本研究评估了来自特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）的转化酶在二氧化硅凝胶(SG)和聚羟基丁酸酯(PHB)上的固定化，旨在应用于蔗糖水解生产转化糖。固定化于30 °C、pH 5.5条件下采用戊二醛功能化载体进行。研究人员测定了固定化产率(IY)、回收活性(RA)、动力学参数及pH稳定性、热稳定性、储存稳定性和操作稳定性。结果表明，SG固定化IY达72%，PHB达77%；RA分别为35%和67%。两种固定化衍生物较游离酶储存稳定性均显著提升，其中SG固定化转化酶热稳定性增强，果糖产量更高，并在三次重复使用后保留超过50%活性；PHB固定化衍生物则表现出更高的底物亲和力。该研究证实，固定于SG的B. tequilensis转化酶是一种源自亚马逊生物多样性的稳定生物催化剂，适用于可持续转化糖的生产。
研究背景与意义
转化酶（β-果糖呋喃苷酶，FFase，EC 3.2.1.26）催化蔗糖水解生成葡萄糖与果糖，产物转化糖因甜度高且不结晶，被广泛应用于糖果、糖浆、营养保健品等食品工业。目前食品工业主要依赖酿酒酵母来源的转化酶，但亚马逊地区丰富的热带水果微生物资源中，特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）等细菌转化酶尚未得到充分开发。游离微生物转化酶易失活且不可重复利用，限制了其在工业生产中的应用。固定化技术可通过增强酶的稳定性并实现重复利用来降低成本，而载体材料的理化性质会显著影响固定化酶的性能。因此，研究人员针对亚马逊桃棕榈果分离得到的B. tequilensis PP6菌株产生的转化酶，比较了亲水性二氧化硅凝胶(SG)与疏水性可生物降解聚合物聚羟基丁酸酯(PHB)作为载体的固定化效果及其生化特性，以期获得高效稳定的生物催化剂。该研究成果发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》。
关键技术方法
研究人员采用戊二醛共价偶联法将B. tequilensis PP6发酵产生的胞外转化酶分别固定于SG与PHB载体。通过扫描电镜(SEM)与氮吸附法(BET/BJH)表征载体形貌与孔结构，傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析酶与载体的结合方式。固定化效率通过固定化产率(IY)与回收活性(RA)评价，并测定其pH稳定性、储存稳定性（4 °C，9天）、热稳定性及热力学参数（一级失活常数Kd 、半衰期t1/2 、活化能Ed 、焓变ΔHd 、吉布斯自由能ΔGd 、熵变ΔSd ）。动力学参数最大反应速率Vmax 与米氏常数Km 通过Michaelis-Menten模型拟合，果糖产量测定采用DNS法，操作稳定性通过连续六批次反应评估。
研究结果
Physicochemical Characterization of Biocatalysts
SG比表面积（211.09 m2 /g）显著高于PHB（4.36 m2 /g），两者均为介孔材料（孔径约20 Å）。SEM显示PHB表面粗糙不规则，可能通过增大接触面积促进酶-载体相互作用；SG表面富含硅醇基团(Si-OH)，呈亲水性。FT-IR光谱表明酶通过戊二醛介导的希夫碱(C=N)共价结合于载体，PHB的酯键特征峰保留，暗示其同时存在物理吸附作用。
Invertase Immobilization Parameters
SG与PHB的固定化产率分别为72.24%与76.72%，回收活性分别为34.62%与60.67%。PHB较高的RA可能与疏水相互作用减少酶构象破坏有关，而SG的高比表面积利于多点共价结合但可能限制活性构象。
pH Stability
PHB固定化酶在pH 5.0-6.0间稳定性最佳，pH 4.5与6.5时保留约50%活性；SG固定化酶仅在pH 5.0时稳定性最高，pH 5.5与6.5时活性下降约75%，表明载体微环境显著影响酶的pH耐受性。
Storage Stability
4 °C储存9天后，游离酶损失80%活性，而两种固定化酶均保持初始活性，证实固定化有效抑制酶失活。
Thermal Stability and Thermodynamic Parameters
SG固定化酶在30 °C半衰期（3466 min）为PHB（1733 min）的两倍，热失活活化能Ed （42.39 kJ/mol）约为PHB（10.48 kJ/mol）的四倍，表明SG通过多点共价结合增强酶刚性，提高热稳定性。热力学分析显示ΔGd 为正值，证实热失活为非自发过程；ΔSd 为负值，反映酶结构在固定化后更为有序。
Reaction Kinetics
两种固定化酶Vmax 相近（约0.4 U/g），但PHB的Km （2.40 g/L）显著低于SG（11.19 g/L），表明其对蔗糖亲和力更高，这可能与PHB表面的酶取向优化有关。
Fructose Production
SG固定化酶在8小时反应中果糖浓度达68.2 mM，显著高于PHB（13 mM），归因于SG的亲水多孔结构促进底物扩散与催化周转。
Operational Stability
SG固定化酶在六次循环后仍保留20%活性，前三次循环活性保持在50%以上；PHB固定化酶在第二循环后活性降至30%，第六循环仅剩5%。SG优异的操作稳定性源于戊二醛形成的强共价键抵抗酶脱落。
讨论与结论
研究表明，载体理化性质决定固定化酶的性能：PHB凭借疏水作用与高回收活性适合短期高效催化，而SG通过多点共价结合赋予酶卓越的热稳定性与操作稳定性，更适合长期工业化应用。固定于SG的B. tequilensis转化酶兼具亚马逊微生物资源的独特优势与工业化潜力，为可持续转化糖生产提供了新型生物催化剂。该研究填补了亚马逊细菌转化酶固定化研究的空白，并为生物质载体筛选提供了理论依据。
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