二萜类化合物是重要的天然次级代谢产物，以20碳骨架为特征，根据环结构可分为无环、单环、双环、三环、四环和大环类型。这类化合物广泛存在于药用植物中，参与抵御病原体和植食性动物的防御功能，并表现出多样的药理活性，包括抗癌、抗炎、心血管保护、抗糖尿病和抗菌作用。二萜类化合物的生物合成前体(E,E,E)-香叶基香叶基二磷酸[(E,E,E)-geranylgeranyl diphosphate, GGPP]主要在植物中通过甲基赤藓糖醇4-磷酸[methylerythritol 4-phosphate, MEP]途径生成。二萜合酶[diterpene synthases, diTPSs]构建碳骨架后，经细胞色素P450单加氧酶[cytochrome P450 monooxygenases, CYP450s]、醇脱氢酶[alcohol dehydrogenases, ADHs]和UDP依赖的糖基转移酶[UDP-dependent glycosyltransferases, UGTs]催化发生多样修饰，同时转录因子[transcription factors, TFs]协调通路基因的表达。合成生物学与代谢工程的进展已实现二萜类化合物在遗传可操作宿主中的异源生产，通过启动子优化、定点诱变和发酵优化等多层面工程策略提升了产量。本综述系统总结了二萜类化合物的结构、分布、生物活性、生物合成通路，并讨论了未来方向，包括通过结构修饰增强生物活性、利用组学分析解析通路、模块化生物合成实现高产，以及机器学习在药理学和酶工程中的应用。这些工作为发现新型生物活性二萜类化合物、阐明完整生物合成通路，以及通过生物技术育种和合成生物学实现可持续生产提供了基础。
1 引言
二萜类化合物是重要的天然次级代谢产物，属于萜类化合物的子类，以20碳(C20)骨架为特征，根据环结构可分为无环、单环、双环、三环、四环和大环类型。这类化合物广泛存在于药用植物中，参与抵御病原体和植食性动物的防御功能，同时表现出广泛的药理活性，如抗癌、抗炎、心血管保护、抗糖尿病和抗菌作用。鉴于膳食摄入二萜类化合物与人类健康密切相关，其深入开发与应用具有重要意义。二萜类化合物的生物合成前体GGPP主要在植物中通过MEP途径生成，随后由diTPSs环化重排形成超过100种不同的二萜碳骨架。在此基础上，药用植物通过CYP450s、ADHs、UGTs等多种酶的修饰产生多样的二萜类化合物。此外，TFs通过调控植物次级代谢中多个关键基因的表达，在二萜生物合成中发挥关键的调控作用。随着合成生物学与代谢工程的发展，在大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)等遗传可操作宿主中实现植物天然产物的异源合成，已成为规模化生产的重要替代策略。通过引入合成基因与上游关键基因、启动子优化与定点诱变提升酶活性、调控TFs与转运蛋白、优化发酵条件等多层面工程手段，可进一步提升产量。本综述系统总结了二萜类化合物的结构、分布、生物活性、生物合成通路及生物工程应用，并讨论了关键进展与未来方向，包括通过机制研究与结构修饰增强生物活性、利用组学分析与大规模筛选解析通路、通过模块化生物合成与遗传、酶、细胞和发酵层面的多层面工程实现高产，以及将机器学习作为药理学、生物合成与酶工程的高效平台。这些工作为二萜类化合物的规模化合成、开发与应用提供了重要参考，也为天然产物未来的生物制造提供了新思路。
2 二萜类化合物的结构与分布
2.1 二萜类化合物的结构
