主导状态，引发疾病。典型人类基因组每个个体携带10,000–12,000个编码变异，gnomAD数据库收录超过1.1亿个人类基因序列变异，使得预测突变的良性或致病性成为重要方向。膜蛋白错误折叠是多种人类疾病的诱因，致病突变多分布于跨膜螺旋区域，通过扰动螺旋间相互作用削弱结构稳定性，而非集中于功能位点。例如，人加压素V2受体的96个已知致病突变中，80个位于跨膜螺旋。药理伴侣（pharmacoperones）是一类可结合靶蛋白、稳定天然构象并促进正确折叠的小分子，已在体外与体内显示出挽救错误折叠蛋白的潜力，尤其适用于功能缺失型突变导致的膜蛋白错误折叠疾病，结合深度学习配体设计，有望加速其开发进程。
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结论与展望
理解膜蛋白的共翻译折叠仍是生物化学的核心挑战，也是药物靶点开发的关键。当前研究正从低分辨率生化实验与孤立复合物快照，转向天然膜与原位环境下的高分辨率结构与动力学解析。但仍存在四个核心问题未解决：单个跨膜螺旋何时获得稳定次级结构？螺旋是顺序插入组装还是协同形成高阶结构？稳定折叠何时首次出现（核糖体出口隧道、转运体、膜中）？膜组成与整合装置如何施加临时拓扑或折叠，后续又在真核细胞中被重塑？目前多数方法仅能提供拓扑与早期插入信息，缺乏延伸、插入与折叠动力学的定量测量，无法捕捉瞬态构象系综。SEIRAS与先进荧光方法结合IVTT已实现实时监测，但需进一步优化。新兴的单分子力谱、氢氘交换质谱与冷冻电镜技术有望填补空白。未来领域需超越描述性拓扑 mapping，建立天然膜中共翻译折叠的定量动力学框架，结合实时生物物理测量与状态分辨结构方法，阐明翻译动态、膜组成与整合机器如何协同产生正确折叠的膜蛋白。
