摘要
基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV）及披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属的其他成员为正链RNA病毒，是重要的全球人类病原体，每年导致数百万感染病例。在人类中，CHIKV、Mayaro病毒及罗斯河病毒等甲病毒通常引起以严重关节痛、关节炎症、发热及皮疹为特征的关节炎性疾病。尽管近期已有针对CHIKV的疫苗获批，但目前尚无针对其他甲病毒的许可疫苗，亦无任何可直接预防或治疗甲病毒感染的抗病毒药物。为解决这一未满足的临床需求，研究人员利用CHIKV纳米荧光素酶报告病毒建立了新型小分子抑制剂的高通量筛选体系。通过该筛选，研究人员鉴定出多个可抑制CHIKV复制的独特化合物。对其中两种化合物的机制研究表明，两者均靶向nsP4 RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）。敏感性分析确定了能够特异性赋予耐药性的nsP4突变位点，但这些突变在竞争实验中会降低病毒适应性。计算机模拟对接及耐药性分析显示，这些抑制剂可能结合于聚合酶活性位点附近的特定区域。综上，本研究定义了多个可用于后续开发的化学型，并揭示了CHIKV nsP4中可作为抑制靶点的新分子位点。
论文解读
研究背景
基孔肯雅病毒（CHIKV）属于披膜病毒科甲病毒属，是一种由伊蚊传播的正链RNA病毒，近年来在全球热带及亚热带地区广泛流行，导致严重的公共卫生负担。急性CHIKV感染常表现为高热、皮疹及剧烈关节疼痛，部分患者可发展为持续数月甚至数年的慢性关节炎。尽管已有两款CHIKV疫苗（Vimkunya和Ixchiq）在美国获批，但因严重不良反应，Ixchiq随后被撤回许可。目前，针对CHIKV及其他甲病毒均无获准临床使用的抗病毒药物，现有治疗手段仅限于非甾体抗炎药及支持性护理。直接作用的小分子抗病毒药物可在疫苗接种之外提供快速疫情控制手段，因此开发靶向病毒复制关键蛋白的抑制剂具有重要临床意义。
技术方法概述
研究人员构建了表达纳米荧光素酶的重组CHIKV报告病毒（CHIKV-nLuc），用于高通量筛选（high-throughput screening, HTS）约41万种化合物库。通过正交二次筛选、细胞毒性检测及非特异性抑制剂排除，获得候选化合物。采用时间加入实验（time-of-addition, ToA）、复制子实验及原代细胞感染模型评估化合物的抗病毒活性与选择性。通过连续传代诱导耐药病毒株，并结合全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）鉴定耐药突变位点。利用计算机模拟分子对接预测抑制剂与nsP4 RdRp的结合模式。
研究结果
HTS campaign
研究人员成功建立并验证了基于CHIKV-nLuc的HTS平台，筛选出740个初筛命中化合物。经PAINS过滤及聚集性预测，最终确定14个代表10种不同化学型的化合物进入后续剂量反应验证。其中GAP-1146924与GAP-1173149显示出良好的抗CHIKV活性及低细胞毒性，被选为主要研究对象。
Indication spectrum and mechanistic characterization
两种化合物对无关病毒（如人副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、SARS-CoV-2及水疱性口炎病毒）无显著抑制作用，且在浓度超过100 μM时无细胞毒性。时间加入实验表明，两者的作用阶段位于病毒进入之后，与已知聚合酶抑制剂4′-氟尿苷（4′-FlU）及EIDD-1931的曲线相似，提示其可能靶向非结构蛋白。复制子实验进一步证实，两者在低微摩尔浓度下即可抑制CHIKV RNA复制。在原代正常人真皮成纤维细胞中，这两种化合物同样表现出高效的抗病毒活性及高选择性指数（selectivity index, SI）。
Antiviral breadth of GAP-1173149 or GAP-1146924 against alphaviruses
GAP-1173149可有效抑制CHIKV、O’nyong-nyong病毒（ONNV）及罗斯河病毒（RRV）的复制，并在反式复制酶系统中对东部马脑炎病毒（EEEV）及巴尔马森林病毒（BFV）的RNA复制也有抑制作用。GAP-1146924则对CHIKV、ONNV及Mayaro病毒（MAYV）有效，并在反式复制酶系统中显示出更广谱的抑制活性，包括对西部马脑炎病毒（WEEV）、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）及虫媒特异性Eilat病毒（EILV）的部分抑制。
GAP-1173149 and GAP-1146924 select for mutations in the CHIKV RdRp
在药物压力下连续传代CHIKV，全基因组测序结果显示，GAP-1173149选择的耐药株携带nsP4-A350V突变，而GAP-1146924选择的耐药株主要携带nsP4-Q542L突变。这些突变分别位于nsP4的掌区与拇指区，不同于已知的4′-FlU耐药突变Q192L与C483Y。
The nsP4 mutations specifically confer resistance to GAP-1173149 and GAP-1146924
将耐药突变引入CHIKV感染性克隆证实，nsP4-A350V特异性赋予对GAP-1173149的耐药性，nsP4-Q542L特异性赋予对GAP-1146924的耐药性。竞争实验显示，携带任一突变的病毒在细胞培养中的适应性均低于野生型病毒。
讨论与结论
本研究首次报道了靶向CHIKV nsP4 RdRp的非核苷类小分子抑制剂，并明确了其潜在的结合位点。GAP-1146924与GAP-1173149的化学型及耐药特征提示其为变构抑制剂，这为开发安全性更高的抗甲病毒药物提供了新方向。由于nsP4在不同甲病毒间的序列相似性有限，这类变构抑制剂的广谱活性存在差异，这与其结合口袋的结构保守性一致。研究结果不仅为CHIKV及其他新兴甲病毒的抗病毒治疗奠定了基础，也为深入理解病毒聚合酶的功能与调控机制提供了重要线索。论文发表于《Journal of Virology》。
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