二萜类化合物由4个C5异戊二烯单元头尾连接而成，基本骨架含20个碳原子，根据结构特征主要分为无环、单环、双环、三环、四环和大环类型。部分类型如粗榧烷(cephalotane)、瑞香烷(daphnane)、木藜芦烷(grayanane)、佛波烷(tigliane)和克罗托烷(crotofolane)含7元环，同时也具有三环或四环结构，其生物合成被认为起源于大环前体，因此在本文中归入大环类讨论。无环二萜（又称线性二萜）通常具有不饱和直链结构，常作为其他化合物生物合成的前体，稳定性较差，自然界中种类相对较少，代表性化合物为植醇(phytol)，是叶绿素分子的组成成分，几乎存在于所有光合生物中。单环二萜含一个五元或六元环，多位于分子末端，偶见于中部，主要分布于动物肝脏、真菌与海绵中，也在部分裸子植物与被子植物科中报道。双环二萜以包含两个环结构的碳骨架为特征，目前已鉴定超过10000种，植物中主要包括半日花烷(labdanes)、哈利曼烷(halimanes)和克罗烷(clerodanes)三个亚类。半日花烷型二萜具有双环十氢化萘环系，C-9位连接六碳侧链，其余四个甲基分别连接在C-4、C-8和C-10位，代表化合物穿心莲内酯(andrographolide)在多种疾病模型中显示出抗癌、抗炎、抗菌、神经保护、保肝、降血糖和免疫调节作用。哈利曼烷型双环二萜属于较小的天然产物类群，从生物合成角度被认为是半日花烷与克罗烷之间的中间类型。克罗烷型二萜的基本骨架与半日花烷相似，但四个甲基的连接位置不同。三环二萜含三个环结构，通常为6/6/6或6/5/6骨架，植物中主要为松香烷(abietanes)，也包括克莱斯坦烷(cleistanthanes)、蔷薇烷(rosanes)和苏木烷(cassanes)。松香烷型具有三环全氢菲骨架，C-10位的C-20甲基为β构型，C-4位连接两个甲基，C-13位连接异丙基，代表化合物松香酸(abietic acid)具有强抗菌活性，丹参酮IIA(tanshinone IIA)用于治疗心血管疾病。苏木烷型是从苏木属植物中分离的三环二萜，特征为含呋喃环或α,β-丁内酯基团，已报道238种该类型化合物具有抗病毒、抗癌、抗炎、抗疟和抗增殖等活性。克莱斯坦烷型以C环芳构化为核心结构特征，已报道201种化合物。四环二萜通常为6/6/6/5环系，根据构型分为C-8桥环（即ent-贝壳杉烷和ent-赤霉素烷型）或C-9桥环类型。ent-贝壳杉烷型二萜是贝壳杉烷二萜的对映体，代表化合物甜菊醇(steviol)用作甜味剂，冬凌草甲素(oridonin)具有强效抗癌与抗炎活性。大环二萜结构中至少含一个七元或更大的碳环，通常高度氧化且具有复杂结构特征，包括卡斯贝烷(casbene)、麻风树烷(jatrophanes)、拉沙烷(lathyranes)、粗榧烷、瑞香烷、木藜芦烷、佛波烷和克罗托烷等主要类型。卡斯贝烷型含14元大环，被认为是其他大环二萜的重要生物合成前体。麻风树烷与拉沙烷含十个及以上碳的大环，因结构不稳定在自然界中较少见，仅报道于大戟科植物。粗榧烷型具有刚性的7/6/5/6稠合四环结构，仅分布于三尖杉属，已鉴定105种结构多样的化合物。克罗托烷型为5/6/7三环体系，主要报道于巴豆属植物。佛波烷型基于5/7/6/3四环体系，A环含α,β-不饱和酮结构，C-12、C-13和C-20位常带有多个羟基，易被乙酸、异丁酸等酰化。该类型仅分布于大戟科与瑞香科植物。木藜芦烷型具有独特的5/7/6/5四环体系，仅存在于杜鹃花科，是植物抵御植食性昆虫的重要化合物，已报道超过250种。瑞香烷型具有5/7/6三环骨架，主要分布于瑞香科与大戟科植物，已报道超过300种。此外，紫杉醇是具有复杂结构的二萜类化合物，含6/8/6/4四环碳骨架，多达11个立体中心，高度氧化，最初从太平洋红豆杉中分离，具有显著抗癌活性，是治疗多种癌症的有效药物。
2.2 药用植物中的分布
