研究人员报道了利用烯还原酶（ene reductase, ERED）催化α-氟代烯酮和α-氟代烯酸酯还原，首次实现了手性烷基氟化物的生物催化不对称合成。该研究表明，多种(Z)或(E)构型的α-氟代烯酮均可被烯还原酶高效高选择性地还原。重要的是，不同几何构型的烯烃底物可导向得到相反构型的手性氟代烷烃对映体。该反应还被成功拓展至α-氟代烯酸酯底物，仅E-烯烃异构体发生还原，从而获得对映体富集的α-氟代酯，这使得烯烃几何异构体混合物也可直接作为底物使用。研究人员通过计算化学底物-酶分子对接研究解释了反应的选择性与底物适用范围。所得对映体富集的烷基氟化物还可通过化学转化进一步衍生化，获得多种功能化合成砌块。
手性氟化化合物在药物化学和农药化学领域具有重要价值，含氟分子约占上市药物的20%，且在研农药中占比更高。氟原子的引入可显著影响分子的代谢稳定性、膜渗透性、脂溶性、pK
a及构象特性，而手性中心连有氟原子的化合物在生物活性分子中相对少见，但其立体选择性合成对调控生物活性具有重要意义。
目前，手性氟化物的对映选择性合成方法主要包括：羰基化合物的亲电氟化、不对称催化合成苄基氟化物、氢键相转移催化氟离子不对称SN2反应，以及使用手性氟化试剂等。直接氟化法虽然最为便捷，但存在放大危险性及消除副反应等问题。另一重要策略为氟代烯烃的不对称还原，但现有方法多需使用昂贵或有毒的过渡金属催化剂。相比之下，生物催化具有条件温和、选择性优异、避免有毒金属和溶剂等优势，但生物催化还原氟代烯烃的研究尚十分有限。此前仅有少数报道，如使用Clostridium kluyveri全细胞系统还原α-氟代巴豆酸（对映选择性未确定）、面包酵母还原氟代肉桂醇（立体选择性中等），以及光酶脱羧法等。
研究人员设想烯还原酶（ERED）可为含羰基氟代烯烃的还原提供普适性策略。ERED是一类含黄素辅酶的酶，可还原被吸电子基团活化的烯烃，通过反式加氢机理催化反应。该酶家族以老黄酶（old yellow enzyme, OYE）为代表，依赖NAD(P)H/黄素辅因子，可催化α,β-不饱和酮、醛、硝基化合物等的还原，但对酯和酸的接受度较低。研究团队此前通过序列功能宏基因组学策略发现了一些可接受空间位阻较大烯酮的ERED。
研究选用在大肠杆菌BL21 (DE3)中异源表达的多种ERED，包括来自Zymomonas mobilis的NCR及先前报道的pQR1445和pQR1907。这些ERED与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）共表达以实现NADH辅酶的原位再生，以D-葡萄糖-6-磷酸钠盐（d-G6PNa）为共底物，直接使用酶裂解液进行反应以降低成本。
催化体系建立与底物拓展研究：初始筛选以(Z)-3-氟-4-苯基-3-丁烯-2-酮（1a）为底物，NCR表现出最高活性，可完全转化1a得到(S)-7a（对映体比er 99:1）。NCR对多种α-氟代烯酮具有广谱适用性，包括含不同电子性质芳基（贫电子、富电子）、不同取代模式、杂芳基及烷基取代的底物，并可形成6元和7元环状氟代酮。对于邻甲苯基和吡啶基等较难接受的底物，通过提高酶浓度或更换酶种（如pQR1445）可改善结果；针对(R)-7e的低选择性，研究人员基于NCR晶体结构（PDB: 4A3U）进行理性设计，将Gly270突变为位阻更大的Tyr（G270Y），显著提高了(R)-选择性（er从67:33提升至90:10），但转化率有所下降，分子对接研究证实了该设计原理。
值得关注的是，(Z)和(E)构型的α-氟代烯酮均可被NCR高效还原，但得到相反构型的产物。例如，(E)-1a得到(R)-7a（收率>99%，k
cat = 1.18 s
-1，总转化数TON = 3950），而(Z)-1a得到(S)-7a。这一特性尤为罕见，因多数ERED难以同时接受两种烯烃几何构型。
