副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis）是一种猪呼吸道病原体，也是格拉瑟病（Glässer’s disease）的致病因子。在已知的15种血清型中，血清型2、5和12属于全球传播的高风险谱系，其特征为毒力增强和抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）升高。为系统研究高风险血清型的全球流行病学及其分子基础，研究人员开展了大规模比较基因组分析。研究共组装了1,004株副猪嗜血杆菌基因组，包括来自中国18个省病猪的102株新测序分离株，以及来自16个国家的902株公共可用基因组。泛基因组分析鉴定出msmX可作为区分血清型5和12的新型标志物。贝叶斯系统地理学重建追溯了这些谱系的传播历史：血清型2的高度耐药谱系可能于20世纪40年代末起源于日本，并通过中国传播至美洲；而血清型5和12的高毒力谱系则首先出现于中国，随后扩散至全球。耐药组和毒力组分析揭示了不同的风险模式：血清型2携带更多抗菌药物耐药基因（antimicrobial resistance genes, ARGs），而血清型5和12拥有更广泛的毒力因子（virulence factors, VFs）库。值得注意的是，研究人员发现了同时携带大量VFs和ARGs的分离株，代表了一种趋同的双重高风险基因组特征。此外，机器学习模型识别出与AMR和毒力显著相关的标志性基因，这些基因参与细胞壁合成、荚膜多糖生成和碳源利用等通路。综上，本研究阐明了高风险血清型的全球传播模式及分子基础，为针对性监测、临床抗菌药物管理以及合理疫苗开发提供了关键证据。
副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis，原名Haemophilus parasuis）是猪上呼吸道常见定植菌，也是一种重要的机会性病原，可引发以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的格拉瑟病，造成全球养猪业重大经济损失。该菌分为15种血清型，各血清型间缺乏交叉保护免疫，且毒力和宿主免疫反应差异显著。传统血清学分型方法难以区分表型相近的血清型，尤其是血清型5与12，限制了流行病学监测的准确性。近年来，随着集约化养殖的发展和免疫抑制病毒的流行，副猪嗜血杆菌与其他病原共感染的频率上升，加之抗菌药物广泛使用导致耐药性加剧，高风险血清型（高毒力或高耐药）的全球传播已成为行业重大挑战。尽管全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）已应用于部分区域菌株的遗传多样性分析，但针对全球范围内高风险血清型的传播路径、进化机制及分子基础仍缺乏系统性研究。为此，研究人员整合全球1,004株副猪嗜血杆菌基因组，旨在通过比较基因组学、系统发生动力学和机器学习方法，阐明高风险血清型的进化与传播规律，挖掘关键遗传决定因素。该研究发表于《Applied and Environmental Microbiology》。
研究采用的关键技术方法包括：构建包含102株中国新分离株（2020-2025年采集自18个省）和902株公共基因组的全球数据集；利用CheckM评估基因组质量，Roary进行泛基因组分析，Abricate注释耐药基因、毒力因子及移动遗传元件；基于核心基因组SNP构建最大似然树和贝叶斯系统发育树，结合TempEst和BEAST 1.10.4进行时间校准与系统地理学重建，推断起源与传播路径；应用随机森林等六种机器学习模型筛选与耐药性和毒力相关的特征基因，并通过SHAP值解释模型。
研究结果
全球副猪嗜血杆菌基因组数据集概览
研究人员对102株新测序基因组进行质量控制，所有组装均达到完整性≥90%、污染≤5%的标准。全球数据集涵盖16个国家，以中国和美国的分离株为主，血清型分布显示血清型4最为流行（18.3%），其次为血清型7（13.7%）、13（11.1%）、5（10.9%）、2（10.9%）和12（4.3%）。时间序列分析表明，2015-2018年和2020-2022年为分离株高峰，血清型2、5和12的频率呈显著上升趋势，逐渐成为优势血清型。