二萜类化合物广泛分布于真菌、藻类、单子叶植物、双子叶植物和海洋生物中，在药用植物中主要分布于松柏类、姜科、豆科、菊科、木犀科、杜鹃花科、爵床科、大戟科、马鞭草科、唇形科和茄科等。松柏类包含多种二萜类型，如从鸡毛松中分离的单环二萜cassipourol，从杉木中分离的半日花烷型cuceolatins A–C，从长叶松中分离的三环松香烷型松香酸。单子叶姜科植物中报道了双环与三环二萜，如从长柄山姜中分离的独特三环结构alpinoblonoids A和B。防己科植物中仅报道了从青牛胆属和中华青牛胆属中分离的双环克罗烷型二萜，大风子科的Casearia graveolens中也仅发现克罗烷型。豆科植物产生三环和四环二萜，其中苏木烷型是该科的特征类型。大戟科具有最丰富的二萜多样性，涵盖几乎所有结构类型，是宏环二萜多样性研究的核心类群，从该科植物中分离了半日花烷、哈利曼烷、克罗烷、松香烷、克莱斯坦烷和ent-贝壳杉烷等多种类型。瑞香科虽报道的二萜数量有限，但表征了多个四环二萜，如从瑞香中分离的gnidimacrin和daphneodorins A–C，以及从狼毒中分离的stellchamain A。杜鹃花科分离出具有独特结构的四环和大环二萜，如从滇南杜鹃中分离的leucothane型四环二萜rhodomollein LII和LIII，从美丽马醉木中分离的具5/7/6/5环系的grayanane型pierisformosoids A–L。茄科具有多样的二萜类型，从无环capsianosides、单环solanerioside A到半日花烷型cis-abienol和大环cembratriene-ol均有报道，但该科尚未报道三环或四环二萜，提示可能缺乏参与ent-贝壳杉烷生物合成的贝壳杉烷合酶样(KSL)酶。唇形科许多药用植物富含二萜，如迷迭香中的单环trixagol和双环二萜，广防风中的大环ovatodiolide，丹参中的三环丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮，以及从碎米桠中分离的四环冬凌草甲素。此外，唇形目其他科如木犀科、马鞭草科、爵床科和玄参科也分离出大量双环二萜。菊科作为最大的植物科之一，二萜多样性显著，如无环lipskynoids A–G、单环tagetones A和B、半日花烷型salvic acid、克罗烷型baccharisacetals A和B，以及四环甜菊醇。除上述科外，二萜还在三白草科、叶下珠科、楝科、眼子菜科、云实科、翡若翠科、苦木科、番荔枝科和茶茱萸科等多个科中报道。总体而言，二萜的分布具有一定分类规律性，进化程度更高的类群倾向于产生结构更复杂的化合物，且部分谱系具有独特的二萜类型。
3 二萜类化合物的生物活性
3.1 植物防御相关反应
二萜类化合物在植物先天免疫中发挥关键作用，作为植保素或信号分子通过多种机制抵御病原体与植食性动物。例如capsianosides特异性参与生物胁迫防御反应；cis-abienol可诱导番茄对青枯菌引起的细菌性枯萎病的抗性；香叶基芳樟醇具有杀虫活性，可作为有毒威慑剂或驱避剂对抗植食性昆虫；cembratriene-ol兼具抗菌与杀虫活性，可破坏真菌内膜结构，80 μg/mL浓度完全抑制苹果腐烂病菌生长；pierisformosoids A、D和I在0.5 mg/mL浓度下对农业害虫小菜蛾表现出拒食活性；佛波烷型二萜对小菜蛾幼虫具有强杀活性，LC50值分别为0.19、0.16和0.26 μM，与阳性对照氟苯虫酰胺相当。这些研究凸显了二萜类化合物作为绿色农药与抗性诱导剂的开发潜力。
3.2 抗炎作用