关于α-氟代烯酸酯的研究，研究人员发现仅(E)-氟代烯酸酯可被ERED还原得到对映体富集的α-氟代酯，而(Z)-异构体及烷基取代烯酸酯不反应。该选择性在实际应用中极为有利：通过Horner−Wadsworth−Emmons反应制备的(E)/(Z)混合物可直接用于反应，无需分离即可高对映纯度获得产物。多种芳基(E)-烯酸酯被成功还原，其中缺电子底物（如6b→12b，98%收率）比富电子底物（如6c→12c，55%收率）活性更高。
分子对接机理研究：为解释NCR的高活性和优异立体选择性，研究人员对(E)-1a、(Z)-1a及(E)-6a进行了分子对接研究。结果表明，底物以羰基与His172（范德华相互作用，3.69−4.41 Å）和Asn175（氢键，2.91−3.17 Å）配位的模式结合于催化口袋，还原型黄素向烯烃β-碳递氢，Tyr177向α-碳质子化，实现反式还原。(E)-氟代烯酮和(E)-烯酸酯呈"经典"取向，而(Z)-氟代烯酮的烯烃体系相对于黄素辅因子发生"翻转"以保持反式还原几何构型，从而导致相反的立体选择性。这一"翻转"模式与Stewart等人报道的由位阻控制的翻转不同，此处更可能是对(Z)-烯烃几何构型的响应。然而，(Z)-6a的对接构型无法进行有效还原，因为需要氢负和质子从烯烃同侧进攻，这与反式还原机理相悖，从而解释了该底物的不反应性。
氘标记实验与立体化学验证：为验证反式还原机理，研究人员合成了氘代底物(E)-[4-D
1]-1a和(Z)-[4-D
1]-1a进行实验。(E)-[4-D
1]-1a还原得到(3R,4S)-非对映体，而(Z)-[4-D
1]-1a得到(3S,4S)-非对映体，通过
1H、
13C和
19F NMR分析确认，证实了氢负加成和质子化从烯烃相反面进行的反式还原机制，同时也为同位素标记物种提供了立体选择性合成途径。
产物衍生化与应用拓展：研究人员对(R)-7a进行了多种化学转化以获取其他手性氟化砌块。Wittig烯基化得到烯烃13（收率68%），格氏加成得到叔醇14（收率78%），NaBH
4化学还原得到氟代醇15（收率84%，非对映体比dr 3:2）。而使用马肝醇脱氢酶（HLADH）进行酶促还原则表现出优异的立体选择性（dr 99:1），得到(2S,3R)-15。该过程还可与ERED还原串联，直接从(E)-1a一锅法合成(2S,3R)-15（收率31%）。
绿色化学评价：为评估该方法的效率，研究人员选取绿色指标与文献方法比较，包括不对称有机催化合成酮10a（Basch等人）和不对称氢化制备酮7a（Liang等人）。三种指标分别为：E-factor（每克产品产生的废物克数）、过程质量强度PMI（每克产品所需总物料投入）和EcoScale（综合评分，100分为理想过程）。结果显示，生物催化法在E-factor（59）和EcoScale（79）方面表现最优，PMI值（714）较高主要源于大量水作为溶剂，但可通过酶固定化、连续流反应或机械化学方法等进一步优化降低。此外，放大反应产物经液液萃取即可获得纯品，无需硅胶柱纯化，这也是优于其他方法之处。
研究使用的主要关键技术方法包括：序列功能宏基因组学策略筛选ERED；酶与G6PDH在大肠杆菌中的共表达及裂解液制备；Horner−Wadsworth−Emmons反应和TiCl
4介导的羟醛缩合制备(Z)或(E)-氟代烯烃底物；手性HPLC和GC分析对映体纯度和收率；Krapcho脱羧法和Pd催化脱羧法制备光学纯标准品；AutoDock Vina分子对接研究底物-酶相互作用；氘代底物合成及NMR分析验证反式还原机理；一锅法双酶级联反应；以及E-factor、PMI和EcoScale等绿色化学指标评估。
研究结论部分原文翻译如下：总之，研究人员开发了一种通过α-氟代烯酮和α-氟代烯酸酯生物还原制备对映体富集sp
3氟化物的新方法。值得注意的是，该方法以良好至优异的收率和立体选择性获得了多种功能化手性氟化化合物。对于α-氟代烯酮，烯酮的Z和E异构体产生两个对映体产物；对于α-氟代烯酸酯，仅E异构体被酶还原，使得烯烃混合物可直接作为底物使用。观察到的底物行为通过将一系列有反应活性和无反应活性的底物对接到活性位点中得以解释，仅前者能以适合在氟代烯烃单元上进行反式氢负和质子转移的构象结合。