泛基因组分析鉴定出区分血清型5和12的基因型特异性标记msmX**
通过对21株具有明确血清型信息的参考菌株进行泛基因组分析，共鉴定出5,447个基因，包括1,385个核心基因和4,062个附属基因。其中，血清型12特有的31个基因中，msmX（编码ABC转运蛋白底物结合组分，参与细菌糖摄取与代谢）在所有血清型12菌株中稳定存在，而在血清型5中完全缺失，被选为区分两者的理想分子标记。基于WGS的血清型预测进一步验证了msmX的特异性。
全基因组测序与分析
耐药组分析检测到23种针对7类抗生素的耐药基因，总体阳性率为35.66%（358/1,004），以tet(B)（26.00%）、aph(3″)-Ib（21.41%）和sul2（21.31%）为主。毒力组分析鉴定出41种潜在毒力因子，其中gmhA/lpcA、fur等为核心毒力基因，在100%菌株中存在。血清型5携带毒力因子种类最多（40/41），血清型12次之（38/41），而血清型2平均携带耐药基因数（2.8）显著高于其他血清型。通过k-means聚类将血清型分为高、中、低耐药/毒力组，桑基图分析显示血清型2主要集中于高耐药组，血清型5和12集中于高毒力组，并发现10株同时具有高耐药和高毒力特征的“双重高风险”克隆。
抗菌药物敏感性试验
对102株中国分离株的8类抗生素药敏试验显示，复方新诺明耐药率最高（87.3%），其次为恩诺沙星（63.7%），仅头孢噻呋对所有菌株敏感。66.7%的菌株表现为多重耐药（multidrug resistance, MDR），其中血清型2耐药谱最广，平均耐药类别达4.67，且对四环素、氟苯尼考和复方新诺明100%耐药。高毒力血清型5和12除对头孢噻呋敏感外，对其余7类抗生素均表现出不同程度耐药。
副猪嗜血杆菌血清型2、5和12的进化与全球传播
贝叶斯系统发育分析表明，血清型2的最近共同祖先可追溯至约1950年，分为8个主要分支，其中分支1携带≥6个耐药基因，且所有菌株均源自中国。血清型12的最近共同祖先约出现于1943年，分为6个分支，分支3和6携带的毒力因子数量显著高于其他分支。系统地理学重建揭示，血清型2的高耐药谱系可能起源于日本，1948年传入中国，后于1987-1999年间传播至美国，并进一步扩散至秘鲁和墨西哥；而血清型5和12的高毒力谱系则起源于中国，随后向全球传播。贝叶斯天空线图显示，三种高风险血清型均在20世纪末经历种群扩张，并于2000-2015年间达到传播平台期。
泛基因组分析与机器学习应用
对897株非不可分型菌株的泛基因组分析鉴定出18,523个基因，呈现开放泛基因组结构。随机森林模型筛选出与耐药性最相关的10个特征基因，包括参与细胞壁合成的glmU_2、调节VI型分泌系统的tagF、参与荚膜多糖合成的capD等；以及与毒力最相关的9个特征基因，包括参与荚膜多糖唾液酸化的neuA_3、核糖转运代谢相关的rbsA、肽聚糖重塑相关的dacB等。这些基因的功能注释揭示了耐药性和毒力形成的多因子协同机制。
讨论与结论
研究证实血清型2、5和12已成为当前全球流行的高风险谱系，分别呈现高耐药和高毒力特征，且存在兼具双重风险的克隆，其传播与进化受抗生素选择压力和移动遗传元件介导的共选择驱动。系统地理学分析明确了日本为血清型2高耐药谱系的起源地，中国为血清型5和12高毒力谱系的主要起源与传播枢纽。机器学习识别的特征基因将毒力与耐药性在分子水平上联系起来，如capD既参与荚膜合成（毒力相关），也与抗生素耐受相关。研究局限性在于公共基因组数据的地理分布不均，以及特征基因与表型间的因果关系需进一步功能验证。总体而言，本研究构建了副猪嗜血杆菌高风险克隆的群体基因组学框架，为精准监测、抗菌药物合理使用及疫苗设计提供了重要的科学依据，对全球养猪业的疫病防控具有重要指导意义。