寻找新型抗炎剂仍具挑战性，因炎症过程复杂且在宿主防御中具有双重作用。大量证据表明二萜类化合物，尤其是双环二萜，在多种炎症性疾病的干预治疗中发挥重要作用。许多二萜可抑制脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7巨噬细胞的一氧化氮(NO)产生，这是通过调节核因子-κB(NF-κB)通路介导抗炎活性的关键指标。例如lipkynoids A–G和化合物86的IC50值在9.9至18.47 μM之间。部分二萜靶向更特异的炎症通路，如calintegerinoid C和euphzycopin D可阻断NLRP3炎性体激活，乳酸脱氢酶(LDH)释放抑制的IC50值分别为1.27 μM和7.75 μM，证实NLRP3炎性体是二萜类抗炎治疗的关键分子靶点。穿心莲内酯是研究最深入的二萜之一，在哮喘、类风湿关节炎、炎症介导的神经退行性疾病、自身免疫性脑脊髓炎和系统性红斑狼疮等多种炎症性疾病中显示出治疗潜力。机制研究表明，其△12(13)-环外双键通过迈克尔加成与p50亚基的还原型Cys62残基形成共价加合物，阻断NF-κB与共有序列的结合，减弱其转录活性。目前已有多种含穿心莲内酯的中成药获批临床使用，包括康健片、穿心莲片、穿心莲滴丸和穿心莲胶囊。
3.3 抗癌作用
大量二萜类化合物对多种人类癌细胞系表现出细胞毒性，部分具有显著的选择性与效力。例如tagetone A对MCF-7（乳腺癌）和A549（肺癌）细胞具有强细胞毒性，IC50值分别为4.68和4.24 μM；tagetone B对HCT116（结肠癌）细胞选择性活性，IC50值为6.30 μM；异库柏酸(isocupressic acid)对HepG2（肝癌）细胞的效力优于标准化疗药物顺铂；Crotonmekongenin A对FaDu（咽鳞状细胞癌）、HT-29（结直肠腺癌）和SH-SY5Y（神经母细胞瘤）细胞系具有显著细胞毒性，ED50值分别为0.48、0.63和0.45 μg/mL；大环crotignoid A对HL-60（白血病）细胞具有强活性，IC50值为1.61 μM。除体外细胞毒性研究外，多种二萜的体内抗癌机制也被深入研究。Ovatodiolide通过调节NF-κB/MMP-9、JAK2/STAT3、PI3K/AKT/mTOR和Wnt/β-catenin等关键信号通路发挥抗癌作用，并有效靶向肿瘤干细胞。此外，化合物151在斑马鱼异种移植模型中有效抑制血管生成并显示出显著抗癌活性。值得注意的是，二萜的生物活性常与毒性密切相关，限制了其临床应用，因此降低毒性是亟待解决的问题。
3.4 抗菌作用
二萜类化合物对包括临床耐药菌株在内的广谱细菌、真菌和病毒病原体显示出良好抗菌潜力。具有抗菌活性的代表化合物包括松香酸，其制剂用于皮肤损伤与感染的治疗，还可抑制致龋菌变形链球菌生长，是牙科填充材料的关键成分；cleistanthol对多种革兰阳性菌和福氏志贺菌具有广谱活性，MIC50值在12至64 μg/mL之间；半日花烷型二萜42对枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌具有强选择性抑制，MIC值低至0.125和1 μg/mL。在抗疟活性方面，mangiolide表现突出，对氯喹敏感与耐药恶性疟原虫株均具有强效活性，IC50约0.8 μg/mL，同时对新生隐球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素耐药肠球菌(VRE)也具有活性。在抗病毒领域，gnidimacrin和daphneodorins A–C在亚纳摩尔浓度下强效抑制HIV-1复制，gnidimacrin的EC50低至0.061 nM；crotokilwaepoxides B和E对人鼻病毒2型(HRV-2)具有中等抗病毒活性；脱氢松香酸通过靶向病毒RNA依赖的RNA聚合酶(3Dpol)保护免受口蹄疫病毒感染。这些二萜的结构与功能多样性，特别是对WHO优先级病原体如MRSA、VRE和铜绿假单胞菌的活性，凸显了其作为抗菌药物开发先导化合物的潜力。
3.5 其他生物活性
除前述活性外，二萜类化合物还表现出广泛的药理效应。在代谢性疾病领域，多种二萜通过不同机制显示抗糖尿病潜力。化合物13和14在30 μM浓度下提升肾小球系膜细胞中Nrf-2/HO-1水平，降低NF-κB、TNF-α和IL-6，提示缓解糖尿病并发症的潜力；tinosinoids G和H抑制α-葡萄糖苷酶，IC50值分别为46.0和29.7 μM，为餐后血糖控制提供机制；lauenones A和B抑制3T3-L1细胞脂肪生成，EC50为13.07–42.57 μM，效果优于二甲双胍，其立体化学调节PPARγ/C/EBPα通路；scoparicol E在体内减少MLD-STZ诱导的小鼠高血糖，提升胰岛素水平并调节胰岛凋亡；甜菊醇作为天然二萜甜味剂，可降低胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和糖化血红蛋白(HbA1c)，显示更广泛代谢益处。在神经系统方面，euphorfinoid E抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)，IC50值为6.23 μM；杜鹃花科植物的多种四环与grayanane型大环二萜在体内显示强镇痛作用，如rhodomollein LIII在20 mg/kg剂量下对醋酸诱导的小鼠扭体试验抑制率达89.0%，pierisformosoids在5.0 mg/kg更低剂量下即显示显著活性。循环系统方面，丹参酮IIA磺酸钠自20世纪80年代起在中国获批用于治疗心血管疾病，通过调节钙信号、程序性细胞死亡通路和抑制促炎信号级联，减轻血管平滑肌细胞(VSMC)的适应不良行为；crassifolins Q–U通过调节血管内皮生长因子(VEGF)信号抑制血管生成，crassifolin U活性最强，IC50值在7.20至48.27 μM之间。此外，baccharisacetals A和B及其差向异构体在LX-2细胞和斑马鱼模型中显示抗酒精性肝损伤的保护作用。
4 二萜类化合物的生物合成通路
无论结构如何复杂，二萜类化合物的生物合成均起源于通用前体GGPP，主要通过植物中的MEP途径生成。通路通常由II类和I类diTPSs启动，随后经CYP450s和各种修饰酶催化氧化修饰。随着基因组与转录组测序的快速发展，越来越多的生物合成步骤被解析，为提升二萜产量或实现异源生物合成提供了机会。
4.1 半日花烷型二萜的生物合成
半日花烷型二萜的生物合成已在三种药用植物中表征，揭示了保守的酶机器与通路特异性多样化。在鞘蕊花中，佛司可林(forskolin)生物合成通路是目前解析最完整的半日花烷型通路。从GGPP开始，II类diTPS CfTPS2催化环化形成8α-羟基香叶基香叶基二磷酸(8α-hydroxy-CPP)，随后I类diTPSs CfTPS3/4将其立体特异性转化为13R-泪柏醇氧化物(13R-manoyl oxide)。CYP76AH亚家族的三个酶CfCYP76AH15、CfCYP76AH8和CfCYP76AH17独立催化C-11位氧化，其中CfCYP76AH15效率与特异性最高；CfCYP76AH11催化C-1、C-6和C-7位氧化生成9-脱氧-7-去乙酰基佛司可林；CfCYP76AH16介导C-9位氧化生成7-去乙酰基佛司可林；CfACT1–8通过C-7位乙酰化完成通路。相比之下，欧夏至草中marrubiin的生物合成仅部分解析，由II类diTPS MvCPS1将GGPP转化为peregrinol diphosphate，再由I类diTPSs MvELS环化为9,13-环氧-14-赖百当烯，随后CYP450酶CYP71AU87催化生成两种羟基化异构体，推测为marrubiin的关键中间体，但后续呋喃环形成与进一步氧化步骤仍未阐明。穗花牡荆中vitexilactone的生物合成早期步骤与欧夏至草相同，但后期分化，peregrinol diphosphate转化为peregrinol后，经CYP76BK1氧化生成labd-13Z-烯-9,15,16-三醇，推测为该化合物的前体，后续转化仍需发现。
4.2 克罗烷型二萜的生物合成
克罗烷型二萜的研究少于半日花烷型，完整通路尚未解析，但已有重要发现。关键进展是鉴定了参与呋喃环形成的CYP450，这对salvinorin A的结构多样化具有重要意义。在Diviner's sage中，salvinorin A的生物合成由II类diTPS SdCPS2启动，将GGPP转化为kolavenyl diphosphate(KPP)；随后I类diTPSs SdKSL1和SdKSL2催化KPP生成kolavenol。有趣的是，在烟草和酵母中单独异源表达SdCPS2意外产生kolavenol，提示宿主内源性磷酸酶可裂解二磷酸基团。随后CYP76AH39催化kolavenol转化为含二氢呋喃的克罗烷crotonolide G；来自一串红的同源酶产生含呋喃的克罗烷annonene，显示CYP76AH亚家族的功能分化。下游CYP728D26催化crotonolide G和annonene的C-18位连续三次氧化，分别生成crotonolide G酸和hardwickiic酸，为salvidivin A和salvinorin A的完全氧化骨架。近期在一串红中鉴定了一种新型酶hautriwaic acid synthase(HTAS, CYP728D-like)，负责hautriwaic acid的生物合成，为克罗烷多样化提供了新见解。半枝莲中高度修饰的克罗烷scutebarbatine A的生物合成已在半枝莲和黄芩中研究，由II类diTPSs催化GGPP转化为isokolavenyl diphosphate(IKPP)，再经I类diTPSs转化为isokolavenol，后续转化为scutebarbatine A涉及广泛结构修饰，包括多次羟基化、侧链酯化和呋喃环形成，虽预测了四个P450催化的羟基化步骤，但尚未成功鉴定接受isokolavenol的底物，下游通路仍未解析。近期研究显示，来自十种不同物种的VacCYP76BK1同源酶在烟草中瞬时表达时，均可催化克罗烷骨架的氧化环化生成呋喃环，推进了对克罗烷多样化中呋喃环组装的理解。结合合成生物学方法，有望最终实现salvinorin A及相关通路的异源重构。
4.3 三环二萜的生物合成
三环松香烷二萜的生物合成主要在唇形科植物中研究。通路起始于II类diTPSs催化GGPP环化为copalyl diphosphate(CPP)，在丹参中由SmCPS1和SmCPS2执行，生成的CPP经I类diTPS SmKSL1环化生成miltiradiene，该烯烃是多种松香烷二萜的通用烃骨架，在生理条件下可自发氧化为松香三烯。该三环骨架的氧化功能化主要由CYP76和CYP71分支的CYP450s催化，许多酶具有显著的底物混杂性，促进了松香烷产生植物的结构多样性。初始氧化步骤由ferruginol synthase(CYP76AH1)催化，在C12位引入羟基生成ferruginol；在迷迭香和多种鼠尾草中，同源酶(CYP76AH22–24)催化连续氧化，生成同时带C11和C12羟基的11-羟基ferruginol。此时通路分化为丹参酮与鼠尾草酸/鼠尾草酚两个分支。在丹参酮分支中，11-羟基ferruginol经CYP
